간접 면역 형광 (IIF) 분석은 전통적으로 인간 혈청에 항핵 항체 (ANA)의 검출에 사용되어왔다. 이 항체의 존재는 전신자가 면역 류마티스 질환 (SARD)의 진단에 도움을 줄 수있다. 이 프로토콜은 효율적으로 정확하게 이러한자가 항체를 검출하기 위해 IIF 기술을 수행하는 방법을 보여줍니다.
ANA 테스트에 류머티스 위치 문의 미국 대학은 ANA 1 선별을위한 황금 표준 방법으로 IIF의 사용을 규정하고있다. IIF는 전문가의 손에 우수한 선별 검사이지만, 처리 및 IIF를 열람하는 기술적 인 어려움은 슬라이드 – 같은 노동 집약적 인 슬라이드 처리, 수동 독서 경험에 대한 필요성, 훈련 기술자 및 어두운 방에서의 사용으로 – IIF 방법을 현대, 자동화 실험실의 워크 플로우에 맞게하기 어렵다.
고품질 ANA 검사 향한 첫 번째와 중요한 단계는주의 슬라이드 처리합니다. 이 절차는 노동 집약적이며, 전체 프로세스의 이해뿐만 아니라, 세부 사항 및 경험에주의가 필요합니다.
슬라이드 판독 어두운 방에서 형광 현미경에 의해 수행되고, 세포주기의 문맥에서, 다양한 패턴에 익숙한 숙련 된 기술자에 의해 수행및 계면과 나누어 세포의 형태. IIF가 제대로이 기술을 수행하는 단계를 이해, SARD의 첫 번째 라인 검사 도구입니다 제공하는 것은 매우 중요합니다.
최근, 디지털 영상 시스템은 IIF 슬라이드의 자동 판독을 위해 개발되었다. 이러한 NOVA보기 자동 형광 현미경으로 이러한 시스템은, 일상 IIF 워크 플로우를 간소화하도록 설계되었습니다. NOVA보기함으로써 해석에서 이미지 수집을 분리, 우물의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장; 이미지는 고해상도의 컴퓨터 모니터에 해석을 볼 수 있습니다. 그것은 나중에 참조 할 수 있도록 이미지를 저장하고 이미지에 형광 강도 데이터를 제공하여 운전자의 해석을 지원합니다. 또한 예비 양수 또는 음수로 결과를 분류하고, 긍정적 인 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 요약하면, 그것은 암실에 대한 필요성을 제거하고, 자동화하고 IIF의 준비 상태를 간소화NG / 해석 워크 플로우. 가장 중요한 것은 독자와 수치 사이의 일관성을 증가시킨다. 또한, 바코드 슬라이드의 사용과, 전송 오류는 샘플 추적하고 긍정적 인 환자 식별을 제공하여 제거된다. 이 증가 된 환자 데이터의 무결성과 안전을 초래한다.
이 동영상의 전체적인 목적은 슬라이드 처리, 일반적인 IIF 패턴의 식별, 및이 기술을 단순화하고 조화 새로운 발전의 도입을 포함 IIF 절차를 보여주는 것이다.
용어 항핵 항체 (ANA)는 DNA, 단백질과 리보 1, 2 등의 세포 핵의 성분과 반응하여자가 항체의 다양성을 설명합니다. HEP-2 세포, 항원의 수백 네이티브 단백질 배열, ANA 1의 검출을위한 이상적인 기판을 제공한다. 인간 혈청에서 ANA의 검출은 결합 조직 질환에 대한 중요한 검사 도구이며, IIF는 ANA 1 테스트를위한 참조 방법이다. 최근 HEP-2 세포에 IIF는 항원 특이적인 면역 및 다중 방법에 약간의 실험실에서 대체되었습니다. 때문에 위음성 결과에 대한 우려와 임상에 대한 투명성의 부족, 류머티스의 미국 대학은 HEP-2 세포를 사용하여 IIF는 ANA 1 심사에 대해 "금 표준"해야한다는 결론을 내렸다 태스크 포스를 형성했다.
때문에 ANA 검사의 주관적인 성격, 간염-2 세포의 품질에결과의 정확하고 자신이보고에 tegral. 유사 분열 세포의 높은 숫자의 존재는, 최적의 세포 형태, 충분한 컨 플루, 관련 항원의 발현이 특히 중요하다. IIF 패턴 인식은 환자의 진단에 도움이되는 중요한 도구 역할을합니다. 다양한 패턴의 의미를 이해하는 것은 임상 및 실험실 직원이 진단을 확인하기위한 적절한 후속 테스트를 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 균질 ANA 패턴 항 dsDNA 또는 염색질 항체의 존재 하에서 발생할 수 있고, 전신 홍반 루푸스 (SLE) 3과 연관 될 수있다. 다른 측면에서, 최근 일반적으로 일상적인 시료의 최대 12 %에서 볼 수있는 소위 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬 (DFS)은, 주로 안티 DFS70 항체와 연관되어 있는지 설명하고있다. 이러한자가 항체는 (다른 질병 특정 ANA없이) 분리에있는 경우는 전신자가 면역 류마티스 질환과 연관되지 않은 <> 4-9 한모금. 안티 DFS70 항체에 대한 이에 확증 시험, 불필요한 반사 테스트를 줄이는 데 도움이 상당한 비용 절감 효과를 제공하고, 환자의 불안을 완화 할 수 있습니다.
IIF는자가 항체를 검출하는 제 선 스크리닝 방법임을 감안할 때, 그것은 사용자가 시약 및 티슈 기질의 선택이 결과에 영향을 미칠 수있는 방법을 이해하는 것이 중요하다. IIF 기술은 본질적으로 주관적이기 때문에, 사용되는 시약이 최고 품질의 결과를 제공하는 것이 중요하다.
이 비디오 프로토콜이 목표는 IIF 법, ANA와 연관된 공통 패턴을 수행하기 위해 필요한 정확한 단계를 사용자에게 익숙하고, 실험실 작업 흐름을 간소화하고 결과를 표준화 할 수있는 새로운 발전을 도입하는 것이다.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그녀의 전문 기술 검토를 위해 IIF 실험과 캐롤 흐너을 수행하기위한 카산드라 브라이언트 감사합니다.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
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