Косвенное иммунофлуоресцентный (IIF) анализы традиционно использовались для обнаружения антинуклеарных антител (АНА) в сыворотке крови человека. Присутствие этих антител может помочь в диагностике системных аутоиммунных ревматических заболеваний (САРД). Этот протокол демонстрирует, как эффективно выполнять технику IIF точно обнаружить эти аутоантитела.
Американский колледж Положении ревматологии по тестированию ANA предусматривает использование IIF в качестве метода золотой стандарт для ANA скрининг 1. Хотя IIF является отличным скрининг-тест в опытных руках, технические трудности обработки и чтения IIF скользит – таких, как трудоемкой обработки слайд, ручного считывания, потребность в опытных, обученных технологов и использование темной комнате – сделать метод IIF трудно вписать в рабочий процесс современных, автоматизированных лабораторий.
Первый и наиболее важный шаг на пути к высококачественной ANA скрининга осторожны обработки слайд. Эта процедура является трудоемкой и требует полного понимания процесса, а также внимание к деталям и опыта.
Презентация считывание выполняется методом флуоресцентной микроскопии в темных комнатах, и делается обученным технологов, которые знакомы с различными узорами, в контексте клеточного циклаи морфология интерфазы и делящихся клеток. При условии, что IIF является первой линией инструмент скрининга для САРД, понимая шаги правильно выполнять эту технику имеет решающее значение.
В последнее время цифровые системы визуализации были разработаны для автоматизированного чтения IIF слайдов. Эти системы, такие как NOVA Посмотреть автоматизированной флуоресцентного микроскопа, предназначены для упрощения рутинной рабочий процесс IIF. NOVA Посмотреть приобретает и сохраняет с высоким разрешением цифровые изображения лунок, тем самым отделяя получение изображений от интерпретации; просмотре изображений интерпретируется на компьютерных мониторах высокого разрешения. Он хранит изображения для использования в будущем и поддерживает интерпретацию оператора, предоставляя флуоресцентные данные интенсивности света на изображениях. Он также предварительно классифицирует результаты как позитивные или негативные, и обеспечивает распознавание образов для положительных образцов. Таким образом, это устраняет необходимость в темной комнате, и автоматизирует и упрощает Readi IIFнг / интерпретация рабочий процесс. Самое главное, что увеличивает согласованность между читателями и чтениях. Кроме того, с использованием штрих слайдов, ошибки транскрипции устраняются путем предоставления образца отслеживаемости и положительной идентификации пациента. Это приводит к увеличению пациента целостности и безопасности данных.
Общая цель этого видео, чтобы продемонстрировать процедуру IIF, включая обработку слайд, выявление общих моделей IIF, и внедрения новых достижений упрощения и согласования эту технику.
Термин антинуклеарных антител (АНА) описывает разнообразные аутоантител, реагирующих с компонентами клеток ядер в том числе ДНК, белков и рибонуклеопротеинов 1, 2. Нер-2 клеток, уроженец массив белка с сотнями антигенов, представляет собой идеальную подложку для обнаружения АНА 1. Обнаружение ANA в сыворотке человека является важным инструментом скрининга для заболеваний соединительной ткани, и IIF является эталонным методом для тестирования ANA 1. Недавно IIF на Нер-2 клеток была заменена в некоторых лабораторий с антиген-специфических иммунологических и мультиплексных методами. Из-за опасений по поводу ложных отрицательных результатов и отсутствия прозрачности для клиницистов, Американский колледж ревматологии сформировали целевую группу, что к выводу, что IIF использованием клеток Нер-2 должен быть "золотым стандартом" для ANA скрининг 1.
Из-за субъективного характера ANA скрининга, качество Нер-2 в клеткахинтегральную к точной и уверенной отчетности о результатах. Присутствие большого количества митотических клеток, оптимальная морфология клеток, достаточное сплошности и экспрессию соответствующих антигенов являются особенно важными. IIF распознавания образов служит в качестве важного инструмента для оказания помощи в диагностике пациентов. Понимание значения различных форм позволяет клиницисты и персонал лаборатории для выполнения соответствующего Последующие испытания, чтобы подтвердить диагноз. Например, однородный образец ANA может происходить в присутствии анти-дцДНК или хроматина антител, и могут быть связаны с системной красной волчанкой (СКВ) 3. С другой стороны, недавно было описано, что так называемые плотные мелкий пестрый рисунок (DFS), что обычно наблюдается в до 12% рутинных проб, в основном были связаны с анти-DFS70 антител. Эти аутоантитела, когда найдено в изоляции (без других конкретных заболеваний АНА) не связаны с системными аутоиммунными ревматическими заболеваниями <вир> 4-9. Таким образом подтверждающее тестирование на анти-DFS70 антител может помочь уменьшить ненужных испытаний рефлекс, предложить значительную экономию средств, и ослабить беспокойство пациента.
Учитывая, что IIF является первым методология линия скрининг для выявления аутоантител, чрезвычайно важно, чтобы пользователь понимает, как выбор реагентов и тканей субстратов может повлиять на результаты. Поскольку методика IIF по своей сути субъективны, важно, чтобы реагенты, используемые обеспечивают самые высокие качественные результаты.
Эта цель этого видео протокола является ознакомление пользователя с правильными шаги, необходимые для выполнения способа IIF, распространенные паттерны, связанные с АНА, и ввести новые достижения, которые могут рационализации лабораторный рабочий процесс и стандартизации результатов.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Cassandra Брайант для проведения эксперимента IIF и Кэрол Buchner для ее экспертной технического обзора.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |