Ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se han utilizado tradicionalmente para la detección de anticuerpos antinucleares (ANA) en el suero humano. La presencia de estos anticuerpos puede ayudar en el diagnóstico de enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (ADRS). Este protocolo se muestra cómo realizar efectivamente la técnica de IFI para detectar con precisión estos autoanticuerpos.
El Colegio Americano de Reumatología declaración de posición sobre las pruebas de ANA estipula el uso de la IFI como el método estándar de oro para ANA proyección 1. Aunque IIF es una excelente prueba de detección en manos expertas, las dificultades técnicas de procesamiento y lectura IIF diapositivas – tales como el procesamiento de mano de obra intensiva de diapositivas, la lectura manual, la necesidad de experiencia, los técnicos capacitados y el uso de la cámara oscura – hacer que el método IIF difícil de encajar en el flujo de trabajo de, laboratorios automatizados modernos.
El primer y crucial paso para la detección de ANA es de alta calidad de procesamiento de diapositivas cuidado. Este procedimiento es laborioso y requiere una comprensión completa del proceso, así como la atención a los detalles y la experiencia.
Slide lectura se realiza mediante microscopía de fluorescencia en habitaciones oscuras, y se lleva a cabo por técnicos capacitados que están familiarizados con los diversos patrones, en el contexto del ciclo celulary la morfología de la interfase y las células en división. Siempre que IIF es la primera herramienta de líneas para la ADRS, la comprensión de los pasos para realizar correctamente esta técnica es fundamental.
Recientemente, los sistemas de imágenes digitales se han desarrollado para la lectura automatizada de diapositivas IIF. Estos sistemas, como el NOVA Ver automatizada fluorescente Microscopio, están diseñados para agilizar el flujo de trabajo de rutina IIF. NOVA Ver adquiere y almacena de alta resolución las imágenes digitales de los pozos, separando de este modo la adquisición de imágenes de la interpretación; imágenes se ven un interpretados en los monitores de ordenador de alta resolución. Almacena imágenes para futuras referencias y apoyan la interpretación del operador, proporcionando datos de intensidad de luz fluorescentes en las imágenes. También clasifica preliminarmente resultados como positivos o negativos, y proporciona el reconocimiento de patrones para las muestras positivas. En resumen, se elimina la necesidad de cuarto oscuro, y automatiza y agiliza el readi IIFng / flujo de trabajo de interpretación. Lo más importante, aumenta la coherencia entre los lectores y las lecturas. Por otra parte, con el uso de diapositivas con códigos de barras, los errores de transcripción se eliminan, proporcionando trazabilidad de las muestras y la identificación positiva del paciente. Esto se traduce en una mayor integridad de los datos y seguridad del paciente.
El objetivo general de este video es para demostrar el procedimiento IIF, incluyendo el procesamiento de diapositivas, la identificación de patrones comunes IIF, y la introducción de nuevos avances para simplificar y armonizar esta técnica.
El término anticuerpos antinucleares (ANA) describe una variedad de autoanticuerpos que reaccionan con constituyentes de los núcleos de células incluyendo ADN, proteínas y ribonucleoproteínas 1, 2. La célula HEp-2, una matriz de proteína nativa con cientos de antígenos, proporciona un sustrato ideal para la detección de ANA 1. La detección de anticuerpos antinucleares en el suero humano es una herramienta de detección importante para enfermedades del tejido conectivo, y IIF es el método de referencia para la prueba ANA 1. Recientemente, IIF en células HEp-2 ha sido sustituido en algunos laboratorios con inmunoensayos específicos de antígenos y métodos múltiplex. Debido a la preocupación por los resultados negativos falsos y la falta de transparencia de los médicos, el Colegio Americano de Reumatología formó un Grupo de Trabajo que concluyó que IIF utilizando células HEp-2 debe ser el "estándar de oro" para la detección de ANA 1.
Debido a la naturaleza subjetiva de la detección de ANA, la calidad de células HEp-2 se encuentra engral de informes precisos y confiado de los resultados. La presencia de un alto número de células mitóticas, la morfología óptima de células, suficiente confluencia, y la expresión de antígenos relevantes son particularmente importantes. IIF reconocimiento de patrones sirve como una herramienta importante para ayudar en el diagnóstico del paciente. Comprender el significado de varios patrones permite a los médicos y personal de laboratorio para llevar a cabo la adecuada prueba de seguimiento para confirmar el diagnóstico. Por ejemplo, el patrón de ANA homogéneo puede ocurrir en la presencia de anticuerpos anti-ADN de doble cadena de la cromatina o, y puede ser asociado con el lupus eritematoso sistémico (LES) 3. Desde el otro lado, recientemente se ha descrito que el llamado patrón denso fino moteado (DFS) que se ve comúnmente en hasta el 12% de las muestras de rutina, sobre todo se ha asociado con anticuerpos anti-DFS70. Estos autoanticuerpos, cuando se encuentran en forma aislada (sin otra ANA específica de la enfermedad) no están asociados con enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas <sup> 4-9. De esta manera la prueba confirmatoria de anticuerpos anti-DFS70 puede ayudar a reducir el reflejo de las pruebas innecesarias, ofrecen un considerable ahorro de costes, y calmar la ansiedad del paciente.
Dado que el IIF es la primera metodología de selección de línea para detectar autoanticuerpos, es primordial que el usuario entiende cómo la selección de los reactivos y sustratos de tejidos puede afectar los resultados. Dado que la técnica IIF es inherentemente subjetiva, es importante que los reactivos utilizados proporcionan los resultados más altos de calidad.
Este objetivo de este protocolo de vídeo es familiarizar al usuario con los pasos correctos necesarios para llevar a cabo el método de IFI, los patrones comunes asociados con ANA, e introducir los nuevos avances que pueden agilizar el flujo de trabajo de laboratorio y estandarizar los resultados.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Cassandra Bryant para realizar el experimento IIF y Carol Buchner por su revisión técnica de expertos.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
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