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Neuroscience

人类神经的聚集体cGMP的适用展开法干细胞和祖细胞来源从多能干细胞或胎儿脑组织

Published: June 15, 2014 doi: 10.3791/51219
Automatic Translation
1, 1, 1
1Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

这个协议描述了一种新颖的机械斩波方法，它允许球形神经干细胞和祖细胞的聚集体的膨胀而不分离为单个细胞悬浮液。维持细胞/细胞接触可超过40代快速稳定增长。

Abstract

一个细胞扩展技术聚敛大量的细胞从单个样本进行实验研究和临床试验，将大大有利于干细胞的社区。目前，很多的扩展方法是费力，成本高，并且涉及完整的解离可能会导致几个干细胞和祖细胞类型来进行分化或提早衰老。为了克服这些问题，我们开发了称为“斩波”，即简单又便宜的自动机械传代方法。该技术避免化学或酶分解成单个细胞，而是允许大规模扩张暂停，即保持恒定的细胞/细胞接触球体的文化。斩波方法主要被用于胎儿脑源性神经祖细胞或神经球，并于最近出版了由胚胎和诱导多能干细胞源性神经干细胞的使用。该过程涉及。ES神经球接种到组织培养培养皿中，并随后通过锋利，无菌刀片通过细胞有效地自动化的手动机械解离每个球的繁琐过程。在培养悬浮细胞提供了有利的表面积与体积之比;如超过500,000个细胞可以在小于0.5毫米的直径的单个神经球生长。在一个T175烧瓶中，超过50万个细胞可以相比，只有15万美元的贴壁培养在悬浮培养生长。重要的是，砍程序已经根据现行良好生产规范（cGMP）的使用，允许大规模量产的临床级细胞产品。

Introduction

还有作为一个单层或1-3总神经球4-7在文化扩张啮齿类动物神经干细胞的悠久历史。此外，从显影中枢神经系统8-17的各区域分离的人神经前体细胞（hNPCs）已在体外扩展。这些细胞是双强有力的，能分化成两个星形胶质细胞和神经元，并已在研究神经发育18,19和疾病机制20,21一种非常有用的工具。 hNPCs也被移植到中枢神经系统疾病的许多不同的动物模型中具有不同集成，存活和功能的影响22-24的水平。

传统上，啮齿动物或人胎儿来源的NPC暴露于生长因子-通常表皮生长因子（EGF）和/或成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）25-28 -和贴壁29和三个维球体系统一般传代使用酶解成单细胞悬液30-34。扩大细胞研究或临床应用的标准方法是为由于易于操作的单层贴壁。然而，我们已经表明，传代单层和神经球hNPCs用酶或化学溶液导致早期衰老35。此外，酶的解离可能导致分化和异常核型的基础上表现出与胚胎干细胞36-38数据水平增加。虽然传代hNPCs的标准方法制作了现行良好生产规范已经进入了第一阶段的临床试验（干细胞公司，Neuralstem公司）（cGMP）的高档产品，该方法只允许几个回合细胞扩增，限制了银行的潜力。

显然，大型科研实验和未来的临床试验可能会从能力中受益繁殖细胞的体积和具有延迟衰老，允许大规模的生长和细胞银行。为了满足这一需求，我们开发了一种新的和机械的完好传代神经球自动化的方式由“砍”成小群，以维持细胞与细胞之间的接触。这种方法大大增加了它们的使用寿命39和悬浮培养允许一个更有效的利用培养箱空间相比单层培养物，观察用一种替代3D生物反应器培养方法40。所提供的斩波协议允许用于生产大型银行从一个胎样品大于通道10，使用标准的传代方法一个不太可能的技艺。虽然这个方法传代hNPCs是标新立异，它是越来越受欢迎，最近，出版了其他类型的细胞，如人类胚胎和诱导多能干细胞源性神经干细胞，从而实现大规模扩张的各种应用，包括v中ITRO疾病模型41-46。重要的是，cGMP的同类HNPC细胞库已经生产的斩波方法，这表明该技术可以对将来的临床应用被应用。

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Protocol

1，道德声明和安全

  1. 此过程涉及使用从人类或动物来源的细胞培养产品。所有派生的组织必须通过适当的机构审查委员会（S）和/或机构动物护理和使用委员会（S）使用前必须获得批准。
  2. 所有的生物危险废物必须按照到时由相应的机构决定的安全法规。了解并遵守所有的贴切安全和处置指导整个过程。

2，准备设备，耗材，试剂，并观察

  1. 准备
    1. 获得玻璃培养皿，8.5厘米滤纸圈和双刃刀片准备。
    2. 将一片滤纸的培养皿中，并在培养皿转数出鞘叶片上的滤纸上。
    3. 重复层滤纸和叶片，直到培养皿大约是75％满，盖机智ħ培养皿盖子和高压灭菌。存储在一个无菌的或封闭的环境中保持无菌。
    4. 高压灭菌18厘米镊子和高温高压灭菌螺母驱动器在灭菌袋。对于cGMP产生，在高压灭菌消毒袋几种不锈钢垫片光盘。有关垫片盘的详细信息，请参阅步骤3.5。
    5. 消毒生物安全柜（BSC），用70％异丙醇（IPA）。
    6. 所有程序都必须在一个BSC执行，以保持无菌。在无菌条件下转移到下面的BSC：
      1. McIlwain组织斩波（斩波器）。擦拭用70％的IPA，尤其是斩波器臂（ 图1B）的所有表面。整个菜刀可以使用环氧乙烷如果需要进行净化。
      2. 一蒸压螺母驱动器或螺母扳手（包括菜刀， 图1I），一个18厘米镊子，一组标准尺寸的微量（20μL-1，000微升），一个pipetaid和管架。
      3. 一次性无菌血清移液管，阻隔枪头，15毫升锥形管，61毫米培养皿，双力准备刀片和适当大小的Ŧ瓶。注意：只有处理好锋利的钳子。
  2. 试剂
    1. 展开由神经干细胞膨胀介质，表皮生长因子在100毫微克/毫升和白血病抑制因子（LIF）在10 ng / ml的hNPCs在维护媒体（MM）。转让给媒体准备到BSC所需的试剂和过滤装置（S）。
    2. 使用神经干细胞扩展培养基，并在100微克/毫升制备等分试样在-80℃下储存最多至1年重新悬浮冻干EGF。 LIF被存储为在4℃下购买长达6个月或由制造商给定的到期日期。
    3. MM转移到试剂平衡计分卡。结合所有的试剂在使用真空装置的适当大小的过滤器和过滤器。储存在4℃下进行长达3周。
    4. HNPC观察
      1. 砍之前解决这两个最重要的因素是球的直径和媒体调理或颜色。条件培养基（CM）定义为已孵化条件下（37℃，5％CO 2，95％湿度）下代谢通过在培养的hNPCs介质。由于细胞代谢媒体酚红成分会从粉红色转为黄色标志着一个更加酸性环境（ 图5D）。
      2. 持有hNPCs的烧瓶（S）到光处理介质颜色（详见讨论）。
      3. 通过将烧瓶扫描用显微镜来观察细胞。使用光罩检查球体的大小。如果许多球体的直径为300微米或更大时，进行斩波处理。砍细胞每隔7-10天。
      4. 如果印章是不值得的，用新鲜的培养基每3-4天取决于如何快速的细胞代谢媒体CM的交换25-75％。精读渣打，交换媒体，直到球足以通道大。
      5. hNPCs通常切碎以1:2的比率，从较小的瓶中，以更大的培养瓶中。使用表1作为参考指南瓶尺寸和体积的建议。
    2 T175s
    长颈瓶 媒体总体积 预印 → 后盖章
    1±12.5 5毫升 1±12.5 → 1 T25
    1 T25 10毫升 1 T25 → 1 T75
    1 T75 20毫升 1 T75 → 1 T175
    1 T175 40毫升 1 T175 → 2 T175s
    80毫升 2 T175s * → 4 T175s
    * 2 T175s的是，可以在同一时间被切碎瓶的最大数目。砍在套2 T175s和参考步骤7。

    表1。HNPC扩张模式 。为hNPCs一个典型的扩张计划说明。这是标准的扩大2倍容积每隔7-10天。

    3，斩波器设置

    图1
    图1。McIlwain组织砍刀。 A）印章的厚度调整千分尺，B），斩波器臂座和连接臂，C），钩上的培养皿，D盘架）表松开旋钮和托盘附带菜刀，J）刃/扣螺母，K）的刀片式表扣，L，E）刀片力控制旋钮，F）的复位开关，G）板夹，H）的螺栓连接的刀片，表扣，螺母， 我）螺母扳手）自动斩波调速旋钮，M）手动砍手臂操作旋钮，N）的电源开关。

    1. 请将菜刀到在BSC的插座，并打开电源开关（ 图1N）上。设置斩波距离为200微米（ 图1A）。刀片力设定为270°或9时，如果旋钮是一个时钟（ 图1E）。确认自动调速旋钮尽量逆时针尽可能旋转。 （ 图1L）。
    2. 移动台释放所有的方式，正确的确认板固定器是稳定的（ 图1D）。
    3. 旋转马努人单臂机械手顺时针手臂提高到最高水平（ 图1M）。手动操作器臂必须只顺时针旋转。
    4. 无菌，双刃斩刀片在无菌条件下转移到使用一对镊子（ 图1H）斩波器臂的螺栓。
    5. 只对cGMP的传代完成这个步骤，因为单独的培养皿是足够的研究级处理。如在步骤2.1.4所指出的，放置在培养皿中碱的内隔片的光盘所需要的cGMP的。垫片盘防止塑料碎片从斩波过程中掺入的领域。对于每个计划的印章，传送一个垫片光盘放入每个培养皿和覆盖的基础。
    6. 在无菌条件下将扣（ 图1K）在使用镊子刀片。卡环的弯曲部分必须在臂的顶部边缘。扣将不会留在手臂上，直到螺母是否牢固塑造。使用镊子举行CLASp到手臂和固定螺母（ 图1J）与上无菌螺母驱动器的螺栓。离开螺母¼转松。

    4，预印章手续

    1. 转让的MM建议量到新烧瓶（S）按表2，C栏 。
    2. 在无菌条件下从培养箱转移细胞进入BSC。精益烧瓶（S）在管架（ 图2A），让球定居在烧瓶中（S）。
    3. 一次结算，吸高达12毫升上清液用5毫升或10毫升血清吸液管和冲洗所有松散粘连球体从烧瓶（次）的表面上。必要时重复和解决漂洗之间的领域。
    4. 根据表2中，D列传输的CM所建议的体积到新烧瓶（次），如果传代两个或更多个T175烧瓶中，见步骤7.1。
    5. 转移所有剩余的CM和领域进入一个新的15 mL锥形管。让球瑟ttle并丢弃用过的瓶数。
    6. 关键步骤 ：慢慢地从15毫升锥形管转移球到60毫米的培养皿或在可行的最低音量垫片盘; 0.1-0.5毫升建议（ 图2B）。保持CM的剩余量，因为它会被用来从盘的后印章漂洗细胞。尽量减少所覆盖的培养皿（ 图2C）的介质和球体的表面积。

    图2
    图2。球准备砍A）精益烧瓶（S）对管架或类似的项目，以解决领域中的烧瓶中。B的角）从锥形管转移球尽可能密集的Petri网这道菜。 三）游泳池，距离锥形管T中的球他的培养皿。 的D中）删除尽可能多的上清液尽可能从汇集球的顶部。 五）传播领域使用了一个塑料移液器一角。 的F侧）轻轻移动球到池的一侧。已移动到池的一侧，以方便取出介质球G）的例子。 高）简明球摊开放在培养皿中，准备砍。 点击这里查看大图。

    1. 接着，将球形需要通过除去在步骤4.6传输在上清液中冷凝。将上清液转移回的15毫升锥形管中的气溶胶屏障尖移液器（ 图2D），避免除去球体。首先，从媒体/细胞池的顶部移除尽可能多的媒体的可能。当它是不可能删除媒体没有球，继续进行下面的步骤。
    <TD>0毫升
    列A B栏 C栏 列D E栏 F栏
    预印瓶大小 → 后盖章瓶（S）大小 MM的建议量转移到新的烧瓶（S）预印章 CM的建议量转移到新的烧瓶（S）预印章球/媒体建议量转移到新的烧瓶（S）后斩最终卷系统初始/瓶
    ±12.5 → T25 5毫升 0毫升 5毫升 10毫升
    T25 → T75 10毫升 10毫升 20毫升
    T75 → T175 20毫升 10毫升 10毫升 40毫升
    1 T175 → 2 T175s 每瓶20毫升每瓶15毫升每瓶5毫升 40毫升
    2 T75s → 4 T175s 每瓶20毫升每瓶17.5毫升每瓶2.5毫升 40毫升

    表2。媒体传输导前/后盖章 。建议卷在砧板过程中使用。

    1. 传播池出使用吸管尖的侧面，以增加表面面积（ 图2E）。
    2. 关键步骤 ：提示培养皿稍稍向您，并使用吸管尖轻轻 SL的侧面IDE中的所有天体的池中（ 图2F，G）的 ​​一侧。
    3. 关键步骤 ：当所有细胞已搬迁， 慢慢地打翻培养皿相反的方向。在这个过程中，单独的介质将流远离球体。传输介质倒流到15毫升锥形管。最小的球去除是可以接受的。
    4. 使用吸管尖的侧面轻轻滑动所有球回培养皿的中心，因此池的直径为0.5-2.4厘米（ 图2H）。重要的是要保持球池浅的深度是很重要的。如果池太深，球体将简单地一边切菜时推。注意：球池的直径不能大于2.5厘米的叶片将接触培养皿的边缘，缺失的细胞。

    5，盖章程序

    1. 转移培养皿上板架（ 图1G），并确保盘下盘保持件的钩子（ 图1C）固定。
    2. 表释放旋钮有缺口的地方将适合的齿轮。使用表释放旋钮，将板固定器向左滑动，以便在叶片是清楚的球体并锁定齿轮（ 图1D）。
    3. 关键的步骤 ：通过旋转手动操作器旋钮（ 图1M）顺时针放下菜刀手臂，直到叶片平坦扣下来到培养皿。用一只手向下压在手臂上安装（ 图1B），同时拧紧螺母与螺母起子。
    4. 按下复位按钮（ 图1F）。稳住培养皿用一只手同时将自动单臂机械手旋钮（ 图1L）顺时针旋转至90°位置，或12点，如果旋钮是一个时钟。注意：不要让手指远离动叶片在任何时候。
    5. 通过球的池完全通过刀片。旋转板固定器90°。
    6. 松开螺栓并重复步骤5.3-5.5。
    7. 在无菌条件下从该板夹持器传送的培养皿上在BSC的工作区。

    6，后斩程序

    1. 素10毫升血清吸管与CM在锥形管从步骤4.6，然后转移1毫升入切碎的领域。轻轻重悬并转移到一个新的15 mL锥形管。避免气泡和重复多次，必要收集切碎的领域。
      提示：尽量减少刮的塑料碎片可能会抬离菜。这是不是如果使用不锈钢垫片光盘关注。当心附着在塑料血清吸管内的细胞。如果发生这种情况，抽吸气泡断续地通过介质中的移液管分离的细胞。
    2. 测量CM的体积和切碎的球体。添加的MM适当体积，以达到表2中所列的量，E栏 。
    3. 磨碎的球体2到3倍，打破了任何松散的融合领域。
    4. 关键步骤 ：分装球悬挂到每个新的烧瓶中。一次只能球体悬液转移到一个烧瓶中，再暂停传输之间的领域。在一个时间等分多瓶导致球在每个烧瓶中的人数不成比例。在各烧瓶内的最终体积应在表2中，F栏等于卷。播种大于2 T175培养瓶时，请参阅步骤7.2。
    5. 与螺母驱动器，然后用无菌镊子将金属盖卸下螺母。用70％的IPA或同等净化适当。注意：只能用一个镊子取出用过的刀片砍，丢弃在一个生物危害锐器容器。
    6. 净化菜刀的所有表面用70％IPA。

    7，工艺变化 - 多瓶

    有传代两个以上的T175s当几个差别。步骤以下S是所引用的步骤的改变。

    1. 参考步骤4.4：
      1. 当传代2 T175s，结合所有的媒体和球成一个T175培养瓶。让球沉降，然后分装CM的适当的音量到每个新的烧瓶中，如表2所列，D列 ，继续执行步骤4.5。
      2. 当传代超过2 T175s，得到一个新的T175烧瓶中，并标记为CM的烧瓶中 。完成步骤7.1.1而是转移到CM的CM烧瓶中 。存储瓶上的平衡计分卡被用来从所有烧瓶收集CM，直到所有的烧瓶被砍伐的一面。那么CM将平均分装到每个新的烧瓶。
    2. 参考步骤6.4 -当斩波同一细胞系多次，转移切碎的球体悬浮到一个新的T75培养瓶中标记球后印章和记录传输量。继续到细胞结合在此每个印鉴后烧瓶中，将烧瓶在恒温箱存放在37℃，5％CO 2，95％湿度。毕竟印章已经完成，分装球体悬浮在批量进入每一个新的烧瓶中。继续执行步骤6.5。

    8，冷冻保存

    下面的协议是低温保存hNPCs。

    1. 解冻细胞冷冻培养基在一个干净的水浴中，在37℃，然后储存在​​冰上。细胞冷冻培养基，可以等分并储存在-80˚C长达6个月。
    2. 通过旋转吸管的开口火焰火抛光的玻璃巴斯德吸管。至少准备两个大的和两个小口径火抛光的移液管（ 图3）。该球会移动由大至小口径吸管离解。
    3. 放置的TrypLE选择在水浴在37℃5分钟。取出并保持室内温度，直到准备使用。


    图3。火抛光的玻璃巴斯德吸管A）握住吸管在火焰和旋转的顶部，以大口径火抛光的玻璃吸管均匀圆形玻璃吸管的边缘B）为例。小口径火抛光的玻璃吸管C）为例。

    1. 在无菌条件下神经球转移到BSC。允许球体由倾斜的烧瓶（次）来解决对一个管架和冲洗烧瓶底部以除去任何松散粘连球体。让球重新定居。
    2. 传输CM的所有但5-10毫升到无菌瓶，并测量总体积。将剩余的球和介质放入锥形管中。
    3. 毕竟细胞相继落户，转让所有，但一个小弯月的CM进瓶和summate的体积UME。
    4. 在无菌条件下转移5-10的温热的TrypLE选择毫升到锥形管中，并重新悬浮细胞沉淀。转移锥形管进入37℃的水浴中15-20分钟。后7.5-10分钟，轻轻摇动锥形管混合。
    5. 使用步骤8.5测量CM体积和准备的MM等体积。合并和过滤50％CM和50％的MM溶液（CM / MM溶液）。
    6. 一个40微米的过滤器无菌转移到50毫升锥形管中。
    7. 当孵育完成后，旋转的15毫升锥形管中，持续15秒，在100×g下。
    8. 小心吸并丢弃的TrypLE选择和任何粘性基质。留下一个小弯月。轻轻加入2 - 4毫升CM / MM稀释剩余的TrypLE选择，而不会干扰颗粒。让任何脱落细胞弃去洗，然后再重新定居。
    9. 加2-5毫升CM / MM溶液在管球。由捣碎最多10倍分离用5毫升的移液管的球体。让未分离的领域解决1-2分钟。转移解离的细胞悬液到40微米的过滤器，以去除完全未解离的集群。
    10. 重复步骤8.12用火抛光大口径玻璃移液管，然后一个小口径的玻璃吸管。
    11. 冲洗过滤器与2-5毫升CM / MM的解决方案。
    12. 混合细胞悬液，取出样品进行可行性分析。
    13. 稀释台盼蓝样品在适当的稀释倍数和计数。使用下面的标准方程来计算平均存活细胞浓度，并计算出总的存活细胞。
      式（1）
    14. 计算细胞冷冻培养基的需要，以重新悬浮细胞以5.0×10 6个细胞/毫升的总体积。 1毫升细胞将被接种到每个离心管。转移到离心管的平衡计分卡。
    15. 离心细胞悬浮液以200×g离心5分钟，在4℃下在15米升锥形管以获得最佳收益。如果在50毫升锥形管用于大规模冷冻下来，增加速度和时间以400×g离心10分钟。
    16. 使用细胞冷冻培养基中于5.0×10 6个细胞/ ml重悬细胞沉淀。等分1毫升细胞悬浮液到每个离心管。为均匀分布，吸6毫升的悬浮液，并等分试样冷冻管5×1毫升传送剩下的1毫升悬浮液中回小区池。重复，直到所有的小瓶已被填补。
    17. 无菌密封所有种子冷冻管，并将它们传送到冰上5-10分钟。
    18. 请使用以下方法之一冷冻保存策略，以保持hNPCs： 异丙醇商会
      1. 填充腔室的所需数量（次）用100％IPA于室温。
      2. 传输从冰的种子冷冻管进入腔室（S）和所述腔室（S）中过夜转移到-80℃的冰箱中。然而在细胞内是稳定的至多一周在-80℃下，有人建议向小瓶翌日转移到长期液氮储存。

      控速冷冻

      1. 上传一个合适的冷冻程序的可控速率冷冻的软件。一个示例方案列于表3。图4展示用于hNPCs一个典型的冷冻曲线。不过，确切的程序会各有不同，每个冷柜型号。标准的整体采样率应接近-1℃/分钟，直至达到-40°C，其中冷冻速度可大幅增加至至少-80℃。
    步 率（℃） 结束温度（°C） 保持（分秒） 触发
    1 </ TD> - - 5分0秒房间
    2 - 1.3 - 5 - 样品
    3 - - 1分0秒房间
    4 - 45 - 58 - 房间
    5 + 10 - 26 - 房间
    6 +3 - 23 - 房间
    7 - 0.8 - 40 - 样品
    8 - 10 - 100 - 房间
    9 - 35 - 160 - 房间

    表3步骤在受控Ř冷冻hNPCs吃了冰箱里。建议的程序，用于在一个受控速率冷冻HNPC冷冻保存。

    图4
    图4。样品冷冻曲线 。典型的冷冻曲线的可控速率冷冻hNPCs。

      1. 转自冰冷冻管与控制率冰柜相关的篮子。一定要加载一个离心管，只有细胞冷冻介质使用的样品温度探头。传送筐放入冷冻室，并放置在试样探头插入探头小瓶中。启动该程序。
      2. 当协议完成后，转移到小瓶长期液氮保存。

    9。解冻过程

    下面的协议是用于解冻低温p保留hNPCs。

    1. 从液氮储存传输冷冻管立即到干冰。注意：瓶可以有裂缝或松动的盖子允许液氮进入瓶中。当从深度冻结条件删除，液体可以煮，立即爆炸的小瓶。取出小瓶时，使用适当的个人防护装备。
    2. 准备所有的试剂和耗材下面的时间提前。一旦解冻过程已经开始，关键是要有效地贯彻。
      1. 转让神经干细胞扩增中的MM，一个15毫升的锥形管，1个2 ml和1个10毫升血清吸管每个离心管到BSC。
      2. 最少9毫升神经干细胞扩增培养基，加入5ml的MM需要为每个小瓶。如果需要更多的准备各媒体。
    3. 只有解冻hNPCs一小瓶的时间。转自干冰冷冻细胞放入干净的37℃水浴中，不断搅拌小瓶中的水洗澡。监视器的音量冰已经熔化。当有一块冰约0.5cm留在小瓶中，并喷用70％异丙醇擦拭，并转移到BSC。
    4. 在离心管中的内容转移到15毫升锥形管2毫升的血清吸管。加入1 ml神经干细胞扩增培养基为空离心管，然后转移8毫升神经干细胞扩增培养基上解冻的细胞在一个缓慢，逐滴的方式，同时轻轻摇晃管。这样做是为了减少渗透休克的风险。
    5. 从离心管转移到漂洗9 ml的细胞悬液。转让锥形管上的冰，然后重复步骤9.4-9.5所有剩余的小瓶。
    6. 离心锥形管中，在200×g离心5分钟，在4℃下在离心，准备根据表4的播种瓶的适当数量。
    ＃小瓶 总播种量（毫升） 长颈瓶
    1 5 ±12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - 瓶组合

    表4。根据冷冻管解冻的数目瓶尺寸 。建议的数量和大小瓶种子hNPCs解冻后。

    1. 重悬，并结合所有试管中的MM根据表4的适当的音量。搅拌均匀，再用于移动计算的可行性的样本。见步骤,8.15-8 .16计数的细节。标准播种范围是160,000-320,000个细胞/ cm 2之间。
    2. 的细胞混合好并分装细胞到烧瓶中。转移至烧瓶中，5％CO 2/37℃C/95％湿度培养箱中培养。通过轻轻地来回摇晃均匀分布的细胞混合瓶中。
    3. 这些细胞会形成在24-48小时球。偶尔细胞将附着在塑料表面形成一个蜂窝状的菌落分布。如果发生这种情况，离开细胞冲洗细胞松前3天，协助在球体形成。每次冲洗1-3天，直到没有贴壁细胞。如果必要的细胞转移到一个新的烧瓶中。
    4. 交换媒体的MM每3-4天25-75％，直到细胞准备砍，一般7-14天解冻后。

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Representative Results

图5
hNPCs冻结在P19的图5。代表性的数据A）投影手机号码，然后解冻，用酶解相比，神经球经斩波方法传代扩大为单层贴壁。 0天表示，当细胞解冻，在P20 B）领域的代表图像的前印章，球后的印章，10X D）色样用来描述在媒体调理程度的cGMP的10倍。 三）代表图像类似的协议。 五）免疫细胞接种1天及染色巢蛋白（红色）表达的解冻P29 hNPCs的。的接种7天后和污迹，解冻P29 hNPCs的Hoechst核计数器染色（蓝色）。F）的免疫细胞化学香港海关GFAP（红色）和β-微管蛋白III（绿色）。 点击这里查看大图。

图5A表示hNPCs解冻P20（第0天），并保持附着于层粘连蛋白包被的组织培养瓶或经由斩波方法传代，非粘附的神经球。贴壁细胞酶分离使用的TrypLE选择每周和70天后（7-10通道）的文化枯萎。与此相反，在解冻通道20，并通过斩波技术扩大了神经球的生长衰老之前，大于40通道。刻（ 图5B）之前典型hNPCs应主要≥300微米的直径。一旦切碎，球体通常驻扎成可变大小的部分，主要是围绕200的直径（ 图5C）微米。重要的是要注意，hNPCs通过做爱扩大g方法保持HNPC标记物的表达，并能同时生产星形胶质细胞和神经元后的分化。迟通道hNPCs解离，镀到层粘连蛋白包被的盖玻片上，为期一天或七天，随后用4％的多聚甲醛。该hNPCs表达祖细胞标志物巢蛋白（Millipore公司，1:1,000）第1天镀hNPCs（图5E），以及分化的神经标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP，1:500）和β-微管蛋白III（1： 2,000）对在七天镀hNPCs（ 图5F），标记为星形胶质细胞和未成熟的神经元，分别。

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Discussion

图6
图6。斩波电路图 。使用机械斩波方法，培养扩大球体干/祖细胞。

关键步骤

斩波扩张模式的概况示于图6。HNPC球的大小是传代神经球之前，观察重要的标准之一。虽然有在球体大小的大方差，球体的至少30％应具有的直径大于300微米。如果球是太小，无法通行，只需更换CM用新鲜的MM（25％-50％），并重新评估后1-4天。当球传代在过小的直径差的扩张速度发生。

HNPC膨胀率也依赖于球体的密度和培养基Conditioning由于分泌的因素47。然而，如果介质被过度代谢和重要的生长因子减少，这些细胞可以获取单元48的核型异常的人口。因此，替换的营养物质和生长因子必须与分泌的营养因子平衡。当播种hNPCs后印章或解冻后，每介质厘米3的神经球的数量是可变的。然而，一般的规则是更大的密度，更快的媒体将条件和较高的膨胀率，只要在需要时介质被交换。使用介质调节色彩频谱（ 图5D），从粉红色的范围时，未代谢，以黄色当媒体已完全代谢。理想的介质颜色对数增长是呈红橙色，＃3的色样。这表示介质中含有足够的营养物质和生长因子，同时保持分泌troph的足够浓度集成电路的因素。媒体不应该调理过去＃4上的色样。另外，当细胞代谢没有媒体迅速（＃1上的色样），该hNPCs将增长慢，需要一个印章每10-20天，而不是每隔7-10天。它增加了培​​养物密度，以提高调节，这将反过来提高膨胀率是重要的。

在斩波过程注意以下关键步骤。确保刀片平行安装菜刀手臂。如果刀片不是平的陪替氏培养皿或垫片圆盘的表面上，许多领域可以不切碎。注意，在步骤4.11中讨论的细胞的扩散。该球必须留在培养皿或刀片的中心联络墙上各个领域被砍伐之前。最后，为了避免在斩波过程干燥hNPCs对于延长的时间周期是重要的。将球体的菜后，砍，用新鲜的媒体充斥他们尽快可能。

作为这种技术需要几件装备，可以有风险培养物的无菌性。鉴于这种风险，适当的无菌技术，必须使用整个程序。对于基础研究水平的生产，抹了所有设备，70％的IPA或同等充足以及可选的紫外线孵育至少15分钟。执行无菌BSC内部的所有步骤。对于cGMP水平的生产中，斩波器必须采用环氧乙烷灭菌所建议的制造商。所有其他用品可购买消毒或高压消毒。

未来的应用

任何基础研究治疗从替补到床边的转变可能是一个挑战。斩波程序是设计时考虑这种转变。该程序已经被用来生产符合cGMP HNPC银行在威斯康辛大学魏斯曼中心生物制造设施。 Ŧ帽子HNPC银行是源自于一个医药级HNPC细胞很多，将被用于新的预研究药物的研究和第一阶段的临床试验，以下联邦药物管理局批准的扩大。有迹象表明，使用此程序扩展其他细胞类型。一个例子是EZ球体，从多能干细胞41产生神经干细胞。这种技术具有用于与其它类型的组织，需要在膨胀过程中恒定的细胞 - 细胞接触的巨大潜力。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

我们感谢Soshana斯文森博士的严格审查及本报告的编辑。这项工作是由NIH / NINDS 1U24NS078370-01和CIRM DR2A-05320做出了贡献。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

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Tags

神经科学，第88期，神经祖细胞，神经前体细胞，神经干细胞，传代，神经球，切菜，干细胞，神经科学，悬浮培养，良好生产规范，GMP

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

人类神经的聚集体cGMP的适用展开法干细胞和祖细胞来源从多能干细胞或胎儿脑组织
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Shelley, B. C., Gowing, G.,… More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

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