Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

doi: 10.3791/51219 Published: June 15, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך מכאנית רומן המאפשרת ההתרחבות של אגרגטים גזע ותאים אב עצביים כדוריים ללא ניתוק להשעית תא בודד. שמירה על קשר תא / תא מאפשרת צמיחה מהירה ויציבה במשך 40 מעברים.

Abstract

טכניקת הרחבת תא לצבור מספר גדול של תאים מדגימה אחת עבור ניסויי מחקר וניסויים קליניים תרוויח הקהילה בתאי גזע באופן משמעותי. שיטות הרחבה הנוכחיות רבות מייגע ויקרות, ואלה הקשורים ניתוק מוחלט עלולים לגרום לכמה סוגי גזע ותאים ובתאים לעבור התמיינות או הזדקנות מוקדמת. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו שיטת passaging מכאנית אוטומטית המכונה "קיצוץ" כי הוא פשוט ולא יקר. טכניקה זו מונעת ניתוק כימי או אנזימטי לתאים בודדים, ובמקום זאת מאפשרת להרחבה בקנה מידה גדולה של תרבויות מושעים, אליפטית, כי לשמור על קשר עם תא / תא קבוע. שיטת הקיצוץ יש בעיקר נעשתה שימוש בתאים עובריים שמקורם במוח עצבי אב או neurospheres, ולאחרונה יצאה לאור לשימוש בתאי גזע עצביים שמקורם בתאי גזע pluripotent עובריים ומושרים. Involv ההליךes זריעת neurospheres על גבי צלחת פטרי תרבית רקמה ולאחר מכן עובר להב חד, סטרילי דרך תאי יעילות אוטומציה של התהליך המייגע של ידני מכאני מתנער בכל תחום. השעיית תאים בתרבית מספקת יחס שטח לנפח חיובי פני השטח; כפי שניתן גדלו מעל 500,000 תאים בתוך neurosphere אחד של פחות מ 0.5 מ"מ קוטר. בבקבוק T175 אחד, מעל 50 מיליון תאים יכולים לגדול בתרבויות השעיה לעומת רק 15 מ'בתרבויות חסיד. חשוב מכך, הליך הקיצוץ נעשה שימוש בפרקטיקת ייצור טוב הנוכחית (cGMP), המאפשר ייצור כמות המוני של מוצרי תא כיתה קלינית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

יש היסטוריה של הרחבת תאי גזע עצביים מכרסמים בתרבות כמו גם monolayer 1-3 או 4-7 neurospheres המצרפי ארוכה. בנוסף, תאים אנושיים ותאים עצביים (hNPCs) מבודדים מאזורים השונים של מערכת העצבים המרכזית מתפתחת 8-17 הורחבו במבחנה. תאים אלה הם דו עוצמה, מסוגל להבדיל לשני האסטרוציטים ונוירונים והיה כלי שימושי מאוד בלימוד התפתחות עצבית 18,19 ו20,21 מנגנון מחלה. hNPCs גם הושתל לתוך מודלים של בעלי חיים רבים ושונים של מחלות מערכת עצבים מרכזיות עם רמות משתנות של אינטגרציה, הישרדות והשפעות פונקציונליות 22-24.

באופן מסורתי, מכרסם או NPCs נגזר עוברי האנושי חשופים לגורמי גדילה - גורם לעתים קרובות אפידרמיס צמיחה (EGF) ו / או גידול פיברובלסטים גורם-2 (FGF-2) 25-28 - ושניהם 29 חסיד ושלושהמערכות אליפטית ממדיות בדרך כלל passaged באמצעות ניתוק האנזימטית לתוך השעיה תא בודד 30-34. השיטה סטנדרטית להרחבת תאים למחקר או לשימוש קליני היא כmonolayer חסיד בשל מניפולציה קלה. עם זאת, יש לנו הראינו כי hNPCs monolayer passaging וneurosphere עם האנזימטית או תמיסות כימיות הביאה להזדקנות המוקדמת 35. בנוסף, דיסוציאציה האנזימטית עלולה לגרום לרמות מוגברות של מומים בידול וkaryotypic מבוססים על נתונים הפגינו עם תאי גזע עובריים 36-38. למרות שהשיטה סטנדרטית של hNPCs passaging הפיקה בפועל ייצור טוב הנוכחיים מוצרי כיתה (cGMP) שהושקעו בשלב 1 בניסויים קליניים (בתאי גזע Inc, Neuralstem Inc), השיטה מותר רק כמה סיבובים של הגברה תא, המגביל את בנקאי פוטנציאלי.

ברור, ניסויי מחקר גדולים וניסויים קליניים בעתיד יכולים להפיק תועלת מהיכולתלהפיץ תאים בכמויות גדולות ועם הזדקנות מתעכבת כדי לאפשר צמיחה בקנה מידה גדולה ובבנקאות סלולרי. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו רומן ודרך אוטומטית של neurospheres שלמות מכאנית passaging ידי "לקצוץ" אותם לקבוצות קטנות כדי לשמור על קשר תא אל התא. בשיטה זו גדלה מאוד תרבות תוחלת החיים 39 והשעיה שלהם מאפשרת שימוש יעיל יותר של שטח חממה בהשוואה לתרבויות monolayer, כפי שניתן לראות בשיטת תרבות bioreactor 3D אלטרנטיבית 40. פרוטוקול הקיצוץ בתנאי מאפשר לייצור של בנקים בקנה מידה גדולה ממדגם העובר אחד גדול יותר ממעבר 10, הישג סביר בשיטות passaging סטנדרטיות. בעוד ששיטה זו לhNPCs passaging היא בלתי שגרתית, הוא גדל ב פופולריות והיה לאחרונה, שפורסם עם סוגי תאים אחרים כגון תאי גזע עצביים שמקורם עוברי אנושי ותאי גזע pluripotent מושרה, המאפשרים התרחבות בקנה מידה גדולה עבור יישומים שונים, כולל בvדוגמנות המחלה itro 41-46. חשוב מכך, בנק תאים בדרגת cGMP hNPC כבר הופק בשיטת החיתוך, הוכחת כי הטכניקה יכולה להיות מיושמת כלפי יישומים קליניים בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הצהרה ובטיחות אתיות

  1. הליך זה כרוך בשימוש במוצרי תרבית תאים שמקורם בבני אדם או בעלי חיים. כל הרקמות נגזרות חייבות לקבל אישור לפני השימוש על ידי דירקטוריון סקירה המוסדית המתאים (ים) ו / או הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (ים).
  2. כל הפסולת הביולוגית מסוכנת חייבת להיות מסולק על פי תקנות בטיחות שהוחלטו על ידי המוסד המתאים. לדעת ולעקוב אחר כל הנחיות הבטיחות וסילוק הולמות בכל הליך זה.

2. הכנת הציוד, חומרי גלם, חומרים כימיים, ותצפיות

  1. הכנה
    1. השג צלחת זכוכית פטרי, עיגולי נייר סינון 8.5 סנטימטר ולהבי הכנה כפול קצה.
    2. מניחים פיסת נייר סינון בצלחת פטרי ולהעביר כמה להבים נשלפו על גבי נייר הסינון בצלחת פטרי.
    3. שוב ושוב שכבת נייר מסנן ולהבים עד לצלחת פטרי הוא בערך 75% מלאים, כיסוי שנינותמיכסה שעות פטרי צלחת וחיטוי. אחסן בסביבה סטרילית או סגור כדי לשמר על סטריליות.
    4. מלקחיים החיטוי 18 סנטימטר ואגוזי נהג autoclavable בכיס עיקור. לייצור cGMP, חיטוי כמה דיסקי פחית נירוסטה בשקיות עיקור. לקבלת מידע נוסף בנוגע לדיסק שהמעונים, ראה שלב 3.5.
    5. לטהר את הקבינט ביו בטיחות (BSC) עם 70% אלכוהול איזופרופיל (IPA).
    6. כל הנהלים חייבים להתבצע בBSC לשמור על סטריליות. סביבה נקיה מחיידקים להעביר את הנתונים הבאים לBSC:
      1. רקמות ופר McIlwain (מסוק). נגב את כל המשטחים עם 70% IPA, במיוחד זרוע המסוק (איור 1). כל המסוק ניתן לחטא באמצעות אתילן אוקסיד במידת צורך.
      2. אחד אגוז נהג autoclaved או אגוז ברגים (כלול במסוק, איור 1I), אחד מלקחיים 18 סנטימטר, סט אחד של micropipettors גודל הסטנדרטי (20 μl-1, 000 μl), pipetaid אחד ו racks צינור.
      3. טפטפות סטרילי הפנויה סרולוגיות, טיפים pipet המכשול, צינורות 15 מיליליטר חרוטי, 60 מ"מ צלחות פטרי, להבי הכנה כפול קצה וצלוחיות T בגודל המתאים. זהירות: מטפל רק בלהבים החדים עם מלקחיים.
  2. ריאגנטים
    1. להרחיב hNPCs בתחזוקת מדיה (MM) בהיקף של גזע עצבי הרחבת תא בינונית, EGF ב100 / מיליליטר ng ולוקמיה מעכבות פקטור (LIF) ב10 ng / ml. להעביר את חומרים כימיים ומכשיר סינון (ים) יידרשו להכין מדיה לתוך BSC.
    2. Re-להשעות EGF lyophilized באמצעות גזע העצבי הרחבת תא בינונית ולהכין aliquots ב100 מיקרוגרם / מיליליטר לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד 1 שנה. LIF מאוחסן כנרכש על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים או עד למועד הפקיעה יינתן על ידי היצרן.
    3. העבר את ריאגנטים MM לBSC. מערבבים את כל חומרים כימיים במכשיר בגודל מתאים סינון וסינון באמצעות מנגנון ואקום. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
    4. תצפיות hNPC
      1. שני גורמים החשובים ביותר לטיפול לפני הקיצוץ הוא בקוטר כדור ואוויר תקשורת או בצבע. מדיה אוויר (CM) מוגדרת כבינוני, כי כבר עובר מטבוליזם על ידי hNPCs בתרבות בתנאי חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 95%). כתאים לעכל תקשורת מרכיב פנול האדום יעבור מורוד לצבע צהוב מסמל סביבת חומצית יותר (איור 5D).
      2. החזק את הבקבוק (ים) של hNPCs מול האור כדי לטפל בצבע התקשורת (ראה דיון לפרטים נוספים).
      3. סריקה באמצעות הבקבוק עם מיקרוסקופ כדי לבחון את התאים. השתמש reticle לבחון גודל כדור. אם יש תחומים רבים בקוטר של 300 מיקרומטר או גדול יותר, להמשיך בתהליך החיתוך. קוצץ את התאים בכל 7-10 ימים.
      4. אם צלע אינו מוצדק, חילופי 25-75% מCM עם תקשורת טרי מדי 3-4 ימים, תלוי כמה מהר חילוף חומרים של תאי התקשורת. קוןtinue להחליף תקשורת עד לתחומים הם גדולים מספיק למעבר.
      5. hNPCs קצוץ בדרך כלל ביחס של 1:2 מצלוחיות קטנות לצלוחיות גדולות יותר. השתמש בטבלת מס '1 כמדריך התייחסות להמלצות גודל בקבוק ונפח.
    2 T175s
    בקבוק נפח תקשורת בסך הכל טרום צ'ופ פוסט קוצצים
    T12.5 1 5 מיליליטר T12.5 1 T25 1
    T25 1 10 מיליליטר T25 1 T75 1
    T75 1 20 מיליליטר T75 1 T175 1
    T175 1 40 מיליליטר T175 1 2 T175s
    80 מיליליטר 2 T175s * 4 T175s
    * 2 T175s הוא המספר המרבי של צלוחיות שניתן קצוץ בכל פעם. קוצץ בסטים של 2 T175s ומתייחסים לשלב 7.

    טבלת 1. הפרדיגמה התרחבות hNPC. תיאור של תכנית הרחבה טיפוסית לhNPCs. זהו תקן להרחבה שני לקפל volumetrically כל 7-10 ימים.

    3. התקנה ופר

    איור 1
    איור 1. פר רקמות McIlwain. א) קוצץ מיקרומטר עובי הסתגלות, בסיס זרוע B) ופר וזרוע מצורף, C) הוק על בעל צלחת לצלחת פטרי, D) ידית שחרור שולחן ומגש, E) ידית שליטת כוח הלהב, F) איפוס מתג, בעל פלייט) G, H קובץ מצורף) בורג ללהב, אבזם ואגוז, אני) ברגים אגוזים כלולים במסוק, J) אגוז להב / אבזם, אבזם להב K), L ) כפתור בקרת מהירות חיתוך אוטומטי, M) מתג הפעלה כפתור הפעלה זרוע חיתוך ידני, N).

    1. חבר את המסוק לשקע בBSC ולהפעיל את מתג ההפעלה (איור 1N). הגדר את מרחק החיתוך ל200 מיקרומטר (איור 1 א). הגדר את כוח הלהב ל270 ° או 9:00 אם הידית הייתה שעון (איור 1E). ודא שידית ההילוכים האוטומטית הוא הסתובב נגד כיוון השעון ככל שניתן. (איור 1 ליטר).
    2. הזז את שחרור השולחן את כל הדרך לצד הימין לאשר את בעל הצלחת הוא יציב (1D איור).
    3. סובב את מאנומניפולטור זרוע אל כיוון השעון כדי להעלות לרמתו המרבית (איור 1M) הזרוע. מניפולטור הזרוע הידני חייב להיות רק בכיוון השעון מסובב.
    4. סביבה נקיה מחיידקים להעביר להב סטרילי, פיפיות לקצוץ על בורג זרוע המסוק באמצעות זוג המלקחיים (איור 1H).
    5. להשלים שלב זה רק לpassaging cGMP, כמו צלחת פטרי בלבד מספיקה לעיבוד ברמת מחקר. כפי שצוין בשלב 2.1.4, דיסקי פחית ממוקמים בתוך בסיס צלחת פטרי נדרשים לcGMP. דיסק הפחית מונע שברי פלסטיק משילוב לתוך התחומים במהלך הליך החיתוך. עבור כל צלע מתוכנן, להעביר דיסק פחית אחת לתוך הבסיס של כל צלחת פטרי וכיסוי.
    6. סביבה נקיה מחיידקים למקם את האבזם (איור 1K) על פני הלהב באמצעות המלקחיים. החלק המעוגל של האבזם חייב להיות מעל הקצה העליון של הזרוע. האבזם לא יישאר בזרוע עד שהאגוז כבר מיושן בצורה מאובטחת. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את clasp על הזרוע ולאבטח את האגוז (איור 1J) על גבי הבורג עם אגוזי נהג סטרילי. השאר את אגוז ¼ להפוך רופף.

    4. נוהל טרום קוצצים

    1. העבר את הנפח של MM הציע לבקבוק החדש (ים) לפי טבלה 2, C עמודה.
    2. סביבה נקיה מחיידקים להעביר את התאים מן החממה לBSC. Lean צפחת (ים) על מדף צינור (איור 2 א) ולאפשר את הכדורים אל להתיישב בבקבוק (ים).
    3. מרגע שהתאקלם, לשאוב עד 12 מיליליטר של supernatant עם 5 מיליליטר או 10 מיליליטר פיפטה סרולוגיות ולשטוף כל תחומי חסיד רופף מפני שטח של צפחת (ים). חזור על פעולה במידת הצורך וליישב את התחומים בין שטיפות.
    4. העבר את הנפח המוצע של CM לתוך הבקבוק החדש (ים) על פי לוח 2, טור ד. אם passaging שתיים או יותר T175 צלוחיות, ראה שלב 7.1.
    5. להעביר את כל CM ותחומים נותר לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. לאפשר את הכדורים אל settle וזורקים את הבקבוק בשימוש (ים).
    6. שלב קריטי: להעביר לאט לאט את התחומים מצינור חרוטי 15 מיליליטר על גבי צלחת פטרי 60 מ"מ או דיסק פחית בנפח הנמוך ביותר האפשרי; 0.1-0.5 מיליליטר מומלץ (איור 2). לשמור על הנפח הנותר של CM כפי שהוא ישמש כדי לשטוף את התאים מההודעה לקצוץ צלחת. נסה למזער את פני השטח מכוסה על ידי התקשורת ותחומים על הצלחת (איור 2 ג).

    איור 2
    איור 2. הכנת כדור לקיצוץ.) Lean צפחת () s נגד מתלה צינור או פריט דומה ליישב את הכדורים בפינה של בקבוק. ב ') מעבירים את הכדורים כמו בצפיפות ככל האפשר מצינור חרוטי לפטרי מנה. C) ברכת הכדורים מצינור חרוטי בtהוא אמצע צלחת פטרי. ד) סר כמו supernatant ככל האפשר מהחלק העליון של ספירות ונקווה. E) מורחים את הכדורים החוצה באמצעות הצד של קצה micropipettor פלסטיק. F) בעדינות להעביר את הכדורים אל צד אחד של הבריכה התחומים. דוגמא G) של תחומים שכבר עברו לצד אחד של הבריכה כדי להקל על הסרת תקשורת. H) תמצית פרושים על צלחת פטרי, מוכנה לקיצוץ. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

    1. בשלב הבא, את התחומים צריכים להיות מרוכזים על ידי הסרת supernatant הועבר מעל בשלב 4.6. מעביר את supernatant בחזרה לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר עם micropipettor שקצה מחסום אירוסול (איור 2 ד), להימנע מההסרה של תחומים. התחל על ידי הסרת כמה שיותר מדיה ככל האפשר מהחלק העליון של בריכת מדיה / תא. כאשר זה לא אפשריכדי להסיר תקשורת בלי כדורים, להמשיך לשלב הבא.
    <td> 0 מיליליטר
    עמודה טור ב ' טור ג' העמודה D עמודת E העמודה F
    גודל בקבוק טרום צ'ופ גודל פוסט קוצצים צפחת (ים) נפח של MM הציע להעביר לבקבוק חדש (ים) מראש לקצוץ נפח מוצע של CM להעביר לבקבוק חדש (ים) מראש לקצוץ נפח מוצע של תחומים / תקשורת להעביר לבקבוק חדש (ים) הודעה צ'ופ נפח סופי זורעים / בקבוק
    T12.5 T25 5 מיליליטר 0 מיליליטר 5 מיליליטר 10 מיליליטר
    T25 T75 10 מיליליטר 10 מיליליטר 20 מיליליטר
    T75 T175 20 מיליליטר 10 מיליליטר 10 מיליליטר 40 מיליליטר
    T175 1 2 T175s 20 מיליליטר לכל בקבוק 15 מיליליטר לכל בקבוק 5 מ"ל לכל בקבוק 40 מיליליטר
    2 T75s 4 T175s 20 מיליליטר לכל בקבוק 17.5 מיליליטר לכל בקבוק 2.5 מיליליטר לכל בקבוק 40 מיליליטר

    טבלה 2. מדריך העברת מדיה לפני / אחרי צ'ופ. כרכים הציעו להשתמש במהלך תהליך החיתוך.

    1. מורחים את הבריכה החוצה באמצעות הצד של קצה pipet להגדיל את שטח פנים (2E איור).
    2. שלב קריטי: עצה בצלחת פטרי מעט לכיוונך ולהשתמש בצד של קצה pipet לsl עדינותIDE כל הכדורים אל צד אחד של הבריכה (איור 2F, G).
    3. שלב קריטי: כאשר כל התאים כבר עברו, להטות לאט את צלחת פטרי לכיוון ההפוך. במהלך התהליך, התקשורת לבד תזרום מהתחומים. להעביר את התקשורת בחזרה לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. הסרת מרחב מינימאלית מקובלת.
    4. השתמש בצד של קצה pipet כדי להחליק את כל התחומים בעדינות חזרה למרכז צלחת פטרי כל כך הבריכה יש קוטר של 0.5-2.4 סנטימטר (איור 2H). זה חשוב כדי לשמור על עומק הרדוד בריכת כדור. אם הבריכה היא עמוקה מדי, הכדורים פשוט יידחקו הצידה בקיצוץ. הערה: הקוטר של בריכת תחום לא יכול להיות גדול מ 2.5 סנטימטר או הלהב ייצור קשר עם הקצוות של צלחת פטרי, חסר התאים.

    5. קוצצים נוהל

    1. מעביר את צלחת פטרי על בעל הצלחת (איור 1G) ולהבטיח את הצלחתמאובטח תחת קרסי בעל צלחת (איור 1 ג).
    2. יש ידית שחרור שולחן חריצים שבו יתאימו להילוך. השתמש בידית שחרור שולחן כדי להחליק את בעל הצלחת בצד השמאל כל כך הלהב ברור של הספירות ונעל להילוך (1D איור).
    3. שלב קריטי: הנמך את זרוע המסוק על ידי סיבוב ידית המדריך למניפולטור (איור 1M) בכיוון השעון עד שהלהב מתנפל שטוח על גבי צלחת פטרי. השתמש ביד אחת כדי ללחוץ כלפי מטה על זרוע ההר (איור 1 ב) תוך הידוק האגוז עם nutdriver.
    4. לחץ על לחצן איפוס פעם אחת (איור 1F). לייצב את צלחת פטרי עם יד אחת בזמן סיבוב ידית מניפולטור הזרוע האוטומטית בכיוון השעון (איור 1 ליטר) לתפקיד 90 ° או 12:00 אם הידית הייתה שעון. זהירות: שמור על אצבעות מן הלהב נע בכל העת.
    5. להעביר את הלהב באופן מלא דרך המאגר של תחומים. סובב את בעל הצלחת90 מעלות.
    6. שחרר את הבורג וחזור על שלב 5.3-5.5.
    7. סביבה נקיה מחיידקים להעביר את צלחת פטרי מבעל הצלחת על מרחב עבודה בBSC.

    6. נוהל פוסט קוצצים

    1. ראש פיפטה 10 מיליליטר סרולוגיות עם CM בצינור חרוטי משלב 4.6 ולאחר מכן להעביר 1 מיליליטר על תחומים הקצוצים. בעדינות מחדש להשעות ולהעביר לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. למנוע בועות וחזור כמה פעמים שיש צורך לאסוף את הכדורים הקצוצים.
      טיפ: מזעור מגרד את המנה שברי פלסטיק עשויים להמריא. זו אינה דאגה אם משתמש בתקליטורים שימסו הפלדה אל חלד. היזהר של תאים מצרפים לחלק הפנימי של פיפטה סרולוגית הפלסטיק. במקרה זה, בועות לשאוב לסירוגין באמצעות תקשורת בפיפטה כדי לנתק את התאים.
    2. מדוד את עוצמת הקול של CM והתחומים קצוצים. הוספת הנפח המתאים של MM כדי להשיג את הנפח המפורטים בטבלה 2, עמודת E.
    3. Triturateתחומי 2-3x כדי לשבור את כל התחומים התמזגו באופן רופף.
    4. שלב קריטי: Aliquot ההשעיה תחום לכל בקבוק חדש. להעביר רק את ההשעיה הכדור לתוך בקבוקון אחד בכל פעם, מחדש להשעות את התחומים בין העברות. Aliquoting צלוחיות מרובות בו זמנית גורם למספר לא פרופורציונאלי של תחומים בכל בקבוק. הנפח הסופי בכל בקבוק צריך להיות שווה לכרכים בטבלה 2, טור F. ראה שלב 7.2 כאשר זריעה גדולה משתי צלוחיות T175.
    5. הסר את האגוזים עם אגוז הנהג ולאחר מכן את הסוגר עם המלקחיים סטריליות. לטהר כראוי עם IPA 70% או שווה ערך. זהירות: הסר את להב קיצוץ בשימוש רק עם מלקחיים וזורקים במכל חד ביו מפגע.
    6. לטהר את כל המשטחים של המסוק עם IPA 70%.

    . 7 וריאציות תהליך - צלוחיות מרובות

    ישנם כמה הבדלים כשpassaging יותר משני T175s. הצעדים להלן שינויים של הצעד בהפניה.

    1. אזכור לשלב 4.4:
      1. כאשר passaging שתי T175s, לשלב את כל אמצעי התקשורת ובתחומים לתוך צלוחיות T175 אחד. לאפשר את הכדורים אל להתיישב ולאחר מכן aliquot הנפח המתאים של CM לכל אחת מהצלוחיות חדשות כאמור בטבלה 2, טור ד. המשך לשלב 4.5.
      2. כאשר passaging גדול יותר משני T175s, לקבל בקבוק T175 חדש ותווית כבקבוק CM. הצעד להשלים 7.1.1 אבל להעביר את CM לתוך בקבוק CM. אחסן את הבקבוק בצד של BSC לשמש כדי לאסוף את CM מכל צלוחיות עד שכל צלוחיות כבר קצוצות. אז CM יהיה aliquoted באותה מידה לכל אחת מהצלוחיות חדשות.
    2. צעד התייחסות 6.4 - כאשר לקצוץ אותו קו התא מספר פעמים, להעביר את ההשעיה תחום הקצוץ לבקבוק T75 חדש תחומים שכותרת ההודעה צ'ופ ולהקליט את הנפח שהועבר. תמשיך לשלב את התאים בזה בקבוקון אחרי כל צלע ולאחסן את הבקבוק בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 95%. אחרי הכל הצלעות כבר הושלמו, aliquot ההשעיה תחום בהיקף לכל בקבוק חדש. המשך לשלב 6.5.

    8. Cryopreservation

    הפרוטוקול הבא מיועד לשימור בהקפאה hNPCs.

    1. להפשיר מדיום הקפאת תא באמבט מים נקי על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לאחסן על קרח. מדיום הקפאת תא ניתן aliquoted ומאוחסן ב -80 C ˚ לתקופה של עד 6 חודשים.
    2. אש pipets פסטר זכוכית פולנית על ידי החלפה של פתיחת pipet בלהבה. להכין לפחות שני גדולים ושני pipets אש המלוטשת שעמם הקטן (איור 3). התחומים יהיו מנותקים על ידי העברה מגדולה לpipets שעמם הקטן.
    3. הנח TrypLE בחר באמבט המים על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר ולשמור בטמפרטורת חדר עד לשימוש.

    her.within-page = "תמיד"> איור 3
    pipets פסטר איור 3. זכוכית אש ליטוש.) החזק את pipet בחלק העליון של הלהבה וספין כדי דוגמא לאופן שווה סביב שולי pipet הזכוכית. ב) pipet אש זכוכית מלוטשת גדול נשא. דוגמא ג') של pipet זכוכית אש מלוטשת בקוטר קטן.

    1. סביבה נקיה מחיידקים להעביר neurospheres לBSC. לאפשר את הכדורים אל להתיישב על ידי נשען צפחת (ים) נגד מתלה צינור ולשטוף את החלק התחתון של הבקבוק כדי להסיר כל תחומי חסיד רופף. לאפשר את הכדורים אל ליישב מחדש.
    2. להעביר את כל אבל 5-10 מיליליטר של CM לתוך בקבוק סטרילי ולמדוד את הנפח הכולל. מניחים את הכדורים ותקשורת שנותרו לתוך צינור חרוטי.
    3. לאחר שכל התאים התיישבו, להעביר את כל אבל המניסקוס קטן של CM לתוך הבקבוק וsummate כרךUme.
    4. העברת הסביבה נקיה מחיידקי 5-10 מיליליטר של בחירת TrypLE חיממה לתוך צינור חרוטי ומחדש להשעות את התא גלולה. העבר את צינור חרוטי לתוך אמבט המים C ° 37 ל15-20 דקות. לאחר 7.5-10 דקות, בעדינות לנער את צינור חרוטי לערבב.
    5. השתמש נמדד CM הנפח מצעד 8.5 ולהכין נפח שווה של MM. לשלב ולסנן את CM 50% ו50% פתרון MM (פתרון CM / MM).
    6. סביבה נקיה מחיידקים להעביר מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.
    7. כאשר הדגירה היא מלאה, לסובב את 15 צינורות חרוטי מיליליטר במשך 15 שניות ב100 x גרם.
    8. בזהירות לשאוב וזורקים בחרו TrypLE וכל מצע וסיבי. עזוב את המניסקוס קטן. בעדינות להוסיף 2 - 4 מיליליטר של CM / MM לדלל TrypLE בחר שנותר ואילו לא להפריע גלולה. תן את כל תאים וחילצה מחדש להתיישב לפני השלכת לשטוף.
    9. להוסיף 2-5 CM מיליליטר / פתרון MM לתחומי הצינור. לנתק את הספירות עם טפטפת 5 מיליליטר ידי triturating מקסימאלי של 10x. בואו האו"םהתחומים ניתק להסתפק 1-2 דקות. מעביר את ההשעיה התא ניתק על גבי מסננת 40 מיקרומטר להסיר אשכולות undissociated באופן מלא.
    10. חזור על שלב 8.12 עם pipet אש מלוטשת גדול נשאו זכוכית ולאחר מכן pipet זכוכית בקוטר קטן.
    11. יש לשטוף את המסננת עם 2-5 מיליליטר של תמיסת CM / MM.
    12. מערבבים את ההשעיה התא ולהסיר דגימות לבדיקת כדאיות.
    13. לדלל את הדגימות עם trypan הכחול בגורם לדילול מתאים ולספור. השתמש במשוואה סטנדרטית שלהלן כדי לחשב את ריכוז תאי קיימא הממוצע ולחשב את תאי קיימא בסך הכל.
      משוואת 1
    14. לחשב את הנפח הכולל של תקשורת הסלולרי הקפאה נדרש מחדש להשעות את התאים ב5.0 x 10 6 תאים / מיליליטר. 1 מיליליטר של תאים יהיה זרע לתוך כל cryovial. העבר את cryovials לתוך BSC.
    15. צנטריפוגה ההשעיה תא XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C ב15 מ 'צינורות חרוטי ליטר לתשואה הטובה ביותר. אם צינורות חרוטי 50 מיליליטר משמשים להקפאה בקנה מידה גדולה למטה, ולהגדיל את שיעור זמן XG 400 10 דקות.
    16. Re-להשעות את התא גלולה באמצעות מדיום הקפאת התא ב5.0 x 10 6 תאים / מיליליטר. Aliquot 1 מיליליטר של השעיה תא לתוך כל cryovial. לחלוקה שווה, לשאוב 6 מיליליטר של ההשעיה וaliquot 5 cryovials x 1 מיליליטר. להעביר 1 מיליליטר הנותר של השעיה חזרה למאגר של תאים. חזור על פעולה עד שכל הבקבוקונים היו מלאים.
    17. הסביבה נקיה מחיידקים לאטום את כל cryovials זרע ולהעביר אותם על גבי קרח למשך 5-10 דקות.
    18. השתמש באחת מהאפשרויות הבאות לאסטרטגיות שימור בהקפאה כדי לשמר את hNPCs: איזופרופיל אלכוהול קאמרי
      1. מלא את המספר הדרוש של תא (ים) עם IPA 100% בטמפרטורת חדר.
      2. העבר את cryovials זרע מקרח לתוך התא (ים) ולהעביר את התא (ים) ל-80 ° C במקפיא למשך לילה. התאים הם יציבים לעד שבוע ב -80 ° C, לעומת זאתהוא הציע להעביר את הבקבוקונים לאחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך ביום שלמחרת.

      מקפיא קצב מבוקר

      1. העלה תכנית הקפאה מתאימה לתוכנה של מקפיא קצב המבוקר. תכנית לדוגמה מופיעה בלוח 3. איור 4 מדגים עקום אופיינית להקפאת hNPCs. עם זאת, התכנית המדויקת תשתנה עבור כל דגם מקפיא. קצב הדגימה הכולל הסטנדרטי צריך להיות קרוב ל -1 מעלות צלזיוס / דקות עד שמגיע -40 ° C, שבו השיעור של הקפאה יכול להיות גדל באופן משמעותי לפחות -80 ° C.
    שלב שיעור (° C) טמפרטורת הסוף (° C) חזק (מזער) הדק
    1 </ Td> - - שניות 0 5 דקות הלשכה
    2 - 1.3 - 5 - מדגם
    3 - - שניות 0 1 דקות הלשכה
    4 - 45 - 58 - הלשכה
    5 + 10 - 26 - הלשכה
    6 + 3 - 23 - הלשכה
    7 - 0.8 - 40 - מדגם
    8 - 10 - 100 - הלשכה
    9 - 35 - 160 - הלשכה

    לוח 3. צעדים להקפאת hNPCs בr מבוקראכלתי במקפיא. תכנית הציעה לשימור בהקפאת hNPC במקפיא קצב מבוקר.

    איור 4
    איור 4. עקומת הקפאה לדוגמא. עקומת הקפאה אופיינית עבור hNPCs במקפיא קצב מבוקר.

      1. העבר את cryovials מקרח לסלים הקשורים למקפיא שיעור שליטה. הקפד לטעון cryovial אחד עם תא ההקפאה רק תקשורת שתשמש לבדיקת טמפרטורת מדגם. העבר את הסלים לתוך תא ההקפאה ולמקם את חללית המדגם לתוך בקבוקון הבדיקה. הפעל את התכנית.
      2. כאשר הפרוטוקול הושלם, להעביר את הבקבוקונים לאחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך.

    9. הפשרת נוהל

    הפרוטוקול הבא הוא עבור p cryogenically ההפשרהhNPCs שמורות.

    1. העבר את cryovials מאחסון חנקן נוזלי באופן מיידי על קרח יבש. זהירות: בקבוקים יכולים להיות סדקים או מכסים רופפים המאפשרים חנקן נוזלי כדי להיכנס לבקבוקון. כאשר הוסרו מתנאי הקפאה עמוקים, הנוזל יכול לרתוח, מתפוצץ הבקבוקון באופן מיידי. השתמש PPE הנכון בעת ​​הסרת הבקבוקונים.
    2. הכן את כל חומרים כימיים והציוד מתחת לפני הזמן. ברגע שהתחיל את תהליך ההפשרה, זה קריטי ללכת עד הסוף ביעילות.
      1. העבר את הגזע עצבי הרחבת תא בינוני, MM, צינור חרוטי 15 מיליליטר, 2 מיליליטר אחד ואחד 10 מיליליטר פיפטה סרולוגיות לכל cryovial לBSC.
      2. מינימום של 9 מיליליטר של גזע עצבי הרחבת תא בינוני ו -5 מיליליטר של MM נדרש לכל בקבוקון. הכן יותר של כל אמצעי תקשורת במידת צורך.
    3. להפשיר רק בקבוקון אחד hNPCs בכל פעם. להעביר את התאים קפואים מקרח יבש לתוך אמבט נקי 37 ° C מים ומערבבים את הבקבוקון באמבט המים באופן רציף. לנטר את עוצמת הקול שלקרח שנמס. כאשר יש חתיכת קרח על 0.5 סנטימטר שמאלה בבקבוקון, לרסס ולנגב עם 70% אלכוהול איזופרופיל ולהעביר לתוך BSC.
    4. העבר את התוכן של cryovial לצינור חרוטי 15 מיליליטר עם טפטפת סרולוגיות 2 מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של גזע עצבי הרחבת תא בינונית לcryovial הריקה ולאחר מכן להעביר 8 מיליליטר של גזע עצבי הרחבת תא בינונית על גבי התאים מופשרים באיטי, שחרר אופן חכם בעת טלטול הצינור בעדינות. הדבר נעשה על מנת להפחית את הסיכון של הלם אוסמוטי.
    5. העבר את השטיפה מcryovial ל9 מיליליטר של השעיה תא. העבר את צינור חרוטי על קרח וחזור על שלבים 9.4-9.5 לכל מבחנות שנותרו.
    6. צנטריפוגה צינורות חרוטי XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C. במהלך צנטריפוגה, להכין את המספר המתאים של צלוחיות לזריעה המבוססות על לוח 4.
    # של בקבוקונים נפח כולל זריעה (מיליליטר) בקבוק
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - שילוב של צלוחיות

    לוח 4. גדלי בקבוק המבוססים על מספר cryovials מופשר. נפח הציע וגודל בקבוק זרע לאחר הפשרת hNPCs.

    1. Re-להשעות ולשלב את כל הצינורות בנפח המתאים של MM מבוסס על לוח 4. מערבבים היטב ומחדשלהעביר את דגימה לספירת כדאיות. ראה צעדים 8.15-8.16 לספירת פרטים. מגוון הזריעה הסטנדרטי הוא בין 160,000-320,000 תאים / 2 סנטימטר.
    2. מערבבים את התאים היטב וaliquot התאים לתוך צלוחיות. העבר את צלוחיות ל5% CO 2/37 ° C/95% חממת לחות. מערבבים את הבקבוק בעדינות על ידי הטלטול קדימה ואחורה כדי לפזר באופן שווה את התאים.
    3. התאים יהוו תחומים בתוך 24-48 שעה. לפעמים התאים ידבק משטח הפלסטיק וליצור הפצת מושבה דמוית חלה דבש. במקרה זה, לעזוב את התאים במשך 3 ימים לפני שטיפת התאים רופפים, בסיוע בהיווצרות כדור. יש לשטוף את כל 1-3 ימים עד שאין תאים חסיד. אם העברה נחוצה תאים לבקבוק חדש.
    4. Exchange 25-75% מהתקשורת עם MM כל 3-4 ימים עד התאים מוכנים לקצוץ, בדרך כלל 7-14 ימים לאחר הפשרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 5
מספרים סלולריים איור 5. נציגי נתונים.) תחזית של hNPCs הקפוא ב p19, ולאחר מכן הפשירו והתרחבו כmonolayer חסיד באמצעות ניתוק האנזימטית בהשוואה לneurospheres passaged באמצעות שיטת החיתוך. יום 0 מייצג כאשר התאים היו מופשרים בp20. ב ') נציג תמונות של תחומים מראש לקצוץ, 10X. C) נציג תמונות של תחומים ההודעה צ'ופ, 10X. ד') דוגמת צבע המשמשת לתיאור היקף אוויר תקשורת בcGMP- Immunocytochemistry פרוטוקולים דומים. ה) של hNPCs p29 מופשר שהיו מצופים ליום 1 ומוכתם עבור nestin (ביטוי אדום). כתם Hoechst דלפק גרעיני (כחול) Immunocytochemistry. F) של hNPCs p29 המופשר שהיו מצופים למשך 7 ימים וכתםאד לGFAP (אדום) וטובולין β-III (ירוק). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5 א מייצג hNPCs מופשר בp20 (יום 0) ושמר על חסיד לצלוחיות תרבית רקמה מצופה laminin או כneurospheres אינה חסיד passaged באמצעות שיטת החיתוך. התאים חסיד היו ניתקו enzymatically באמצעות TrypLE בחרו שבועי וsenesced לאחר 70 ימים (7-10 מעברים) בתרבות. לעומת זאת, neurospheres מופשרת במעבר 20 והרחיבה באמצעות טכניקת החיתוך גדלה ליותר מ -40 מעברים לפני ההזדקנות. hNPCs הטיפוסי לפני הקיצוץ (איור 5) צריך להיות בעיקר ≥ 300 מיקרומטר קוטר. ברגע קצוץ, הכדורים, בדרך כלל, לרבעים למקטעים בגודל variably, בעיקר סביב 200 מיקרומטר קוטר (איור 5 ג). חשוב לציין כי hNPCs מורחב באמצעות Choppinשיטה גרם לשמור על הביטוי של סמני hNPC ויכולה לייצר שני האסטרוציטים ונוירונים הודעה הבידול. hNPCs מעבר המאוחרת ניתק, מצופה על coverslips המצופה laminin לתקופה של אחד או שבעה ימים ולאחר מכן קבוע עם paraformaldehyde 4%. HNPCs להביע nestin סמן תא אב (Millipore, 1:1,000) בhNPCs היום 1 מצופה (איור 5E), כמו גם סמנים עצביים המובחנים חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP, 1:500) וטובולין β-III (1: 2,000) על hNPCs היום מצופה שבע (איור 5F), סמנים להאסטרוציטים ונוירונים לא בשלה, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 6
איור 6. חיתוך סכמטי. הרחבת תאי גזע אליפטית / אב בתרבות בשיטת החיתוך המכני.

שלבים קריטיים

סקירה של הפרדיגמה הרחבת הקיצוץ מוצגת באיור 6. גודל כדור hNPC הוא אחד הקריטריונים החשובים להתבונן לפני passaging neurospheres. למרות שיש שונות גדול בגודל כדור, לפחות 30% מהתחומים צריכים להיות בקוטר גדול יותר מ300 מיקרומטר. אם הכדורים קטנים מדי למעבר, פשוט להחליף את CM עם MM הטרי (25% -50%) ולהעריך מחדש אחרי 1-4 ימים. שיעורי התרחבות עניים להתרחש כאשר הספירות הן passaged בקטן מדי של קוטר.

שיעורי התרחבות hNPC תלויים גם בצפיפות הכדור וג תקשורתonditioning בשל גורמים מופרשים 47. עם זאת, אם התקשורת עוברת מטבוליזם יתר על המידה וגורמי צמיחה חשובות הם פחתו, התאים עשויים לרכוש אוכלוסיית karyotypically חריגה של תאים 48. לכן, חומרים מזינים החלפה וגורמי גדילה חייבים להיות מאוזנת עם גורמים תזונתיים מופרשים. כאשר זריעת hNPCs פוסט קוצצים או הודעה הפשרה, מספר neurospheres לסנטימטר 3 של תקשורת הוא משתנה. עם זאת, הכלל הוא יותר הצפיפות, יותר מהר התקשורת תתנה וגבוהה יותר קצב ההתפשטות, ובלבד שהתקשורת החליפה בעת הצורך. השתמש בספקטרום התקשורתי האוויר בצבע (איור 5D), שנע בין ורוד כשבלתי מטבוליזם, לצהוב כאשר התקשורת כבר חילוף חומרים באופן מלא. צבע מדיה האידיאלי לצמיחת לוגריתמים הוא צבע אדמדם כתום, # 3 בדוגמית הצבע. זה מצביע על התקשורת מכילה חומרים מזינים מספיק וגורמי צמיחה תוך שמירה על ריכוז נאות של troph מופרשגורמי ic. התקשורת לא צריכה להתנות # העבר 4 על דוגמית הצבע. לחלופין, כאשר התאים אינם חילוף החומרים של תקשורת במהירות (# 1 על דוגמית הצבע), hNPCs יגדל לאט יותר ודורש צלע כל ימים 10-20 בניגוד לכל 7-10 ימים. חשוב להגדיל את צפיפות התרבות כדי להגביר את האוויר, אשר בתורו לשפר את שיעורי התרחבות.

במהלך הליך חיתוך לב השלבים הקריטיים הבאים. להבטיח את הלהב מותקן במקביל לזרוע המסוק. אם הלהב אינו שטוח על פני השטח של צלחת פטרי או דיסק שמעונים, תחומים רבים עשויים שלא להיות קצוצים. שים לב להתפשטות של תאים שנדונו בשלב 4.11. הכדורים חייבים להישאר במרכז של צלחת פטרי או את הלהב ייצור קשר עם הקיר לפני כל התחומים כבר קצוצים. לבסוף, חשוב כדי למנוע התייבשות hNPCs לתקופה ממושכת של זמן בתהליך הקיצוץ. לאחר הצבת כדורים בצלחת, לקצוץ ולהציף אותם עם תקשורת טרי בהקדםאפשרי.

כטכניקה זו דורשת כמה חתיכות של ציוד, לא יכול להיות סיכונים לסטריליות של התרבות. בהתחשב בסיכון זה, בטכניקה סטרילית נכונה חייבת להיות בשימוש לאורך כל ההליך. לייצור בסיסי ברמת מחקר, מנגב את כל הציוד עם IPA 70% או שווה ערך מספיק יחד עם דגירה סגולה אופציונלית עבור מינימום של 15 דקות. לבצע את כל הפעולות פנימיים של BSC סטרילי. לייצור ברמת cGMP, המסוק חייב להיות מעוקר עם אתילן אוקסיד כפי שהוצע על ידי היצרן. ניתן לרכוש את כל האספקה ​​אחרת סטרילי או autoclaved.

יישומים עתידיים

המעבר של כל טיפול מחקר בסיסי מהספסל אל המיטה יכול להיות אתגר. הליך הקיצוץ נועד עם המעבר הזה בראש. ההליך כבר נעשה שימוש כדי לייצר בנק hNPC cGMP תואם במתקן הייצור ביו אוניברסיטת ויסקונסין וייסמן המרכז. Tבנק hNPC הכובע היה מקור להרחבת הרבה תא hNPC תרופות כיתה שישמש למחקרים חדשים טרום investigational תרופה וניסוי קליני שלב 1 לאחר אישור מנהל תרופות פדרלי. ישנם סוגי תאים אחרים העושים שימוש בהליך זה להתרחבות. למשל הם תחומים EZ, תאי גזע עצביים שנוצרו מתאי גזע pluripotent 41. טכניקה זו יש פוטנציאל גדול לשימוש בסוגים אחרים של רקמות שדורשים קשר תא אל תא קבוע במהלך התרחבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר Soshana סוונדסן לביקורת ועריכת דוח זה קריטי. עבודה זו תרמה לעל ידי NIH / NINDS 1U24NS078370-01 וCIRM DR2A-05,320.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45, (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter