En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones
Summary
Este informe describe una técnica sencilla y rápida de la aguja de punción intratecal para una transfección localizada de siRNA en la médula espinal lumbar de ratón bajo anestesia de corta luz duradera.
Abstract
En este informe se describe una guía paso a paso a la técnica de inyecciones intratecales agujas agudas de una manera no invasiva, es decir, independiente de la implantación del catéter. La limitación técnica de esta técnica quirúrgica se encuentra en la finura de las manos. La inyección es rápida, sobre todo para un investigador entrenado, y dado que la interrupción del tejido con esta técnica es mínima, las inyecciones repetidas son posibles; reacción además inmune a las herramientas de extranjeros (por ej. Catéter) no ocurre, dando así una mejor y más específica leer en voz de la modulación de la médula espinal. Dado que la aplicación de la sustancia se limita en gran parte a la región diana de la médula espinal, los fármacos no necesitan ser aplicado en grandes dosis, y efectos más importante no deseados en otro tejido, como se observa con un suministro sistémico, pueden ser eludidas 1, 2. Además, combinamos esta técnica con la transfección in vivo de ácido nucleico con la ayuda de polyethylenimINE (PEI) de reactivo 3, que proporciona una gran versatilidad para el estudio de funciones de la médula a través de la administración de agentes farmacológicos, así como de genes, ARN, y moduladores de proteínas.
Introduction
La médula espinal es un centro muy importante en una variedad de procesos biológicos fundamentales y funciones fisiológicas, incluyendo el procesamiento y la transmisión de entradas dolorosas (nociceptivo) 4-7. Diversas técnicas experimentales se han desarrollado para facilitar la modulación farmacológica de la médula espinal, tales como la implantación crónica de catéteres intratecales 8, la microinyección de la médula espinal, intratecal y la aguja de inyección 9. Cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas, y dependiendo del paradigma experimento Una técnica podría ser más adecuado que los otros. Considerando que la implantación crónica de los catéteres intratecales es fácilmente factible en la rata, este método es muy difícil en el ratón, dadas las restricciones de tamaño. El índice de éxito es muy baja y el déficit motor a menudo se producen debido a la presencia voluminosa de un catéter en el espacio subdural severamente limitado en el ratón. Además, la administración a largo plazo de medicamentos se hace debido a la coagulación frecuentesde implantado crónicamente catéteres. Finalmente, las reacciones inmunes son comunes.
Estos problemas pueden ser evitados utilizando el método de la inyección intratecal aguda a través de una aguja en la ausencia de un catéter preimplanted, que permite una aplicación rápida y anatómicamente limitado de medicamentos y reactivos a la médula espinal en ratones. Este método mantiene plenamente los beneficios de la entrega intratecal sobre otras rutas de administración sistémica (por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, etc) tales como especificidad de la modulación espinal, que permite la reducción de las dosis y los efectos secundarios límite, así como la capacidad para entregar sustancias no hacen normalmente no atraviesan la barrera hematoencefálica ya que durante la inyección intratecal, se inserta la aguja entre la duramadre y la médula espinal. Es importante destacar sin embargo, en comparación con otros métodos de entrega intratecal, el método de inyección de aguja intratecal es el menos invasivo, lo que permite numerosas aplicaciones en lamismo animal sin causar ningún daño tisular considerable o evocando reacción inmune debido a la implantación de material extraño. Sin embargo, requiere habilidades técnicas para una orientación muy precisa de la aguja para permitir la eficacia.
Este sentido, demostrar visualmente el método para alcanzar una tasa óptima de éxito para la orientación específica de la médula espinal lumbar. El sitio de la inyección que se elige en este experimento es el surco entre L5 y L6 columna de vertebrados, cerca de donde termina la médula espinal, para reducir al mínimo la posibilidad de dañar la columna vertebral. Por otra parte, se demuestra el uso de esta técnica para derribar los genes en la médula espinal utilizando siRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Por lo tanto, la técnica de inyecciones intratecales de aguja anteriormente descrito es eficaz, rápido, específicamente localizada-, y no destructiva. Técnicamente, el aspecto más crítico de este procedimiento es el punto de inserción de la aguja en el surco. Es crucial que este procedimiento se realiza con las manos muy tranquilas y paciencia. Como muchos procedimientos quirúrgicos, la formación mejora la tasa de éxito de la inyección. Esto también es importante porque durante un experimento real, esta téc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
References
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