Summary
本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。
Abstract
細胞および発生生物学のモデルとしてショウジョウバエの長年の使用によりツールの配列が得られている。一緒に、これらの技術は、方法論的な様々な角度からの細胞と発生生物学の分析を可能にした。ライブイメージングは、細胞分裂または細胞運動性などの動的な細胞プロセスを観察するための新たな方法である。特徴付けられていない推定上の細胞周期タンパク質に変異を有する単離された、ライブイメージングを用いてその場で有糸分裂を観察することが必須となった。 ショウジョウバエで最もライブイメージング研究は、それらのサイズが小さく、光学的透明性の操作や観察にアクセス可能な胚の段階に焦点を当てている。それはギャップ相の一方または両方を欠くという点でしかし、これらの段階において細胞周期は珍しい。対照的に、 ショウジョウバエの蛹の翼の細胞は、典型的な細胞周期を有し、蛹開発の約20時間に及ぶ急速な有糸分裂の周期を経る。それは私には簡単ですdentifyとその場で有糸分裂をキャッチし、適切なステージの蛹を分離します。そのまま蛹をマウントする実験は、細胞や動物の生存能力への影響を最小限に抑えながら、数時間のために実行できるように、撮像中に扱いやすと耐久性の最適な組み合わせを提供した。この方法は、小さな、あるいはより小さな、染色体を飛ぶような特徴を観察することができます。顕微鏡の設定や隣接するセルや、チューブリンなどの蛍光標識されたタンパク質の膜動態を可視化するための準備の設置、許可された拡張機能の詳細を調整する。この方法は、すべてのテストされた蛍光タンパク質のために働くと時間スケールの様々な経由でサブミクロンスケールの特徴を捉えることができます。従来の共焦点顕微鏡で蛹の外側を20μmに限定しながら、 生体内での蛹の組織で、タンパク質や細胞動態を観察するためのこのアプローチは、これらの組織中の細胞および発生生物学の研究に一般的に有用である可能性がある。
Introduction
酢のフライ、 キイロショウジョウバエは 、生物学の多くの側面を研究するための十分に確立されたモデルである。 ショウジョウバエの研究は表情、ノックダウン突然変異を含む遺伝子操作の洗練されたフォームを可能にする遺伝的な実験の豊かな歴史を持っています。蛍光タンパク質標識の出現により、このレパートリーは動物生体内の細胞およびタンパク質の研究を含むように拡大している。ハエ胚は、 生体内で 1-3 の深い、高分解能イメージングを可能に小さく、光学的に透明であるように、このような研究のための優れたシステムです。ハエの発達の他の段階はanaesthetization 4、切開および短期培養5,6、又は7,8イメージングのためのクチクラにおけるウィンドウの作成 を必要とする、より少なく扱いやすいことが証明されている。これらの操作は、通常、長期的には、動物の発達を損なうか、短時間に画像を制限する方法で動物に影響を与える。
ほとんどの胚細胞サイクルが切り捨てられているので、細胞周期調節因子に似ている遺伝子における新規の変異を研究するENT ">、それが細胞周期のタイミングと忠実度を研究するための適切な準備を見つけることが不可欠であった（SMまたはS-G2-M）と研究対象の変異体は後の段階までの欠陥を示していない、それは蛹組織における細胞周期を観察することが重要だった。蛹の上皮細胞は、この段階でのより一般的なG1-S-G2-M細胞周期や蛹を持っている筋肉の動き9できない。操作のための最初の出発点はHistone2AV-GFPを発現する完全な全体蛹が含まれていました。蛹ケースの見かけの不透明度にもかかわらず、この完全な準備がin vivoイメージングの長期のための優秀なことが証明された。この手法は単純である学部の研究者が日常的にショウジョウバエの細胞と発生生物学の側面を研究するためにそれを使用して、まだ解決は、マイクロメートルスケールの特徴の識別を可能にするために十分な罰金であることを十分に。この方法では、時間、分、秒を超える事象の観察は、単に時系列パラメータを調整することによって可能である。青色、緑色、黄色、橙色、および赤色蛍光タンパク質、又はこれらの組み合わせを用いて動画を、なされている。重要なことに、もし注意があっても、長期的画像化は、動物の発症または生存率には影響がなく、レーザ強度を最小化するために取られる。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。作業を飛ばす
- 室温10で、標準的なコーンミール寒天·糖蜜·酵母媒体上のハエを維持する。
- 十字架は、羽化の6時間以内で処女を分離します。希望の遺伝子型の男性に横切った後、変更は3〜4日ごとに新しいバイアルに飛ぶ。
注：これらの実験では、Gal4の線A9がウィングに導入遺伝子の発現を駆動するために使用した。フライ株はブルーミントンストックセンターから入手することができます。これらの実験で使用した株はA9-GAL4（のBL＃8761）、His2Av-GFP（のBL＃5941）、SCO / CYO HsCre（のBL＃1092）、UAS-ChRFP-タブ（のBL＃25773）、lollibow 11が含まれています。
2。蛹の選択と取り付け
- ステージ蛹のどちらか白prepupae（WPP）としてそれらを収集し、それらが適切な年齢に達するまで、25℃でそれらを維持するか、形態学的基準12を使用します。
- 細胞分裂、最近のヘッド外転を受けたセレクト蛹を観察する。この時点からわずか羽化直前まで（> 96時間の時点で）、蛹は不動長時間タイムラプス観察を許可している。
- 最初の水は絵筆にドラッグつついそっとして接着剤を緩めて、できるように分を待って、水で湿らせた絵筆でタッチしてバイアルから蛹を削除します。
- 優しく唾液腺接着剤、食品粒子を除去し、水に絵筆でそれらをつついで選択された蛹を洗う。
- カバースリップ底（番号1.5カバーグラス）で25ミリメートルペトリ皿にきれいな蛹を転送します。
- 目的の組織をカバーガラスに最も近くなるようサポートなどの粘土や歯科用ワックスのどちらかの薄いストリップを使用して、蛹をマウントします。
注意：ここに記載された研究では、蛹の翼、脚、腹部histoblastsまたは背側胸背板が観察されている。実際には、蛹のケースの表面の20ミクロン内の任意の組織が観察される。 - オリエント蛹慎重になるようTISSU関心のあるeは、カバーガラス表面に平行である。
- 蛹がマウントされると、蛹とカバーガラスの間の空間にチオジエチレングリコール（TDG）の薄層を転送するために絵筆を使用しています。
注：TDGは、表面散乱を低減するオイルの屈折率と一致し、酸素が 組織13に浸透することを可能にする。それらが細胞の挙動を迅速に停止を引き起こし、酸素の組織を奪う傾向があるので、油の使用は、お勧めしません。
3。イメージング
注：画像は、共焦点顕微鏡は、共焦点性が蛹ケースの強烈な照明によって生じる隠蔽の背景のほとんどが削除された必須である可能性が高い。
- 蛹の開発と生存率に照明の影響を最小限に抑えるために、共焦点の設定を調整します。そのためには、励起の強度と収集の感度のバランスを取る。イメージングWIの一般的な設定ライカSP5番目の120μmの共振スキャナ（8,000 Hz）で、2％（20％の電力の10％の透過率）に設定されたレーザパワー、ピンホールのセットを使用し、ラインが8に設定されアベレージ。設定は、実験条件に依存して変化する。
注：これらは、焦点深度を制限するのに細かいスケールを解決するには40Xと63X油浸レンズ（0.1ミリメートル作動距離）を備えています、また成功し、この方法で使用されてきた。
4。分析
フレームを分析するために、Zスタックや映画は、見ての測定、およびプレゼンテーション14用のファイルを修正するための効果的なツールを持っているフィジー、にデータファイルをインポートします。例えば、有糸分裂を完了する時間は、前期から終期までの細胞を見ながらフレームをステップサンプリング間隔および多次元画像ブラウザを使用して測定した。 x軸、y軸、およびz寸法は、測定ツールを用いて測定することができる。ソフトウェアとその使用方法の詳細は、参照：http://fiji.sc/Fijiを。
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Representative Results
このような現像ショウジョウバエの眼、又は現像脊椎動物の中枢神経系の心室層として多列上皮における細胞は、核の運動を起こす、細胞周期に合わせて、interkinetic核移行と呼ばれる。核が基底面またはその近くで、核は頂端面15,16に達したとき、細胞が有糸分裂を入力すると、DNAの複製が発生します。蛹の翼細胞は頭部外転後の最初の数時間の間に急速に分裂する単層上皮を形成している。データは、1分間隔で切片ごとに2ミクロンを考慮して、初期の蛹サイドからxyztモードで収集した。結果の3D映画の有糸分裂にのみ頂端面（ 図1A）で見られた。より多くの基底の場所で撮影されたセクションでは、（ 図1B）は、有糸分裂の兆候を示さなかったが、新たに分割核を頂端面から返された核の動きが発生しました。
図1。核が分裂する上皮の上部に移動。代表的な切片をHis2AvGFPを表現する野生型ショウジョウバエの蛹の翼のxyzt共焦点画像から。一番上の切片（A）における核が細胞周期の異なる段階で見ることができる。終期中の核（矢印）があるように中期の核（矢印）は、この顕微鏡写真に豊富に存在する。 DNA複製の状態を示す核径にばらつきがあるものの部（B）の下側の面において、有糸分裂の証拠は明らかではない。バーは10μmをスケーリングします。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
、指標を可視化し、分裂細胞の特徴を定量化するために、His2AvGFP発現している細胞の共焦点解析により、ショウジョウバエの生活蛹の翼で有糸分裂を観察するための簡単な準備の開発を必要とした。このメソッドは、蛹の翅における細胞周期は、彼らが有糸分裂に入る上皮の頂端面への核の移行に多列上皮で細胞周期に強い類似性を有することを文書化するために使用された。終期に続いて、核が上皮層に戻ってドロップします。したがって、この単層の細胞、どうやら無成層の上皮は、限られたinterkinetic核移行を示している。
ショウジョウバエ 11にbrainbow 17型ライブイメージング用に作成した公的に利用可能な株式やラインの画像化は、この技術が他の生物学的現象の研究に一般化であることを実証した。ここで説明する技術は、見よの製造に使用した分〜10時間の範囲の時間の上のOS。ある程度、顕微鏡のパラメータは、実験によって異なります。例えば、タイムラプスイメージングのサンプリングレートは、観察中の生物学的現象の性質に準拠する必要があります。画像のスタックを収集し、一般的に終期する前期から約12分かかり細胞分裂を観察するための毎分が適切です。同じ細胞における糸状仮足の挙動を観察するために、セクションまたはスタックは、より細かい（3秒）間隔で収集されなければならない。
記載した条件下で、eclosing成虫の生存または形態に何ら影響にかかわらず、観察期間の観察されなかった。蛍光マーカーは、少量である場合には、レーザパワーは、典型的には増加した。これらの状況では、映画の持続時間を短くしたり、セクションまたはz-スタック、最小化され、露光の数を減らす。他の実験のためのコントロールで、5分間、最大強度に組織を露出させるには効果的ではなかった成人の形態または生存上のT。可視化は、種々の異なるタンパク質にタグ付けされ、赤、緑、黄、オレンジ、青色蛍光タンパク質を含むように拡張さ膜に局在し、および/または細胞質を充填した。サブミクロン範囲の特徴は、時間の秒の時間スケールにわたって観察した。この方法は、（準備中）野生型および変異体における有糸分裂のタイミングと忠実度を観察し、測定するために広く使用されてきた。
ショウジョウバエの発生の蛹は、成人のフォームは幼虫の体の足場に発達しながら、幼虫の形を実質的に排除された顕著な可塑性の期間である。豊かな歴史にもかかわらず、変態の研究は、方法論的に妨げられてきた。たとえば、変態の基礎をなす過程を研究するために直接観察の使用は改造中の細胞や組織へのin vivoでのアクセスにも安心の不足によって制限されていた。驚くほどここで紹介する簡単な方法は、 ショウジョウバエの開発のこの不可解な時期にアクセスすることができます。アプローチは、学部生が簡単に習得して使用できることを十分に単純で、組織、細胞および細胞内組織の観察を可能にするのに十分堅牢である。これらの実験に用い顕微鏡は、深部組織のイメージングのために最適化されておらず、したがって我々の観察は、主に蛹の外周を20μmに制限される。このような多光子顕微鏡法のようなより深い組織浸透を可能にする技術が、イメージングのはるかに大きな深さを可能にし、変態の基礎となる内部構造の再構成の研究を可能にする可能性がある。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、知的支援、物質的な支援、および株式のために明千葉を認識したい。コメントのジュリアDallmanに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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