Summary
순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다.
Abstract
암 관련 사망의 대다수는 전이성 질환의 발달 이후 발생한다. 이 높은 치명적인 질병 단계는 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재와 연결되어 있습니다. 이 희귀 한 세포는 전이성 유방암, 전립선 암, 대장 암의 임상 적 의미의 것으로 입증되었다. 임상 CTC 탐지 및 열거 형의 현재 금 표준은 FDA의 허가 CellSearch 시스템 (CSS)입니다. 이 원고는 표준이 플랫폼에 의해 사용 프로토콜 등을 설명 표준을 사용하여, 환자의 CTCs 단백질 특성 분석을위한 사용자 정의 마커 최적화 및 혈액의 매우 낮은 볼륨에서 CTC 캡처를위한 동급 프로토콜의 자세한 과정을 설명하는 두 개의 추가 적응 프로토콜 CSS 시약, 전이의 생체 내 전임상 마우스 모델에서 공부하십시오. 또한, 건강한 기증자의 혈액 사이의 CTC 품질의 차이는 환자의 혈액 SAMP 대 조직 배양에서의 세포와 스파이크레는 강조 표시됩니다. 마지막으로, CTC의 오 분류 오류가 발생할 수있는 몇 가지 일반적으로 불일치 항목이 설명되어 있습니다. 이와 함께,이 프로토콜은 전이와의 CTCs에 관한 전임상 및 임상 연구에 관심이 플랫폼의 사용자를위한 유용한 리소스를 제공 할 것입니다.
Introduction
2013 년에 그것은 580,350 개인이 암으로 사망 할 것으로 추정되고,이 질병의 1,660,290 새로운 사건이 혼자 1 미국에서 진단을 것입니다. 이 죽음의 대다수는 전이성 질환이 개발 이후 발생한다. 전이 및 전이성 폭포의 제한된 이해를 치료에 효과적인 치료의 현재 부족은 질병의이 단계가 매우 치명적 있습니다. 혈액 내 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재는 전이성 질환 3와 상관 관계가 입증되었다. 이 세포는 매우 희귀하고 자신의 검출은 전이성 유방암 4, 전립선 암 5 년 생존율을 나타내는이며, 대장 암 6. 적은 수를 가진 환자 또는 샘 없음 감지 CTCs를 비교할 때 이러한 환자에서의 존재는 ≥ 5 (유방암과 전립선) 또는 혈액의 7.5 ML에서 ≥ 3 (대장)의 CTCs는 가난한 예후를 나타낸다전자 혈액량. 또한, 치료 적 개입 동안이나 후에 CTC 번호의 변화는 종종 빨리 현재 활용 기술보다 7-10, 치료 반응의 예측으로 유용한 것으로 입증되었다.
그것은 전이성 암 환자에서의 CTCs 10 5 -10 7 혈액 단핵 세포 당 약 1 CTC의 주파수에서 발생하고 지역화 된 질병을 가진 환자에서,이 주파수 (1 ~ 8 10 ~) 더 낮은있을 수 있습니다 것으로 추정하고있다. 이러한 세포의 희귀 한 자연 어려운 정확하고 신뢰성의 CTCs (11)를 감지하고 분석 할 수 있습니다. 여러 가지 방법 (이전에 12 ~ 14 리뷰) 혈액 성분을 주변에서 그들을 차별화하는 특성을 이용하여이 세포를 풍부하게하고 감지하기 위해 사용되었다. 일반적으로, CTC 열거 형은 농축 단계와 탐지 단계를 모두 필요로하는 과정은 두 단계로 이루어집니다. 전통적으로 농축 단계 인 phys의 차이에 의존의 CTCs (셀 크기, 밀도, 변형성) 또는 단백질 마커의 발현에 (즉, 상피 세포 접착 분자 [EpCAM] 아세포 [CK])의 iCal의 속성. 농축 후, CTC 검출 핵산 기반 분석 및 / 또는 유세포 접근법 가장 일반적인있는 다른 방법은, 다수로 수행 될 수있다. 이러한 전략은 각각 별개의 장점과 단점을 가지고, 그러나 그들은 모두 표준화 부족, 독특하고 임상에 입학 필요. CellSearch 시스템 (CSS)을 따라서, 형광 현미경 및 항체 기반 기술 4-6을 사용하여 인간의 혈액에있는 드문의 CTCs의 탐지 및 열거하기위한 표준화 된 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 이 플랫폼은 현재 CTC 열거 형의 황금 표준으로 간주하고 병원 15에 사용하기 위해 미국 식품 의약청 (FDA)에 의해 승인 된 유일한 기술입니다.
CSS는 두 가지 구성 요소 플랫폼 consistin입니다의 g, 사람의 혈액 샘플을 준비하고, 이들을 검사 (이하, 분석 기기 라 함) (2) CellTracks 분석기 II를, 자동화 (이하, 제조 기기 라 함) (1) CellTracks AutoPrep 시스템 준비 다음 샘플. 백혈구에게 준비 기기를 오염의 CTCs를 구별하려면 매개 항체, 자성 유체 기반의 자기 분리 방법 및 차등 형광 염색 사용합니다. 처음에, 시스템은 철 나노 입자에 접합 된 항-EpCAM 항체를 사용의 CTCs 라벨. 시료를 자계에서 배양하고, 모든 비 표지 세포를 흡인한다. 선택된 종양 세포의 형광 표지 된 항체 및 핵 염색 시약을 구성된 차동 형광 염색에 재현 탁하고 인큐베이션. 마지막으로, 시료를 자기 카트리지로 전송 (이하, 자기 장치로 지칭) MagNest 부르고, SC된다분석 기기를 사용 anned.
분석 기기는 10X 대물 렌즈를 이용하여, 서로 다른 형광 필터, 적합한 형광 입자에 최적화 된 각을 이용하여 준비된 시료를 검사하는 데 사용된다. 의 CTCs는 반대로 EpCAM, 안티 팬 CK-피코 에리 트린 (PE)에 의해 결합되어 세포 (CK8, 18, 19), 핵 얼룩 4 ', 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)로 식별됩니다. 반대로, 오염 백혈구는 항 CD45-알로 피코 (APC) 및 DAPI에 구속되는 세포로 식별됩니다. 주사 후, 컴퓨터에 정의 전위 종양 세포가 사용자에게 제시된다. 이러한 이미지로부터, 사용자는 이벤트의 CTCs 있다고 판단하는 상술 정의 파라미터 및 차동 염색법을 사용하여 정성 분석을 채택한다.
CTC 열거를위한 표준화 된 방법을 제공하는 것 외에도, CSS는 그 단백질 마커에 기초의 CTCs 분자 특성화를 허용한다. 이 심문 C이 CTC 식별 16에 필요하지 형광 염료 (FITC) 형광 채널을 이용해 단일 셀 레벨에서 수행 될 수있다. 이 플랫폼은 분자 특성의 용량을 제공하지만, 프로토콜 개발 및 최적화의 자세한 과정은 잘 정의되어 있지 않습니다. 세 시판 마커는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 및 인슐린 - 유사 성장 인자 -1 수용체 (IGF-1R) 등 CSS와 함께 사용하기 위해 제조자에 의해 개발되었다. HER2 분석은 CSS와 함께, 임상 의사 결정을 알리기 위하여 기존 및 잠재적 치료 지침을 변경할 CTC 특성화 가능성을 설명하기 위해 여러 그룹에 의해 이용되었다. 예를 들어, Fehm 등. (17)는 HER2-기본 종양 유방암 환자의 약 삼분의이 HER2 +의 CTCs이 있었다는 것을 보여 주었다. 또한, 리우 등.(18)는 최근 그녀의 + 전이성 유방암 환자의 50 %가 HER2 +의 CTCs을하지 않았다고 보도했다. 허셉틴, 크게 그 종양 HER2 충분한 수준의 표현, HER2 + 기본 종양 19-21 환자에 대한 일반적으로 사용 치료 환자에게 이익을 보여 단일 클론 항체를 방해 HER2 수용체. 그러나 이러한 연구는 허셉틴이 하위 최적 활용과 CTC의 특성은 치료 반응을 예측하는데 도움이 될 수 있다는 것을 할 수 있다는 것을 권 해드립니다. 궁극적으로, CTC 특성화 개인화 치료를 개선하기위한 가능성을 가지고있다.
그것은 주로 침대 - 투 - 벤치 탑 접근 방식을 활용하고있다 점에서 CTC의 연구는 고유합니다. 이 방법은 종종 환자 치료에 영향을 줄 수 년이 걸릴 수있는 벤치 탑 - 투 - 머리맡의 연구와는 달리, 임상에의 CTCs 빠른 입력을 허용했다. 그러나, 의사는 환자의 치료 결정 MAK에서 CTC 분석 결과를 사용하기 꺼려인해 기본 생물학에 대한 이해의 부족으로 보내고. 따라서 전이 보완 CTC 분석 기술의 적절한 전임상 마우스 모델이 뛰어난 질문을 조사하기 위해 사용되어야합니다. 일반적으로, 전이성 캐스케이드의 모든 단계의 연구를 허용 전이성 캐스케이드를 연구하는 데 전임상 모델의 두 종류 (1) 자발적 전이 모델이있다과는 허용 (2) 실험 전이 모델 이러한 혈관 외 유출 및 보조 종양 형성 (22)과 전이 과정에서 이후 단계의 연구. 자발적 전이 모델은, 적절한 동 소성 명소 (전립선 암 연구 전립선에 전립선 암 세포의 예 주입)으로 종양 세포 주입을 수반한다. 세포는 다음 주 종양을 형성하고 자발적으로 이러한 뼈, 폐, 림프절 등의 보조 사이트에 전이 시간이 주어집니다. 에반면, 실험 전이 모델 (특정 위치에 셀을 대상으로 꼬리 정맥 또는 심장 내 주사 등을 통해) 혈류로 종양 세포의 직접 주입을 포함하기 때문에 보조 기관 (22)에 intravasation 보급의 초기 단계를 건너 뜁니다. 지금까지 생체 내 모델 시스템에서 CTC 분석의 대부분은 세포 계측법 기반 (23) 또는 적응 인간 기반 CTC 기법 (예 AdnaTest) (24)를 사용하여 수행되었다. 유용하지만, 이러한 기술 중 어느 것도 적절 골드 표준 CSS를 사용하여 CTC 열거 형을 반영하지 않습니다. 결과 것과 비교 될 것이라고 임상 승인 표준화 활동 및 CSS의 광범위한 사용에 따라, 상응하는 샘플 준비, 가공을 이용하는 생체 모델링 CTC 포획 및 검출 기술, 및 식별 기준의 개발이 유익 할 것이다 환자 샘플에서 얻은. 그러나, 볼륨 REQ 행제조 장비의 uirements는이 자동화 플랫폼을 사용하여 혈액의 작은 볼륨을 처리 할 수 없다. .로 마우스 편평 상피 세포의 오 분류로 이어질 수 있습니다 - 또한, Eliane 등 (25)에 의해 이전 작업 (또한 표준 CTC 정의 [EpCAM + CK + DAPI + CD45]을 만족) 마우스 상피 세포 샘플의 오염이 있음을 보여 주었다 의 CTCs. 이러한 문제에게 수동 격리 절차와 결합 된 CSS CTC 키트 시약의 활용이 개발 한 수있는 적응 기술을 해결합니다. 상기 분석으로 FITC 표지 된 인간 백혈구 항원 (HLA) 항체의 첨가는 인간 종양 세포는 마우스 편평 상피 세포로부터 구별 될 수있다.
이 원고는 discrepan 포함하여 발생할 수있는 환자의 혈액 샘플 및 일반적인 함정을 처리하기위한 상업적으로 개발 표준 및 CSS 최적화 된 프로토콜을 설명합니다CTC의 오 분류 오류가 발생할 수 있습니다 t 항목. 또한, 촬영의 CTCs과 전이의 전임상 마우스 모델에서 혈액의 작은 볼륨에서의 CTCs 농축 및 탐지를 허용하는 비교 적응 CSS 기술의 사용자 정의 단백질의 특성을 검토하는 CSS 분석의 정의가 설명되어 있습니다.
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Protocol
이 논문에 기술 된 모든 인간의 연구는 웨스턴 대학의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 동물 실험은 웨스턴 대학교 동물 사용 분과위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라, 동물 보호에 캐나다위원회의 권고에 따라 실시되었다.
1. CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거
1. 제조 장비에 대한 인간의 혈액 샘플 수집 및 처리를위한 준비
- 표준 무균 정맥 절개 기술을 사용하여, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 독점적 셀룰러 방부제를 포함 (이하 CTC 방부제 튜브 라 칭함) 10 ㎖ CellSave 튜브에 인간 혈액 8.0 ㎖가 최소값을 그린다. 응고에서 혈액을 방지하기 위해 튜브의 5 배를 반전. 샘플은 즉시 처리 또는 최대 96 시간 동안 실온에서 저장 될 수있다.
- Remov전자 CSS의 냉장고에서 시약 및이를 사용하기 전에 실온으로 가온하도록 허용한다.
- 일회용 10 ㎖ 피펫 및 자동 피펫을 사용하여, CTC 방부제 튜브에서 혈액의 7.5 ML를 수집하고 천천히 적절하게 레이블이 지정된 준비 악기 처리 튜브에 혈액을 분배.
- 각 샘플에 희석 버퍼의 6.5 ML을 추가합니다. 샘플 5X를 반전시킴으로써 섞는다. "OFF"위치에 브레이크 10 분 800 XG에 샘플을 원심 분리기. 처리를 위해 시스템에 모든 환자의 샘플을로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. 샘플 준비의 1 시간 이내에 처리해야합니다.
2. 제조 장비에 대한 처리에 대한 제어 준비
- 조심스럽게 제어 유리 병 와동 혼합하는 배 반전.
- 조심스럽게 제어 유리 병에서 뚜껑을 제거하고 세척제 유리 병 위에 거꾸로 준비 기계 가공 튜브를 놓습니다. 하나의 빠른 움직임에 반전바이알을 제어하고, 상기 처리 튜브에 내용물을 붓는다. 반전하면서 부드럽게 남아있는 내용을 공개하는 제어 유리 병의 측면을 가볍게.
- 조심스럽게, 처리 관에서 반전 제어 유리 병을 제거 할 때 아무 액체가 손실되지 않도록 보장하고 옆에 놓습니다. 1000 μL 피펫을 사용하여 병 뚜껑에 남아있는 내용을 수집하고 부드럽게 처리 튜브에 피펫.
- 처리를 위해 시스템에 컨트롤을로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오.
3. 분석 기기에 대한 샘플 스캔
- 시스템에서 모든 샘플을 언로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. 느슨하게 각각 자기 장치 카트리지를 모자와 카트리지의 가장자리에 붙어있는 모든 거품을 해제 손이나 실험실 벤치를 사용하여 자기 장치를 누릅니다. 모든 거품이 제거되고 나면, 단단히 난 카트리지를 모자 평면 자기 장치를 마련하고,상온에서 적어도 20 분 동안 어둠 속에서 ncubate. 샘플 준비 24 시간 내에 스캔해야합니다.
- 분석 기기의 전원을 켜고 램프를 초기화합니다. 일단 (~ 15 분)을 따뜻하게, 분석 기기에 시스템 검증 카트리지를로드하고 QC 테스트 탭을 선택합니다. 필요한 품질 관리 측정을 수행하려면 화면의 지시를 따릅니다.
- 분석 기기에 샘플을로드하고 환자 테스트 탭을 선택합니다. 준비 기기에서 저장된 모든 정보가 표시됩니다. 샘플 검사를 초기화하려면 시작을 클릭하십시오. 시스템은 자기 소자 카트리지 거친 포커스 및 에지 검출을 수행한다.
- 방향 키를 사용하여 필요에 따라 모든 모서리를 조정합니다. 선택에 동의합니다. 이 시스템은 미세 초점을 수행하고 샘플 검사를 시작합니다.
- 결과를 스캔에 따라 제어가 높은 (CK + DA에서 아군 세포에 대해 정의 된 기준을 사용하여 유효성을 검사해야PI + CD45 - APC +)과 낮은 (CK + DAPI + CD45 - FITC +)의 농도. 결과를 스캔에 따라 환자의 샘플은 정의 CTC 기준 (CK + DAPI + CD45을 -)를 사용하여 캡처 한 CTCs를 검토해야한다.
2. CSS를 사용하여 사용자 정의 마커에 대한 CTC의 특성
1. 사용자 정의 마커 및 기기 초기화의 준비
- 작업 농도는 샘플 및 스톡 농도로 첨가 한 후, 항체의 농도는 다음 식을 이용하여 마커 시약 컵에 원하는 농도로 본드 차 항체 희석액을 사용하여 관심의 항체 희석있는 항체의 농도는 시약 컵. 다수의 샘플은 표 1에 기재된 바와 같이 항체 볼륨을 조정한다. 시약 카트리지와 L의 1의 위치에 마커 시약 컵을 놓고CSS에 카트리지 OAD.
주식 농도 = (근무 농도 X 850 μL) / 150 μL - 혈액 수집 샘플을 준비하고, CSS 프로토콜을 사용하여 환자의 혈액 샘플로부터 기본 CTC 열거 상기에서 설명한대로 제조 기기를로드. 준비 악기 메시지가 표시되면 사용자 지정 마커 추가를 사용하려면 선택 사용자는 분석을 정의. 입력 마커 이름과 저장을 선택합니다. 샘플을 기기에 탑재되면, 운전자는 필요가 없음 예를 선택하거나 선택하여 사용자 지정 표시를 수신해야하는 묻는 메시지가 표시됩니다.
2. 분석 기기에 대한 사용자 정의 마커의 샘플 스캔
- , 분석 기기를 켜고 램프를 초기화하고, CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거의 3.2 절에 설명 된대로 품질 관리 및 시스템 검증을 수행
- 분석 기기에 샘플을로드하고 설정 탭을 선택합니다. FITC 채널을 초기화하려면, 테스트 프로토콜 섹션의 키트 ID로 CellSearch CTC를 선택합니다. 이 메뉴에서 선택 CTC 연구, 편집 버튼을 클릭하고 원하는대로 노출 시간을 설정합니다. 그것은이 CTC 식별에 이용 다른 형광 채널로 비쳐을 높일 수있는 CSS CTC 키트를 사용할 때 1.0 초의 노출 시간을 초과하지 않는 것이 권장된다.
3. 전임상 마우스 모델에서 사용하기위한 표준 CSSProtocol의 적응
* Veridex 마우스 / 쥐 CellCapture 키트에서 적응 (더 이상 상업적으로 가능)
1. 마우스 혈액 수집 및 저장
- 종래 채혈에, 0.5 M EDTA 30 ㎕를가 허브 EDTA 소량 남게 앞뒤로 22 G 바늘을 통해 실행 ~.
- 이전 동소, 꼬리 정맥, 또는 심장 내 경로를 통해 인간의 종양 세포를 주입 한 생쥐에서 마우스 혈액의 50 μL의 최소 수집합니다. (시리얼 CTC 분석) 복재 정맥이나 (터미널 CTC 분석) 심장 천자하여 혈액을 수집합니다. 바늘을 제거하고 1 ㎖의 EDTA의 microtainer 혈관에 혈액을 분배. 응고에서 혈액을 방지하기 위해 반전 또는 부드럽게 영화 튜브로 섞는다. 혈액 CytoChex 셀룰러 방부제의 동일 부피의 또 다음 최대 48 시간 동안 즉시 처리 또는 실온에서 저장 될 수있다.
2. CTC 심화
- 냉장고에서 CSS 시약을 제거하고 사용하기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다.
- 관 세포 계측법 12mm X 75mm의 흐름에 전체 혈액의 50 μL의 등가를 전송합니다. 튜브의 측면에 남아있는 혈액을 세척, 각각의 샘플에 희석 버퍼 500 μl를 추가합니다. 필요한 경우, 짧은 원심 스핀남아있는 혈액을 수집하기 위해 사용될 수있다.
- 부드럽게 안티 EpCAM의 자성 유체 와동 직접 샘플로 피펫의 팁을 배치하여 각 샘플에 25 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어 캡처 향상 시약와 소용돌이의 25 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양한다.
- 자석에 샘플 튜브를 삽입하고 10 분 동안 품어. 샘플 튜브 자석에 여전히 있지만, 조심스럽게 옆에 자석 관의 벽에 닿지 않고 잔류 액체를 대기음 및 폐기 유리 피펫을 사용합니다.
3. CTC 염색
- 핵산 염료, 염색 시약, 항 마우스 CD45-APC, 안티 - 인간의 HLA-알렉사 플 루어 488, 및 Permeabilization 100 μL의 5.0 μL의 1.5 μL의 50 μL의 50 μL에서 자석에 resuspend에서 샘플 튜브를 제거 시약. 다수의 샘플의 경우, 이러한 시약은 예비 혼합 될 수 있고, 혼합물의 206.5 ㎕를 각 튜브에 첨가 될 수있다. 부드럽게 섞어 소용돌이및 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양한다.
- 자석으로 500 부드럽게 희석 버퍼의 μL, 소용돌이, 장소 샘플 튜브를 추가하고 10 분 동안 품어. 샘플 튜브 자석에 여전히 있지만, 조심스럽게 옆에 자석 관의 벽에 닿지 않고 잔류 액체를 대기음 및 폐기 유리 피펫을 사용합니다. 자석에서 샘플 튜브를 제거하고 희석 버퍼 350 μL에 재현 탁. 소용돌이 가볍게 혼합한다.
4. 자석 장치로드
- 젤 로딩 팁을 사용하여 조심스럽게 자기 장치에 카트리지에 샘플 튜브에서 전체 볼륨을 전송합니다. 카트리지의 하단에서 시작하고 샘플이 분배된다 천천히 팁을 철회.
- 전체 샘플이 전송되면, 느슨하게 자기 장치 카트리지를 모자와 Sectio에 설명 된대로 카트리지의 가장자리에 붙어있는 모든 거품을 해제 손이나 실험실 벤치를 사용하여 자기 장치를 누릅니다n은 CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거 형 3.1.
- 베벨 및 카트리지의 가장자리 사이들을 포착하여 멸균 22 G 바늘을 사용하여 기포를 팝. 모든 거품이 제거되고 나면, 확실히, 카트리지 캡 평면 자기 장치를 마련하고, 적어도 10 분 동안 어둠 속에서 부화. 샘플 준비 24 시간 내에 스캔해야합니다.
5. 분석 기기에 수동으로 분리 된 샘플의 스캐닝
- , 분석 기기를 켜고 램프를 초기화하고, CSS 프로토콜을 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거의 3.2 절에 설명 된대로 품질 관리 및 시스템 검증을 수행합니다.
- 분석 기기에 샘플을로드하고 설정 탭을 선택합니다. 서식 샘플 버튼을 클릭하여 자기 장치 데이터 버튼에 기존 데이터를 지 웁니다. FITC 채널 사용CSS를 사용하여 사용자 정의 마커에 대한 CTC 특성의 2.2 절에 설명 된대로 차 1.0 초에 노출 시간을 설정합니다.
- 환자 테스트 탭을 클릭하고 입력에 샘플 정보를 편집을 선택합니다. 테스트 프로토콜로 키트 ID로 CellSearch CTC 및 CTC 연구를 선택합니다. 입력은 별표로 표시로 나머지 필요한 정보. 샘플 정보를 저장하고 시작을 클릭합니다.
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Representative Results
표준 CTC 열거 분석
CSS의 민감도와 특이도는 물론 문헌에 기록되어있다. 그러나 동등한 CTC 복구의 유효성을 검사, 스파이크 (1,000 된 LNCaP 인간의 전립선 암 세포) 및 건강한 자원 봉사 기증자로부터 unspiked 인간의 혈액 샘플은 표준 CSSCTC 프로토콜을 사용하여 CSS에서 처리되었다. 예상했던대로, unspiked 샘플은 0.00 ± 0.00 %의 CTCs 무료 있었고, CTC 복구는 아군 샘플 (그림 1A)에 86.9 ± 4.71 %로 증명되었다. 아군 샘플에서 얻은 CSS 갤러리 이미지를 최적의 품질 있었다 CTCs를 비 CTCs를 구별하기 쉽게했다. 암 환자로부터 얻은 샘플을 처리 할 때 그러나,의 CTCs 식별이 많은 세포의 크기가 작은 나타나는 덜 쉽게 구별 비의 CTCs (그림 1B)로부터되는, 조금 더 도전입니다. 또한, 환자의 시료 이벤트 6 카테고리를 검토 할 때이있는 식별했다검토 (그림 1C) 사이에 일반적으로 불일치 항목이었다 에디션. 이 6 카테고리 포함, (1) 작은 CTC 분류를위한 4 μm의 크기 요구 사항을 충족하지 않은 이벤트, 희미한 CK 및 / 또는 DAPI 염색 (2) 항목 (3) 정당은 정당 대 (CTC으로 간주한다) (CTC로 간주해서는 안) 밝은 CK-PE 염색에 의한 CD45-APC 채널로 통해 출혈, (4) FITC + 이벤트, (5) CK 및 / 또는 DAPI 채널의 픽셀 화 된 이미지, 그리고 (6) 이벤트 CK의 이미지 나 CK 이미지와 함께> 50 %를 중복되지 않는 DAPI 염색과보다 큰 DAPI 염색과. 범주들 (2) 및 (5)는 특정 기준 CTC 종별 존재한다. 범주 (2), 희미한 CK / DAPI와 항목의 CTCs은 그대로 막 CK 채널에서 관찰 될 수 있다는 것을 제공으로 분류 될 수 있고적절한 크기의 DAPI 이미지가 기록됩니다. 임의의 픽셀 화는 CK 채널에서 관찰되는 경우 카테고리 (5)를위한, 픽셀 화 된 CK / DAPI와 항목의 CTCs로 분류 될 수 없다. 또는 확산 (해야 - 그러나, 픽셀 화는 DAPI 채널에서 수용은 (흰색 검은 색 바탕에 페인트로 얀센 진단 (이전 Veridex)에 의해 기술, 즉 이미지, 회색 영역이 배경에 완전히 흰색) 너무 심각하지 않은 것이어야한다 여전히) 모양 타원형을 표시하고 CK에 맞게.
사용자 정의 마커 분석 개발
사용자 정의 마커의 CTCs을 결정하기에 CSS의 적응은 엄격한 통제와 많은 작업 업을 필요로하고 이전 16 설명했다. 일반적으로, 사용자 정의 마커의 적절한 최적화는 부정적인 컨트롤이 결과는 특정 보장하기 위해 사용되어야합니다. 아군 샘플이 모두 처리 될 때 최상의 결과가 얻어진다대상 항체 대신하고 전술 한 바와 같이 단독 항체 희석액과 비특이적 IgG의 제어. 다양한 대상 항체 농도와 노출 시간도 평가하고, 높음, 낮음 및 결석 (음) 항원 밀도와 세포 라인을 사용하여 유효성을 검사해야합니다. 분석은 16 비특이적에서 표적 항원과 낮은 잡음에 대한 높은 감도를 모두 보여줍니다 때 최적의 프로토콜 조건이 달성된다.
암 줄기 세포 마커 CD44를 사용하여이 작업 업의 예는 여기에 제공됩니다. 이 마커 초기 테스트는 사용자 정의 마커 개발을위한 FITC 채널을 이용한다 (이하 전통적인 CTC 키트라고 함) 표준 CSS CTC 키트를 사용하기 시작했다. 기존의 CTC 키트를 사용하여, 그것은 상당한 최적화 후, CD44 +로 분류 될 수의 CTCs의 최대 수의 샘플을 사용하여 69.3 ± 2.67 % 1,000 MDA-MB-468 구호 물자와 함께 타서 것을 입증되었다n은 다수의 셀에 높은 CD44 발현을 입증하는 것으로 알려져 유방암 세포 (98.4 ± 0.90 %, 유동 세포 계측법에 의해 결정)이 단백질 (도 2A)을 표현. 이러한 연구 결과를 바탕으로이를 상업적으로 이용 가능한 CSS CXC 키트가 향상된 결과를 얻을 수 있음을 가정 하였다. 이 키트는있는 CK8 / 형광 채널을 반대로하여 (~ 100,000 항원 / 셀의 밀도가 마커에 최적화 된) 기존의 CTC 장비에 비해 낮은 항원 밀도 (~ 50,000 항원 / 셀)와 마커의 향상된 시각화 할 수 있습니다 19분의 18 (전통적으로 PE 채널에 표시)와 (전통적으로 FITC 채널에 표시) 그 사용자의 마커 (따라서 CXC 키트 이하 낮은 항원 밀도 CTC 키트이라한다) 26 표현된다. 중요한 최적화 후,이 변화는 CD44 + <으로 분류의 CTCs 98.8 ± 0.51 %로 개선 CD44 염색에 허용하는 것이 증명되었다/ SUP> 사용자 정의 마커의 적절한 최적화도 높은 항원 밀도 (MDA-MB-468)를 사용하여 유효성 검사를 필요로 ML 1.0 ㎍ /의 농도와 0.6 초의 노출 시간 (그림 2A).에서 CD44-PE를 사용하여, 낮은 항원 밀도 (21 NT), 그리고 그 마커 (그림 2B)에 대한 음의 (LNCaPs) 세포 라인.
전임상 마우스 모델에서 CTC 분석
적응 마우스 CSS 프로토콜의 민감도 및 특이도를 결정하기 위하여, 표준을 이용하여 처리 아군 (1000 된 LNCaP 인간 전립선 암 세포) 및 unspiked 마우스의 혈액 샘플을 수동으로 처리하고 스캔 분석 계측기와 같은 세포주를 사용하여 얻은 결과와 비교 하였다 준비 도구 (그림 3A)에 자동 CSS 프로토콜입니다. 예상했던대로, unspiked 샘플은 모두 분석을 사용하여의 CTCs의 자유가 0.00 ± 0.00 % 및 적응 마우스 키트 (90.8 ± 5.18 %)를 사용하여 CTC 복구의 아니었다표준 자동화 시스템을 사용하여 얻은 결과에서 ignificantly 다른 (86.9 ± 4.71 %를, P> 0.05). 수동 마우스 적합한 프로토콜을 사용하여 얻어진 이미지는 HLA-FITC 표식의 추가를 제외하고는 표준 자동화 된 기법을 사용하여 관찰 된 것과 다르지 않았다. 또한, 마우스 편평 상피 세포는 HLA-FITC (그림 3B)에 대해 긍정적으로 얼룩하지 않습니다. 이 기술의 CTCs 낮은 번호의 분리를위한 표준 CSS 프로토콜로 같은 민감한 것을 확인하려면, 일련의 희석은 아군의 혈액 샘플에 수행 된 세포의 복구 된 수에 비해 세포의 예상 수의 상관 관계 (그림 3C) 평가했다. 결과는 CTCs를 효율적으로이 분석을 사용하여 전체 혈액의 5 cells/50 μL의 감도까지 복구 할 수 있다는 것을 보여줍니다. R 2 = 0.99과 예상되는 결과와 상관이 값.
그림 2. CSS를 사용하여 사용자 정의 마커의 CTCs 특성. (A) CD44가 CSS의 CTC와 CXC 키트를 사용하여 +로 분류 된 세포의 비율 (N = 3). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하고 있습니다. *** = (P <0.0005). (B) 크게 다른 건강한 자원 봉사 기증자 (7.5 ㎖)에서 혈액의 대표 CSS 갤러리 이미지는 반대로 1.5 ㎍ / ㎖로 배양 확인 된 세포주에서 ~ 1,000 세포를 타서 -CD44-PE 및 0.2 초의 노출 시간에서 스캔. 오렌지 사각형 + <CD44을 나타냅니다/ SUP> CK + / DAPI + / CD45으로 확인의 CTCs, - / CD44 -. PE +는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 전이의 전임상 마우스 모델에서 사용하기 위해 CSS 절차의 적응. (A) 스파이크 된 세포의 수의 백분율로 측정하고 표준 인간 CSS 프로토콜을 사용하여 얻은 결과와 비교하여 적응 마우스 CSS 프로토콜을 이용하여 CTC 복구. 세포는 혈구에 의해 카운트하고, 1000 ~ 된 LNCaP 인간 전립선 암 세포는 인간의 혈액 7.5 ㎖에 타서 하였다. Unspiked 인간 혈액 시료는 음성 대조군으로 사용 하였다 (N = 3). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하고 있습니다. NS = 중요하지 않습니다. (B) (C) 분석의 다양한 농도에서 아군 종양 세포의 회복 번호 대 예상 . 된 LNCaP 인간의 전립선 암 세포는 처음 혈구에 의해 계산 이후에 혈액의 μL ~ 1,000 종양 cells/50의 농도로 마우스의 혈액으로 급등했다. 못을 박은 마우스의 혈액은 다음 직렬 5 종양 cells/50 μL의 농도로 희석하여 마우스 적응 CSS 프로토콜 (N = 3). 사용하여 처리 된 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 사용자 정의 마커 추가 된 샘플 중 | 총 Volu나 시약 컵에 추가 (μL) |
| 1 | (450) |
| 2 | 600 |
| 3 | (750) |
| 4 | 900 |
| 5 | 1,050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1,350 |
| 8 | 1500 |
표 1. . 사용자 정의 마커 샘플의 다양한 숫자를 처리 할 때 CSS의 총 볼륨 요구 사항은 ** (:에서 사용할 수 Veridex 백서에서 적응 http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
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Discussion
2004 년에 CSS의 도입 이후 많은 새로운 CTC 기술의 발전에도 불구하고,이 기술은 오늘날 시장에서 유일하게 임상 적으로 승인 된 기술이며, 따라서 그것은 CTC 탐지 및 열거 형에 대한 현재 황금 표준으로 간주됩니다. 이 원고는 CSS는 엄격한 품질 관리 기준을 가지고 있지만 그것을 해석 편견의 대상이 될 환자 샘플에서 CTC 식별이 아군 샘플의 식별과 크게 다를 수 있다는 것을 보여 주었다. 일반적으로 모순 된 항목의 6 개의 종류는 CTC의 misclassifications가 발생할 수 확인되었다. 이러한 불일치 항목이 악기에서 처리 각 환자의 샘플에서 여러 검토의 필요성을 강조 표시합니다. 또한, CTCs를 얻은 환자에 비해 아군에서 관찰 된 차이는 두 아군과 환자 샘플에서 유효성을 검사 할 새로운 CTC 기술에 대한 필요성이 있음을 보여줍니다. 또, 이러한 새로운 기술이 ㄱ해야전자 아군 샘플에서 효율적인 CTC 캡처는 반드시 환자의 샘플에서 CTC의 포집 효율을 반영하지 않는 한 두 아군과 환자 샘플의 분할 샘플 테스트를 사용하여 골드 표준 CSS에 비해.
CSS 캡처의 CTCs 특성화를 수행하는 기능을 가지고 있지만, 그것은 매우 매우 최적화 최적화에 관하여 제한된다. 일반적으로, 사용자 정의 마커의 최적화를 위해이 악기에 변경 될 수있는 유일한 파라미터는 항체 농도와 형광 물질이 수은 램프에 노출되는 시간의 길이이다. 최적화를위한이 제한된 용량 문제를 제시 할 수있을 때 작업까지 사용자 정의 마커를 CSS에. 본 논문에서 제안 된 한 가지 해결책은 (이전 16 상세히 설명) FITC 및 낮은 항원 밀도 마커 나은 시각화를 허용 PE 형광 채널 스위치 낮은 항원 밀도 CTC 키트의 사용이다. 에 관계없이키트는 적절한 마커의 민감도, 특이도 및 최적화를 보장하기 위해 수행되어야합니다 몇 가지 필요한 단계가 있습니다 (기존 또는 낮은 항원 밀도 CTC 키트) 사용하는 중. 우선, 분석 민감도는 사용자의 (그 마커를 표현 세포 집단의 세포의 비율, 즉) 예상 검출 레벨의 판정을 허용 할 것이다 같은 유동 세포 계측법뿐만 아니라 검증 방법, 비교 평가되어야 정의 마커. 둘째, 분석 표현의 다양한 수준 (즉, 높고 낮은 항원 밀도)와 특이 세포 라인에 대한 관심의 마커를 감지 할 수있는 능력에 대한 평가해야합니다 관심의 마커에 대한 부정적 셀 라인에서 검증해야 . 모든 경우에서, 모든 세포주는 MO를 결정하는 세포만을 제어 (항체 없음 첨가 없음), IgG의 적절한 제어 및 다양한 농도 및 노출 시간에 관심의 항체를 사용하여 시험해야한다사용자 정의 마커의 최적화를 보장합니다 세인트 적절한 설정. 그러나의 CTCs 특성화가 CSS에 가능하지만, 현재 그 하나의 사용자 - 정의 된 마커는 각 샘플에서 탐구하고 있다고 할 수 있다는 것을 주목해야한다 시스템은 매우 의한 가혹한 가공 하류 애플리케이션과 관련하여 한정된다 샘플의.
CTC 연구에 사용되는 고유 한 침대 - 투 - 벤치 탑 접근 방식은 임상에이 유용한 분석의 빠른 진입을 허용하고있다. 그러나, 이러한 희귀 세포 기초 생물학 불충분 이해 귀착되었다. 따라서 암의 생체 내 마우스 모델에서 전임상에서의 CTCs 평가를 허용 분석의 개발 및 최적화가 필요합니다. 이 원고의 CTCs가 이상적으로 직렬 CTC 수집 실험 모델에 적합한 마우스의 혈액의 50 μL 볼륨에서 평가 될 수 있습니다 적응 CSS 프로토콜을 설명합니다. 이 원고 D이 프로토콜을 이용하여 CTC 열거는 자동 및 수동 분리 기술 사이 CTC 포집 효율에 상당한 차이점 전통적인 CTC 키트와 조합 CSS를 사용하여 얻은 결과에 필적한다는 emonstrates. 또,이 분석의 개발 중에는 이전 문헌 25에 기재된 것처럼 인식하고, 해당 마우스 편평 상피 세포 오염의 CTCs 정확한 식별이 더 어렵고 때로는 불가능하게 할 수있다. 적절의 CTCs로 할당되고 따라서이 문제에게 사용자 정의 HLA-알렉사 플 루어 488에 대항하기 위하여는 인간의 세포 (- - HLA 알렉사 플 루어 488 + CK + DAPI + CD45)가 있는지 확인하기 위해이 프로토콜에 추가되었습니다. 그것은이 원고에 사용 된 LNCaP 세포주 HLAlow이며, 따라서 HLA-알렉사 플 루어 488은 다양한 HLA 발현과 세포 라인에 대한 적정해야 할 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 우리는 HLA-알렉사 플루오 (Fluo)을 추가했지만R 우리의 프로토콜에 대한 488의 CTCs의 정확한 신원을 확인하기 위해, 마우스 편평 상피 세포의 대부분은 형태에 의해 쉽게 식별 할 수 있었다 세포 수에 제한되어 있음을 주목할 필요가있다 (0.33 ± 0.24 events/50 μL, N = 9). (심장 천자를 통해) 혈액 수집이 어려웠 반복 시도가 필요했다 때 더 높은 세포 수 (최대 11 events/50 μL는) 만 관찰되었다. 그러므로 우리는 원하는 경우의 CTCs에 대한 시스템 특성이 표시를 생략함으로써 달성 될 수 있다고 제안한다. 또한, 여기에서 설명하지 않지만, 우리는 이전에 CSS (27, 28)를 사용하여 설명 된대로의 CTCs 및 기타 방법을 사용하여의 CTCs 하류 특성의 컬렉션을 쉽게 달성 될 수 있다고 기대하고 있습니다.
CSS 효과적으로 전이성 유방암, 전립선 암 및 대장 암 환자 4,10,29의 혈액에서의 CTCs를 검출하는 임상 적 이용되었지만, 여러 리튬이 있는가mitations. 다양한 전이성 암 환자의 최대 35 %에서의 CTCs는 광범위한 전신 질환 (30)의 존재에도 불구하고 발견 할 수 있습니다. 검출이 부족 상피 투 간충직 전이 암 침윤, 전이 바로 알려진 잘 문서화 프로세스 및 전반적인 적극성 (31)의 결과로 제안되었다. 이 전환은 예컨대 EpCAM 같은 상피 마커의 현저한 감소와 관련이 있으며, 간엽에서 상응하는 증가가 32 표식. 몇몇 연구는 최근의 CTCs에서 이러한 중간 엽 마커의 존재가 나쁜 예후의 지표이며, 이러한 세포의 대부분은 CSS 24,33-38를 사용하여 감지에 필요한 것 상피 마커의 발현이 부족하다는 것을 증명하고있다. 이것은 표준 CSS 정의가 가장 적극적인의 CTCs의 일부를 누락 될 수 있다는 것을 제안합니다.
기술의 한계에도 불구하고, 예상되는 일이다이 논문에 기술 된 전자 프로토콜은 생체 내 전임상 마우스 모델에서 사용하는 새로운 CTC 기술, 사용자 정의 마커의 최적화 및 CTC 생물학의 개선 이해의 CSS 개발을 사용하여 개선 된 CTC 분석을위한 중요한 도구가 될 것입니다. 이와 함께,이 프로토콜은 전이와의 CTCs에 관한 전임상 및 임상 연구에 관심이 플랫폼의 사용자를위한 유용한 리소스를 제공 할 것입니다.
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Disclosures
저자 (ALA)는 부모가 회사 존슨 앤 존슨은 또한이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 얀센 진단 LLC를 소유 얀센 종양학가 제공 한 자금을 받았다.
Acknowledgments
이 작품은 암 연구의 온타리오 연구소 (# 08NOV230), 혁신에 대한 캐나다 재단 (# 13199), 전립선 암, 캐나다, 얀센 종양학, 런던 지역 암 프로그램, 존 도나 브리스톨에서 기증자의 지원을 통해에서 교부금에 의해 지원되었다 (ALA에) 런던 건강 과학 재단. LEL은 프레 더릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 박사 수상에 의해 지원됩니다. ALA는 CIHR 새로운 탐정 수상 및 연구와 혁신의 온타리오 교육부에서 조기 연구원 상에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
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