Summary
这个协议说明为了研究体内中枢神经系统的样本translatome多核糖分馏的必要修改。它允许翻译和转录调控的全球评估通过隔离和核糖体结合的RNA成分的总RNA的比较。
Abstract
多个进程中涉及的基因表达，包括基因和蛋白质的转录，翻译和稳定性。其中的每个步骤都受到严格调控，影响蛋白质丰度的最终动力。各种监管机制的转换步骤存在，使mRNA水平单独基因表达的一种不可靠的指标。此外，mRNA翻译的地方性法规已特别牵连的神经元功能，移动性'translatomics'来关注在神经生物学的焦点。该方法可用于桥梁转录组学和蛋白质组学。
在这里，我们描述了必要的修改，以多核糖体分离的技术的基础上，积极的mRNA翻译到多个核糖体的沉降差在蔗糖梯度协会并询问该translatome。传统上，正在与体内样品特别的CENTRA，升中枢神经系统（CNS），已被证明是由于材料的限制量和脂肪组织成分的存在挑战性。为了解决这个问题，所描述的协议是专为与中枢神经系统的材料最小量的使用进行优化，就证明了使用单个小鼠脊髓和大脑。简要地，中枢神经系统组织中提取和翻译的核糖体上固定的mRNA与放线菌酮。然后进行浮选髓鞘去除脂质丰富的组件。分馏是，蔗糖梯度，其中的mRNA是根据其核糖体装载分开进行。孤立的分数是适用于多种下游检测，包括新的全基因组分析技术。
Introduction
基因表达是通过转录，翻译和mRNA和蛋白的稳定的联合作用决定的，与翻译承载的最主要的作用1。它现在明显的是，每个步骤是高度管制。微核糖核酸，核糖核酸形成颗粒剂，替代和胞质多聚腺苷酸化是基因表达的2,3的转录后调控的一些例子。从翻译这些机制的解耦转录并影响蛋白质在感兴趣的生物系统。因此，毫不奇怪，单独的mRNA水平蛋白水平4的一个不完美的读数。定量蛋白质组学提供了基因表达的最直接的评价，但尽管最近的进展，但仍有灵敏度和蛋白质序列的分辨率相当的局限性。因此，解决translatome，翻译mRNA的剧目，提供学习的一个很好的妥协转录组和蛋白质组。它比在最终评估基因表达转录更准确，同时提供更高的覆盖率和序列分辨率比蛋白质组学。
在哺乳动物系统中，大多数翻译活动通过帽依赖性启动开始。一组真核起始因子与40S核糖体小亚基一起聚集在一个mRNA的5'帽。复杂的然后扫描mRNA和在到达起始密码子八月，募集60S核糖体大亚基形成一个完整的80S核糖体。伸长阶段所得与核糖体沿着mRNA的移动，与延伸因子协助的氨基酸的掺入从加载的tRNA到新生肽链上。多核糖体可以沿着一个单一的mRNA同时进行和相关的核糖体的数目已证实与蛋白质合成5,6的速率。这使得核糖体装载一个可靠的指标TRANslation并允许积极地翻译基于沉降率的mRNA分离。除了翻译的mRNA的定量化，序列信息可以得到鉴定参与翻译调控基序。还核糖核酸结合蛋白和其他翻译因子可以从不同的级分进行分离，便于相关调控蛋白的研究和发现。
在神经系统，平移控制已链接到诸如mRNA的储存，运输和地方蛋白质的合成过程。生长锥已被证明怀有的mRNA从轴突7的其余部分不同的特定局部池。此外，轴突具备的能力，本地合成蛋白质8,9。因此，翻译的本地控制已成为研究的神经生物学一个重要课题。多核糖分馏的电位，以解决这已在几项研究中已经示出，其中，所述技术被用于探讨在脊髓发育轴突导向，并证明BDNF在脑中10,11的活性依赖性翻译。
Protocol
所有动物实验均按照DKFZ的机构准则进行。
注意：为防止样品的RNA酶的污染，采取基本的预防措施，以避免RNA酶的污染，并准备所有的缓冲区用DEPC处理过的水。
蔗糖梯度的1。准备
- 准备17.5，25.6，33.8，41.9和50％蔗糖溶液（ 见表1）。开始慢慢加入2ml的50％蔗糖溶液，以一个异质同超速离心管的底部制备梯度。通过将管20分钟，在-80°C冻结层
- 添加后续层在减少蔗糖的百分比与冷冻之间的步骤，结束了17.5％的蔗糖。保持此外蔗糖溶液的过程中，为了防止下层的层的融化冰梯度。
- 准备蔗糖梯度刚使用前一天，并保持在4°C。 AlternativelY，实验前准备梯度提前，储存在-80°C和解冻，4℃过夜。
2，组织准备（脊髓和/或脑）
- 麻醉小鼠通过赛拉嗪和氯胺酮在NaCl的过量和用20毫升的汉克的含有200微克/毫升放线菌酮的固定不变的相关联的转录的核糖体的平衡盐溶液（HBSS）transcardially灌注。非反应到脚趾捏确认正确的麻醉。
- 快速提取组织。打开颅骨背侧和提取大脑。执行整个胸腰椎脊柱椎板和提取脊髓。使用全脑（〜400毫克）或4厘米的脊髓（〜90毫克），分别。
- 组织转移到冰冷的匀浆缓冲液A（ 见表1）（脊髓：1毫升;脑：4毫升）和骰子切成小块用干净的手术刀，使放线菌酮的摄取增加。 PERFORM冰的所有进一步的步骤。
- 孵育15分钟，并机械地用Dounce匀浆器匀化组织。仔细控制均质化是必要的，以确保核保持完整。对待所有样品完全相同的方式，以保证可比性。注：对于脑组织：5招用紧紧贴合杵扰乱组织。对于脊髓组织：5招用松配合杵，其次是5再招一个紧密配合的杵破坏。
- 采取等分试样（400微升用于脑和200μl的脊髓），闪存冷冻并储存在-80℃下进行总RNA提取。
- 通过离心分离，在500×g离心在4℃下除去细胞核和不间断的细胞和组织碎片10分钟低速离心防止核糖体的损失。
- 在细胞核上清液30分钟，裂解膜上的片段，加入NP-40和脱氧胆酸钠洗涤剂（各以1％的终浓度）。
- 这个步骤从其中将另有掩蔽的信号中的多核糖更新的样本去除脂肪酸组分。首先，预冷超速离心桶和转子在4℃，并准备2 M，1.1 M和0.9M的蔗糖溶液（ 见表1）。
- 混合溶胞产物用1.22体积的2M蔗糖溶液，并转入聚乙烯超速离心管。填满所有试管于10毫升的1.1M的蔗糖溶液等体积，然后小心地用0.9M的蔗糖溶液覆盖它。
- 将超速离心管放入预先冷却的超速离心机桶。离心3小时以100,000×g离心在4℃下在此过程中成为核糖体沉积在沉淀而脂肪酸成分浮起，并保持在上清液中。
4，蔗糖梯度分级
- 除去上清液，沉淀物溶解在匀浆缓冲液B（ 见表1
- 放置蔗糖梯度（其制备的前一节中所述）插入到预先冷却的超速离心机桶。仔细层样品在梯度上。添加一个空的蔗糖梯度技术控制。
- 调整每个桶匀浆缓冲液的重量。在4℃下离心样品1.5小时，于285,000×g离心
- 启动离心结束前准备伊斯科分馏塔30分钟。如果使用分馏塔的另一种模式，遵循制造商的协议。
- 设置适当的灵敏度（0.2 AUFS脑或0.05 AUFS脊髓）的紫外线灯和打开它的热身。装配在管穿孔器，通过经由管穿孔轧制泵至60％蔗糖溶液连接起来。
- 抽蔗糖（流量大鼠测试设置E：1毫升/分钟），特别是要确保有一个在其中将引入气泡成梯度的油管没有泄漏。
- 空白的背景吸收通过手动泵梯度缓冲到紫外检测和纠正的基准。
- 仔细沉积样品从转子取出含有蔗糖梯度超速离心桶，将它们放在冰上。避免梯度的任何碰撞，防止丧失决议。
- 运行梯度上的分馏塔。首先，评估背景吸收，并确保适当的技术安装运行空梯度。
- 附加梯度的UV检测器和刺穿管的底部与管子穿孔。从60％的蔗糖的泵送，这将向上通过UV检测器和进滴分配器置换梯度与沉积样品。
- 在260nm处的吸光度是记录以产生吸收曲线的样品，峰值指示沉积作用tion与核糖体亚基，monosomes，随后越来越多核糖体相关的mRNA。
- 通过下拉饮水机（每600微升，在2毫升试管）收集样本为20个部分。
5，从个人分数RNA提取
- 加10％的SDS至1％，以单个组分的终浓度，并以展开蛋白质和游离核糖体拌匀。在这点上的样品可以在-80℃下冷冻取决于要解决的问题，组分可以根据更新的吸光度进行汇集。
- 分离RNA用酸性苯酚/氯仿提取，这也消除DNA的污染痕迹。
- 添加酸性苯酚/氯仿1卷（预热至RT）到每个样品中，加热，在65℃10分钟，并在通风橱下之后释放压力。
- 离心样品20分钟，在17000×g离心于RT。水相小心转移到一个新的1.5 ml管。注意在致密蔗糖级分，其中所述水相可能在底部离心后倒相的。
- 以沉淀RNA的添加1倍体积的异丙醇，1/9体积的醋酸钠（pH5.2）和1μl的GlycoBlue到各样品中。采样保持至少1小时，在-80°C
- 离心30分钟，在17000×g离心和4℃下GlycoBlue提供粒料的可视化。除去上清液，用冰冷的80％乙醇和空气干燥的颗粒洗一次沉淀。在无RNA酶的水溶解沉淀。
- 量化的RNA量的NanoDrop和由生物分析仪芯片分析RNA的完整性。这是由所提出的协议获得的RNA适用于艺术的高通量检测，包括基因芯片和深度测序的所有状态。
Representative Results
图2显示了分馏后代表多核糖体轮廓。脑和脊髓的剖面显示特征吸收曲线，如前所述为细胞系。的mRNA结合到核糖体小亚基（40S）的沉积物在较轻馏分和第一个出现在分布的峰值，随后是核糖体大亚基（60S）和monosome（80S）绑定的mRNA。的mRNA绑定到多个核糖体沉积物重质馏分，与后来的峰表明越来越多核糖体结合的。全球翻译可以从配置文件中进行评估。作为一个例子，脑组织中具有较高的多核糖到monosome比率比脊髓组织，这表明更活跃的翻译。
从单个组分提取的RNA被生物分析仪评估，显示出18S和28S rRNA的分布。 18S rRNA基因较早出现在配置文件中，按照核糖体小亚基沉降较轻SUCR OSE分数。总RNA的典型产量为10-20微克的大脑和2-4微克脊髓。从单个组分的RNA产率高达4微克和0.8微克对大脑和脊髓分别取决于分数。空白蔗糖梯度已经显示了一些背景吸收在260 nm处，由于DTT的存在。这样的背景下可以在数据分析，以标准化样本值中减去。 EDTA处理倒塌的多核糖体峰，表明沉积分布是由于翻译。
图1的工作流程和体内多核糖分馏的潜在应用。>请点击这里查看该图的放大版本。
空梯度和大脑和无图2（A）脑和脊髓，与生物分析仪提取的RNA进行评估的多核糖体的典型剖面（B）GAPDH mRNA的分布馏分定量RT-PCR（C）多核糖体型材EDTA处理。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 1.1 | 2个梯度缓冲液 | 30毫米的Tris-HCl pH7.4的，30毫米MgCl 2，600 mM氯化钠，200微克/毫升放线菌酮（CHX），2mM的二硫苏糖醇（DTT）的 | |
| 1.1 | 蔗糖溶液17.5％ | 8.67克蔗糖，将25ml 2倍梯度缓冲液，最多至50ml DEPC H 2 O中 | |
| 1.1 | 蔗糖溶液25.6％ | 12.8克蔗糖，将25ml 2倍梯度缓冲液，最多至50ml DEPC H 2 O中 | |
| 1.1 | 蔗糖溶液33.8％ | 16.9克蔗糖，将25ml 2倍梯度缓冲液，最多至50ml DEPC H 2 O中 | |
| 1.1 | 蔗糖溶液41.9％ | 20.95克蔗糖，将25ml 2倍梯度缓冲液，最多至50ml DEPC H 2 O中 | |
| 1.1 | 蔗糖溶液50％ | 25克蔗糖，将25ml 2倍梯度缓冲液，最多至50ml DEPC H 2 O中 | |
| 2.3 | 同质化缓冲液A | 0.25M蔗糖，50毫米的Tris /盐酸，pH7.4）中，5毫米氯化镁2，25毫米氯化钾 | 200μg/ ml的CHX，1个罗氏完全蛋白酶抑制剂，1 mM的DTT，1mM的phenylmethanesulfonylfluoride（PMSF），100 U / ml的核糖核酸酶 |
| 3.1 | 2M蔗糖溶液 | 68.4％蔗糖，50mM的Tris-HCl，pH7.4的，5毫米MgCl 2，25毫米氯化钾 | 100μg/ ml的CHX，1个罗氏完全蛋白酶抑制剂，1 mM的DTT，1 mM的PMSF |
| 3.1 | 1.1M蔗糖溶液 | 38.5％蔗糖，50mM的Tris-HCl，pH7.4的，5毫米MgCl 2，25毫米氯化钾 | 100μg/ ml的CHX，1个罗氏完全蛋白酶抑制剂，1 mM的DTT，1 mM的PMSF |
| 3.1 | 0.9M蔗糖溶液 | 30.8％蔗糖，50mM的Tris-HCl，pH7.4的，5毫米MgCl 2，25毫米氯化钾 | 100μg/ ml的CHX，1个罗氏完全蛋白酶抑制剂，1 mM的DTT，1 mM的PMSF |
| 4.1 | ħomogenization缓冲液B | 的0.25M蔗糖，50mM的Tris / HCl，pH7.4的，5毫摩尔MgCl 2，25mM的氯化钾，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠 | 200μg/ ml的CHX，1个完整的罗氏公司的蛋白酶抑制剂，1mM的DTT，1 mM的PMSF，100 U / ml的核糖核酸酶 |
表1 列出缓冲器和解决方案。
Discussion
虽然多核糖体分馏是不是一种新技术，它仍然是一个特别具有挑战性的。根据所输入的材料，主要优化可以是必要的。这是特别适用于体内中枢神经系统的样品，其中材料的量通常是一个限制和脂肪组织成分阻碍翻译的mRNA的分离的情况。大多数已发表 的分馏协议处理酵母或哺乳动物细胞系，并有既定协议的大脑12,13,14。与此相反，也有几乎没有任何描述脊髓的分馏出版物，和以前的协议需要脊髓从大量动物被汇集15。由于这些原因，一些必要的改动做了适应分馏协议中枢神经系统组织，包括单小鼠脊髓。动物灌注期间进行核糖体固定用放线菌酮，以避免核糖体的解离超级碗组织提取克漫长的过程。随后，多核糖体RNA的提取以特定方式最大化多核糖产率。首先，通过受控douncing组织的均质化，保持了核完好并防止DNA污染。细胞核，然后可靠地通过离心分离除去。洗涤剂NP-40和脱氧胆酸钠的组合确保了内质网和与其相关联的膜核糖体释放的裂解。此外，富含脂质的髓鞘内UV-吸收组分混淆多核糖访问。因此髓鞘浮选是必要的，其中致密的化合物如多聚核糖体被沉淀和更轻的化合物如髓鞘浮子和被除去16。多聚核糖体，然后沉淀在17.5％至50％的蔗糖梯度。而不是手动分层和冷冻每个蔗糖层，渐变，也可以使用梯度混合器制备。使用酸性酚/氯仿萃取组分的RNA允许dNA以最小的损耗的RNA被除去。然而，可能发生在密集的蔗糖分（以上分数16）相位反转。
该协议提供了优势，解决翻译水平等常规方法。例如，磷酸化S6（著名翻译标记）的两个测量以及新生肽链与放射性同位素标记给全球翻译水平的信息，但很少透露有关具体是什么正在翻译。多核糖体分离，另一方面，不仅允许评估全局翻译的也是，翻译的mRNA和相关的调节蛋白的识别。实时定量PCR技术可以对离体的RNA进行一个快速的读出选定的mRNA和微阵列和下一代RNA测序可以用于全基因组研究的进行。这里提出的优化允许与中枢神经系统组织中的最小量的使用的技术，因此相应地减少ING所需动物的数量，并通过减少组织处理时间提高整体实验的质量。另一方面，这种技术不能从翻译那些区分失速核糖体。成绩单携带停滞的核糖体将沉淀在重分数，这应该解释数据时，必须牢记。
有最近报道的技术，即RiboTaq和TRAP，其中核糖体中的细胞类型特异性的方式分别标有表位标签或记者和相关的mRNA分离，通过免疫沉淀17,18。这种技术可以被耦合到多核糖体分馏提供读出特定的细胞群体高的分辨率。核糖体尺印刷是另一个新技术是由核糖体保护的mRNA，涉及核酸酶消化，产生小碎片，或“脚印”。然后，从这些脚印生成和测序文库。这种方法省IDES上翻译的密码子特异性的全基因组分析和能够识别停滞核糖体，非AUG起始密码子和小上游开放阅读框架，它可以不通过多核糖分馏19来实现。然而，多核糖分馏可耦合到核糖体的剖面为包含单个核糖体消化的片段的分离，从而富集所需的库制剂，其中高纯度的样品，通常需要的分子种类。两者合计，多核糖分馏是一种灵活的方法，以持久的意义，并且可以耦合到各种下游应用，包括基因组范围的分析像新一代测序。
Disclosures
没有利益冲突声明。
Acknowledgments
这项工作是由德国联邦教育与研究部（BMBF），（对系统生物学亥姆霍兹联盟）信令在巨蟹星座系统生物学和德国癌症研究中心（DKFZ）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
| Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 ml, 14 x 95 mm | Beckman Coulter | 331374 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| Equipment | |||
| Dounce Tissue Grinder, 1 ml/7 ml | Wheaton | 357538/357542 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 ml, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
| Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |
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