Summary
増幅マイクロアレイは大幅にエンドユーザーのために、マイクロアレイのワークフローを合理化し、単一の室内に非対称PCR増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを兼ね備えています。マイクロアレイワークフローを簡略化する日常的低リソース環境において使用することができるマイクロアレイに基づく診断を作成するために必要な最初のステップである。
Abstract
マイクロアレイワークフローを簡略化する日常的低リソース環境において使用することができるMDR-TBマイクロアレイベースの診断を作成するために必要な最初のステップである。増幅マイクロアレイは単一の溶液中で、単一のマイクロ流体チャンバ内に非対称PCR増幅、目標サイズの選択、標的標識、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを組み合わせる。バッチ処理法は、9 -プレックス非対称マスターミックス及び多剤耐性結核菌 （MDR-TB）を遺伝子型決定するための低濃度のゲル素子マイクロアレイを用いて実証されている。ここで説明するプロトコルは、6時間で完了し、ゲノムDNAの少なくとも1,000細胞同等で正しい遺伝子型決定を提供することができる。オンチップの洗浄工程を組み込むことは完全に閉じアンプリコンの方法およびシステムになるであろう、実現可能である。増幅マイクロアレイでの多重化の程度は、最終的に単一のマスタmに組み合わせることができるプライマー対の数によって制約される九依然としてむしろアレイ上に固定化されるプローブの数よりも所望の感度および特異性のパフォーマンス·メトリックを達成する。同様に、総分析時間は、特定の使用目的に、研究課題、および検出の所望の限度に応じて短縮または延長することができる。それにもかかわらず、一般的なアプローチは、有意に手動集約的で時間のかかる処理工程の数を減らすことによって、エンドユーザーのためのマイクロアレイのワークフローを効率化し、日常的な臨床実践にマイクロアレイに基づく診断を翻訳するための簡略化された生化学的およびマイクロ流体経路を提供する。
Introduction
早期患者発見と迅速な治療が結核菌を減らす最も効果的な制御戦略（MTB）変速機1と見なされ、ポイントオブケア（POC）またはPOCテストの近くには、同時に結核を診断することを結核コミュニティの幅広い合意が今そこにあるアール薬剤耐性（DR）が必要である。例えばCepheid社のGeneXpertおよび他の核酸増幅試験などの技術は、多くのTB患者のための診断までの時間を短縮し、リファンピンまたは他の第一または第二選択薬2に対する耐性を付与する選択された変異に耐性を示す急速な読み出しを提供する。リアルタイムおよび等温核酸増幅試験は、MDR-TBをもたらす薬剤耐性突然変異を同定するために設計されているが、それらは検出突然変異のスペクトルは、患者の薬剤耐性プロファイルに対応する個別化された薬物療法を設計することがしばしば不十分であるおよび関連する技術的な制約光クロストークまたは増幅および報告化学の複雑さのために3-7座位または検出された変異の数を制限することがあります。したがって、より高い多重化容量を有する検出技術は、MDR-TBのPOC診断において公知のギャップに対処するために必要とされる。
マイクロアレイとWHOが承認しハインラインプローブアッセイは、MDR-TBの8月29日を診断する「複数の遺伝子、複数の変異「課題に対処することができます。残念ながら、これらのハイブリダイゼーションに基づく、多重化された検出プラットフォームは、多段階で複雑、かつ分子技術の大幅な訓練と技能を必要とするオープンアンプリコンプロトコルを使用しています。増幅マイクロアレイ30は 、これらのマイクロアレイワークフローと運用の問題の一部に対処するために設計されました。簡略化流体原理は、増幅ハイブリダイズし、単一のマイクロ流体チャンバ内での核酸標的を検出することである。ユーザーは、核酸増幅MASを紹介TERはピペットで流体室に混ぜて熱サイクルプロトコルを開始します。ここに示されているバッチ処理法では、マイクロアレイは、その後、バルク溶液中で洗浄し、乾燥させ、結像される。この研究は、 のrpoBのためのMDR-TBのマイクロアレイ試験（30の変異）、 のkatG（2の変異）、 仁荷 （4の変異）、 のrpsL（2の変異）、embB（1変異）、IS1245、IS6110を用いた増幅マイクロアレイの機能性を実証、および内部増幅およびハイブリダイゼーションコントロール。マイクロアレイプローブ（野生型（WT）及び一塩基変異体（MU））の少なくとも一つのマッチしたペアは、関心のある各変異のために含まれている。多剤耐性Mから精製された核酸結核は 、TDR結核菌株バンク31からのものである。他の箇所32記載のようにゲル素子マイクロアレイは、我々がpolymeriz各プローブ4％のモノマーおよび0.05mMを使用することを除いて、実質的に共重合させることによりガラス基板上に製造されるATION混合物。アレイは、使用前の50mlガスケットで囲まれている。熱サイクル、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の後、増幅マイクロアレイはAkonni携帯型分析に結像される。バックグラウンド補正、統合された信号強度は、生から得られる。tifの画像を、固定円アルゴリズムを使用して。各ゲル素子のノイズは、ローカルスポットのバックグラウンドの標準偏差の3倍として計算される。対雑音比（SNR）、信号用の≥3が値遺伝子標的は、典型的には、検出と見なされる。各遺伝子または特定のコドンにおける変異の有無を決定するために、判別比は、（WT-MU）/（WT + MU）としてSNR値から計算される。 0野生型配列の指標である判別比<比は、一方0は、遺伝子座における薬剤耐性変異の指標である>は。
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Protocol
ユニバーサルPCR法上の注意事項に従ってくださいラボラトリーズためには、基板ごとに複数の増幅マイクロアレイとガスケットを含み、ここで説明したように、バルクコンテナで同時にすべての増幅マイクロアレイを洗浄するために、運用が効率的です。他の場所で30,33報告されているように消耗品のフォーマットは、完全に密閉され、閉じられたアンプリコンテストで増幅後のマイクロアレイの洗浄工程を実行するために用意されています。
1。セットアップ
- 抽出と選択の方法で適当な生物学的安全性条件下で試料から核酸を精製する。要件は、核酸は、非対称多重PCR増幅のために十分な純度であることである。
- 汚染除去のソリューションと表面と機器を拭いて、ワークスペースを準備します。
- 氷や冷たいブロックに増幅試薬を配置します。
- 増幅マスターミックスのための無菌1.5mlマイクロチューブにラベルを付けて、滅菌した0.2ミリリットルマイクロ遠心TUにラベルを付ける各サンプルについても。
- 試薬は、簡単に渦を解凍し、ミニ遠心機でのパルススピンでチューブの底に内容を収集した後。 Taqポリメラーゼをボルテックスしないでください。穏やかに混合し、ミニ遠心機でのパルススピンに従うようにチューブをフリック。
- 可能なピペットの不正確さを考慮するために、表1に示すサンプルごとの反応容量を用いた増幅マスターミックスを調製し、処理中のサンプルの総数よりも少なくとももう1つの反応容積を調製する。何度muliplex PCRバッファーを備えているものの上に、マスターミックスは、追加のTaqポリメラーゼが含まれていることに注意してください。他のすべての試薬が組み合わされた後にマスターミックスを増幅/禁止制御を追加し、ストック·試薬チューブは、ストレージに戻った。
| 試薬 | サンプルごとの容量（μL） | <強い>ファイナル[] |
| ホットスターのTaq PlusをMulitplex PCRバッファー | 25 | 1X |
| ウシ血清アルブミン（BSA） | 0.55 | 0.6 mg / mlの |
| ホルムアミド | 3.8 | 7.6％ |
| 追加のTaqポリメラーゼ | 0.8 | ユニット/μl（4台の合計） |
| MDR-TBのプライマーミックス | 15.75 | - |
| RNaseフリーのH 2 O | 2.1 | - |
| 増幅/禁止の制御 | 1 | 5.0 FG /μL |
| 合計 | 49 |
表1。MDR-TBの増幅マイクロアレイマスターミックス組成物。
- 渦マスターミックス、ミニ遠心機でのパルススピンでチューブの底に内容を収集します。
- マスターミックス49μLとMの1μLを組み合わせる上記工程1.4からの試料管の各々に結核 DNA。外部、鋳型なし対照（NTC）は、M.の代わりに、分子生物学グレードの水の1μlを使用する結核 DNAサンプル。渦とパルススピン仕上げチューブ（S）。
2。増幅マイクロアレイをロード
- マイクロアレイ自体には手を触れないように注意して、それぞれのマイクロアレイの中心に、各マスターミックス/サンプルの48を添加する。
- マイクロアレイチャンバー内の気泡ではないトラップに気をつけながら、マイクロアレイガスケットおよびシールの上にカバースリップを配置。気泡が負に増幅効率に影響を与える可能性そして、その後のマイクロアレイ画像にアーチファクトやノイズを作成することがあります。
3。熱サイクル
- いったんすべてのマイクロアレイは、フラットブロックサーマルサイクラー上のサンプル、場所基板が装填されています。加熱蓋オプションが「オフ」になっていることを確認してください。 Akonniバイオシステムズから入手した機器は、既に使用のために事前資格になります。それ以外の場合は、フラットブロックサーマルサイクラー（s）が（複数の）均一な、全てのマイクロアレイ基板で一貫した加熱を提供することを検証することは非常に重要である。
- サーマルサイクラーソフトウェアを開き、適切なプログラムを選択して、反応体積は、「50μL」と入力し、実行を開始します。ここで説明する熱サイクルプロトコルは、で構成されています。
熱サイクル手順 1 88℃ 5分 2 88℃ 30秒 3 55℃ 1分 4 65℃ 30秒 5 50サイクルの工程（2-4）を繰り返す 6 65℃ 3分 7 55℃ 3時間 - 必要に応じて、または特定の実験に応じて全熱サイクル数と55°Cの増幅後の保持時間は、ユーザが変更することができることを独立した変数である。 MDR-TBのマスターミックスは、非対称（主に一本鎖）アンプリコンを作成するので、それは他の点では従来、指数関数的なPCR増幅プロトコルのために利用されているより多くの熱サイクルを含めるようにして、通常は便利です。
- 熱サイクルとハイブリダイゼーションのプログラムが完了したら、プログラムを終了増幅マイクロアレイを削除、ソフトウェアを終了し、サーマルサイクラー（複数可）をオフにしてください。
4。洗浄及び乾燥
- 同時に24基材への洗浄のために、1×SSPE少なくとも250ミリリットル調製 - 0.1％トリトンX-100洗浄緩衝液、および脱イオン水またはそれぞれのMilli-Qグレード水は少なくとも250 mlの二つの容器を。洗浄緩衝液を予め調製することができる。
- 慎重にフラットエンドピンセットを用いて、各増幅マイクロアレイ室からカバーガラスとガスケットを取り外します。 この手順では、物理的に損傷ゲル素子アレイの最大の危険性がある点である。増幅された核酸の拡散を防止するための適切なPCR汚染コントロールを使用して、作業環境の中。
- 組織学のスライドホルダーにマイクロアレイ基板を配置し、洗浄バッファーを含む洗浄ビンにすべてのスライドを配置。蓋付きの容器をカバーしています。
- 穏やかに攪拌しながら室温で10分間、マイクロアレイを洗浄する。
- 脱イオンの2連続洗浄にマイクロアレイを3回ずつ浸したりミリQグレードの水、そして空気乾燥。
5。イメージング
非対称のMDR-TBのプライマーミックスは、Cy3標識アンプリコンを生成します。ゲル素子マイクロアレイのCy3を撮像することが可能な任意の標準的マイクロアレイイメージャーで画像化することができる。次の撮像手順はAkonniが提供する多剤耐性結核マスターミックス、Dx2100フィールドポータブルイメージャ、および自動化された解析ソフトウェアに特異的である。
- イメージャからのイーサネットケーブルがコンピュータに接続されていることを確認します。
- イメージャの電源をオンにします。電源スイッチが機器の背面パネルに配置されている。イメージャの電源を入れたときのイメージャの前面にある青いLEDが点灯します。
- コンピュータの電源を入れます。
- コンピュータのデスクトップ上で、自動化された画像解析ソフトウェアを起動するためのソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。
- イメージャカメラとの接続を確立するためのソフトウェアのを待ちます。接続が確立されると、分析ボタンが使用可能になり、メッセージ「接続成功」とは、画面の左下隅に表示されます。
- マイクロアレイは、ユーザから、対物レンズに向かって反対側で乾燥させた増幅マイクロアレイを挿入します。マイクロアレイが不適切レンズとカメラに対して配向されている場合は、自動化された分析ソフトウェアは、蛍光画像上にグリッドを配置するために失敗する。
- アクセスドアを閉じます。プレビュー画像は、コンピュータの画面上で利用できるようになります。
- ドロップダウンメニューから多剤耐性結核解析スクリプトを選択し、（ミリ秒単位）所望の露光時間を入力します。ゲル素子増幅マイクロアレイのための典型的な出発点は、100〜500ミリ秒である。
- 飽和画素は赤でプレビュー画像に表示されます。個々のスポット内の飽和画素の数を最小化するために露光時間を調整する。
- 蛍光画像を取得して分析する分析をクリックしてください。ソフトウェアが自動的に配置されますMDR-TBアッセイ特異グリッド画像上に、積分強度及びバックグラウンド値を抽出し、薬剤耐性及び遺伝子型決定の結果を報告する。自動化された分析では、典型的には数秒かかります。傷、埃、蛍光アーティファクト、またはマイクロアレイ機能への物理的な損傷が含まれている挑戦的なイメージの場合、ソフトウェアは分析を完了するために1分までが必要な場合があります。
- 分析が完了したら、[保存]をクリックインストール先のフォルダを選択し、ファイル名を入力し、[OK]をクリックします。基礎となるマイクロアレイデータは。xlsファイルとして保存され、オフライン分析のために、必要に応じて、エクスポートすることができます。
- 分析が完了すると、イメージャからの増幅マイクロアレイを削除し、次の分析を開始するために新規をクリックしてください。
- データの収集が完了したら、コンピュータをシャットダウンし、ソフトウェアを終了し、イメージャの電源を切ります。
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Representative Results
定性的画像分析は、自動画像解析ソフトウェアにより生成されたデータテーブルに識別するために挑戦している実験的なノイズやばらつきの原因への洞察を提供することができる。このように、それは1）すべてのゲルの要素が無傷で損傷がない、2）グローバルなバックグラウンドノイズ比（SNR）の値に個々の信号に影響を与える可能性のある蛍光成果物がないことを確認するため、視覚的に有用である可能性があり、3）のための証拠はない気泡形成や不均一な増幅/ハイブリダイゼーションアレイ全体、および4）ソフトウェアが正確にマイクロアレイ画像上の全てのスポットを同定していること。実施例MDR-TB増幅マイクロアレイ画像は、高品質のアレイと、熱サイクリング中の物理的損傷や気泡を生じ得るアーチファクトを示す、 図1に示されている。標準的なマイクロアレイ画像解析ソフトウェアは、通常、グリッドを配置してもshなどの低品質画像から積分強度とバックグラウンドデータを抽出することができる図1Bに独自なので、さらなる分析からマイクロアレイの画像を受け入れるか、拒否 するための品質管理基準や測定基準を確立するために、研究者の責務であると信ずる。プローブの冗長性は、これらの問題を改善するに役立つことがあります。しかし、完全に自動化され、診断のMDR-TBの増幅マイクロアレイ報告アルゴリズムは、そうでなければ「無効」として、図1Bからテストを宣言する。
野生型菌H37RaゲノムDNAの希釈系列に対する増幅マイクロアレイSNR値を表2に示す。反応あたり6.25 pgの入力ゲノムDNA又は約1.25×10 3細胞等価では、全ての野生型プローブは、容易に検出される。内部増幅と抑制の各コントロールのためのSNR値は、非対称多重増幅反応中のすべての遺伝子標的を増幅し、検出可能であることを示し、（Akonniが提供する内部陽性対照）98.48（ のrpoB）から967.24の範囲であった。いいえテンプレートコントロールは増幅マイクロアレイ中のすべてのプローブのための（SNR <3）陰性であった。 6.25 PG入力のDNAの遺伝子型判定率は、WTとMUプローブおよび適切な遺伝子型判定の正確な動作を示し、すべてのWT / MUプローブ対のために0.18から1.00の範囲であった。
既知の遺伝子型の世界保健機関の基準単離物のパネルのための代表的遺伝子型決定データを表3に示す。一塩基多型（SNP）は、ゲル素子マイクロアレイ上で表されている場合、増幅マイクロアレイ試験を正確MDRの対応する変異を検出する結核ゲノム。増幅マイクロアレイプローブのいくつかは、明示的にユニークなプローブとしてアレイ上に表現されていないに近い隣人変異に敏感である。例えば、TDR-0129はrpoB遺伝子にS531E変異が含まれていますが、S531Eのための増幅マイクロアレイ上の特異的なプローブがない隔離。それにもかかわらず、他の5つのSNPプローブはtargetinGコドン531の変異はコドン531に存在することを示している - 増幅マイクロアレイは、したがって、正しくこの分離株は、リファンピシンに耐性であることを示している。 のrpoB S513W変異と同様に感度が分離株TDR-0148用には明らかである。一方、いくつかのSNPプローブは、分離株、TDR-0148とのrpoB S512G変異によって示されているように、近い隣人変異に敏感ではなく、TDR-0011とのkatG S315R変異を分離します。私たちは、プローブの挙動のこのタイプは、一本鎖アンプリコンおよび/ またはプローブ34内の二次および三次構造の結果であり、 演繹的に予測することができるものではありませんと思われる。それにもかかわらず、近い隣人変異に対する感度を調査することは、リアルタイムPCRプローブの最小セット35,36で複数の薬剤耐性変異を検出するために、ずさんな分子ビーコンの使用に類似しており、テストは偽陽性を生成しませんが提供診断有利で あることができるRELA表現型の薬剤感受性にTIVE。
100 PG野生型M.については、図1（a）実施例増幅マイクロアレイ画像結核菌H37RaゲノムDNAから100ミリ秒の露光時間。Cy3のビーコン（自動化されたグリッド化およびセグメント化ソフトウェアのための）画像の周辺にある。熱サイクル中の気泡形成に起因する蛍光ハローアーチファクトを示す増幅マイクロアレイの（B）画像、ゲル要素/破片を損傷している。自動化された画像解析ソフトはまだこの画像からグリッドと抽出データを配置することができます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 会社 | カタログ番号 |
| Akonniバイオシステムズ | 問い合わせる |
| QIAGEN | ＃206143 |
| QIAGEN | ＃201207 |
| QIAGEN | ＃206143 |
| サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 | ＃BP227-500 |
| シグマアルドリッチ | ＃3B6917 |
| Akonniバイオシステムズ | 問い合わせる |
| Akonniバイオシステムズ | 問い合わせる |
| サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 | ＃BP1328-4 |
| サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 | ＃BP151-500 |
| 現在のテクノロジー株式会社 | ＃BRSPRAY128 |
| デコンラボ株式会社 | ＃8416 |
| 会社 | カタログ番号 |
| Akonniバイオシステムズ | 100から20011 |
| 100から10021 | |
| ArrayIt | HTW |
| サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 | ＃10〜300 |
| VWR | ＃3365040 |
| VWR | ＃93000-196 |
| 中央空気圧 | ＃95630 |
表2。必要な材料および装置。
| コドン | プローブ ID | WTプローブSNR値 | 500 PG | 100 PG | 50 PG | 25 PG | 12.5 PG | 6.25 PG | |||||||
| のrpoB | 507 | 1 | 900.22 | 644.46 | 523.17 | 431.08 | 364.49 | 287.47 | |||||||
| 3 | 1016.37 | 699.38 | 600.16 | 525.07 | 446.51 | 361.64 | |||||||||
| 511 | 5 | 867.67 | 611.97 | 529.90 | 451.73 | 403.76 | 307.68 | ||||||||
| 512 | 8 | 810.69 | 544.04 | 488.85 | 436.89 | 391.62 | 257.46 D> | ||||||||
| 513 | 11 | 824.36 | 547.04 | 496.00 | 472.01 | 408.96 | 242.25 | ||||||||
| 515 | 15 | 715.48 | 536.59 | 416.96 | 335.81 | 267.48 | 189.10 | ||||||||
| 516 | 17 | 723.83 | 496.44 | 402.95 | 69 "> 329.09270.10 | 201.98 | |||||||||
| 522 | 27 | 674.37 | 413.33 | 360.40 | 316.75 | 236.19 | 153.40 | ||||||||
| 524 | 29 | 269.46 | 153.69 | 117.71 | 118.02 | 110.13 | 51.22 | ||||||||
| 526 | 31 | 136.37 | <TDクラス= "xl69"> 109.9082.63 | 76.76 | 53.61 | 37.76 | |||||||||
| 531 | 44 | 219.92 | 136.31 | 109.16 | 96.18 | 80.58 | 26.44 | ||||||||
| 533 | 51 | 130.54 | 83.60 | 76.03 | 63.47 | 61.35 | 41.54 | ||||||||
| のrpsL | = "xl71"> 43 | 54 | 10.41 | 12.75 | 53.30 | 767.18 | 5.39 | 362.42 | |||||||
| 88 | 56 | 655.54 | 542.79 | 527.43 | 690.34 | 403.86 | 456.05 | ||||||||
| のkatG | 315 | 58 | 1037.03 | 873.46 | P：なし "> 816.64974.83 | 811.79 | 876.47 | ||||||||
| embB | 306 | 66 | 940.81 | 781.13 | 788.75 | 837.65 | 787.05 | 696.69 | |||||||
| 仁荷 | 8 | 82 | 1069.43 | 934.38 | 862.58 | 936.88 | 809.85 | 682 0.56 | |||||||
| 15 | 85 | 1111.66 | 931.88 | 918.22 | 957.87 | 795.72 | 723.16 | ||||||||
| 17 | 87 | 1114.49 | 926.03 | 920.60 | 970.70 | 854.15 | 744.41 | ||||||||
表3。信号野生型プローブとMの希釈系列のための対ノイズ比結核菌H37RaゲノムDNA。3が検出可能と考えられている> SNR値。
常に ">" =キープtogether.withinページFO」ntent
表4。多剤耐性結核からの代表的なジェノタイピングデータは、増幅マイクロアレイ反応あたり25 PGでの既知の遺伝子型の分離します。アスタリスクはゲル要素マイクロアレイ上の固有のプローブによって表されていない変異を同定。 WT =野生型は、核酸配列。 （太字網掛け）、負の値は、それ故に、表現型薬剤耐性変異の指標である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
増幅マイクロアレイとの多重化の程度は、最終的には、マルチプレックス非対称PCRの効率ではなく、マイクロアレイによって決定される。我々の経験では、一意の10〜12のプライマー対を容易に増幅マイクロアレイフォーマットで多重化することができる。従来のプライマーおよびプローブの設計基準のでその一つはこれもPCR緩衝液中の溶液相核酸および固定化されたマイクロアレイプローブ、サーマルサイクラーの熱効率、及びプローブハイブリダイゼーション挙動との間の潜在的相互作用を考慮する必要がある以外は、新しいアッセイに適用PCRプライマーおよび低分子量の増幅アーチファクトが含まれている。このような全ゲノム増幅などの高多重増幅アプローチはランダムヘキサと固定されたプローブ間の干渉、および長い二本鎖アンプリコンの非効率的なハイブリダイゼーションなど、技術的な理由の数のための単室の増幅マイクロアレイプロトコルに資するものではない。そこまた、個々のユーザーがカスタムアッセイを設計したり、ここで説明したMDR-TBのテストを使用するときに考慮する必要があることを検出した使いやすさ、総分析時間、および限界の間の相互関係である。例えば、増幅サイクルの数を減らし、さらに増幅後ハイブリダイゼーション工程を排除することは有意に総分析時間を短縮するが、試験感度を犠牲にするであろう。一方、再現可能な10遺伝子コピーの検出限界を達成することは、従って、単一の作業シフトを越えて総分析時間を延長する、複数の増幅サイクル数またはハイブリダイゼーション時間を必要とし得る。
遺伝子は、突然変異化装置、画像化装置、解析ソフト、ここで説明されたアルゴリズムを報告してではなく、その分析性能および臨床的有用性についての報告はなく、増幅マイクロアレイ方法及びシステムの例示である。要件 - 例えば、出発試料は、痰、除染土砂、固または液体培養することができます増幅マイクロアレイのために抽出された核酸は、非対称多重PCRによる増幅可能であることだけである。一部の研究者や臨床医は、それぞれ、ストレプトマイシンおよびエタンブトールに対する耐性を付与するのrpsLまたはembB変異を検出するにリファンピンとイソニアジドのMDR-TBを定義する唯一の抵抗性を臨床的価値はほとんどを見つけることができます。従って、これらのPCRプライマーおよびマイクロアレイプローブは、他の第一または第二選択抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子突然変異を標的とするプライマーおよびプローブを用いて置換することができる。それはむしろ単純な「検出された抵抗」または「抵抗性が検出されない」結果よりも所与の試料中に検出される特異的変異に関する詳細な情報をユーザに提供するためのレポートアルゴリズムを記述することができる。 Mを分析するために、この特定のアッセイを使用することに興味のある人の研究者のための結核は、IS6110要素がdetecteない場合でも遺伝子型決定データを提供することも可能であり、単離検体中のD。
かかわらず、報告可能なアッセイおよび順列の、ここに記載の増幅とマイクロアレイプロトコルが有意に単一の生化学反応及び微小流体チャンバ内に複数の分子生物学的ステップを組み合わせることにより、マイクロアレイのワークフローを単純化するように設計されている。代表的なデータは、9つのMDR-TBゲノム領域を増幅し、低密度のゲル素子マイクロアレイと、これらの非対称単位複製配列を検出することによってアプローチの有効性を実証する。ここで説明するプロトコルは、物理的に洗濯する前に増幅マイクロアレイからガスケットとカバーガラスを取り外すため、研究用途のみのアプリケーションではなく、臨床診断に適していますようにユーザーに要求するバルク洗浄手順を使用しています。他の場所で説明したように、しかし、それは税込、ラテラルフロー流体工学の33を使用して、オンチップの洗浄工程を組み込んであるため、完全に閉じられたアンプリコン消耗品を保持することは可能である容易にポイントオブケア用途に適した試料における答えアウト診断システムに組み込むことができるものをuding。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この作品は、付与RC3のAI089106の下で国立衛生研究所（NIH）によってサポートされていました。
多剤耐性結核核酸は、熱帯病研究訓練のための国連児童基金/国連開発計画/世界銀行/世界保健機関特別プログラム（TDR）、ジュネーブ、スイスから提供された。
我々は、プロトタイプアッセイに含める特定の遺伝子突然変異についてのガイダンスのために米国疾病対策予防センターの博士トムShinnickに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
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