Summary
En förstärkning microarray kombinerar asymmetrisk PCR-förstärkning och microarray-hybridisering till en enda kammare, som avsevärt effektiviserar microarray arbetsflödet för slutanvändaren. Förenkla microarray arbetsflödet är ett nödvändigt första steg för att skapa microarray-baserad diagnostik som kan rutinmässigt används i miljöer med lägre resurs.
Abstract
Förenkla microarray arbetsflödet är ett nödvändigt första steg för att skapa MDR-TB microarray-baserad diagnostik som kan rutinmässigt används i miljöer med lägre resurs. En förstärkning microarray kombinerar asymmetrisk PCR-amplifiering, målstorlek val, mål-märkning, och microarray-hybridisering i en enda lösning och i en enda mikroflödeskammare. Ett parti bearbetningsmetod demonstreras med en 9-Plex asymmetrisk Master Mix och låg densitet gel elementet microarray för genotypning multiresistent Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). Protokollet som beskrivs här kan fyllas i 6 timmar och ge korrekt genotypning med minst 1.000 cellekvivalenter av genomiskt DNA. I förening med on-chip tvättstegen är möjligt, vilket kommer att resultera i en helt sluten amplikon förfarande och system. Omfattningen av multiplexering med en förstärkningsmicroarray är ytterst begränsad av antalet primerpar som kan kombineras till en enda huvud mix och ändå uppnå önskad känslighet och specificitet prestandamått, snarare än antalet prober som är immobiliserade på matrisen. På samma sätt kan den totala analystiden förkortas eller förlängas, beroende på den specifika avsedda användningen, forskningsfråga, och önskade detektionsgräns. Trots den allmänna strategin effektiviserar avsevärt microarray arbetsflödet för slutanvändaren genom att minska antalet manuellt intensiva och tidskrävande processteg, och ger en förenklad biokemisk och mikroflödesbana för att översätta microarray-baserad diagnostik i klinisk vardag.
Introduction
Tidig fall upptäckt och snabb behandling anses vara de mest effektiva styrstrategier för att minska Mycobacterium tuberculosis (MTB) överföring 1, och det finns nu en bred enighet i TB gemenskap som en punkt av omsorg (POC) eller i närheten av POC-test för att samtidigt diagnostisera tbc och det krävs läkemedelsresistens (DR). Tekniker som Cepheid s Genexpert och andra nukleinsyraamplifiering tester minska tiden till diagnos för många TB-patienter, och ger en snabb avläsning indikerar resistens mot rifampicin eller valda mutationer som ger resistens mot andra första eller andra linjens läkemedel 2. Även realtid och isoterm nukleinsyraamplifiering tester är utformade för att identifiera drogresistensmutationer som leder till MDR-TB, är det spektrum av mutationer som de upptäcker ofta otillräckliga för att utforma en individualiserad medicinering motsvarar läkemedelsresistens profilen hos patienten, och tekniska begränsningar som rörtill optisk överhörning eller komplexiteten i förstärknings-och rapporterings kemier 3-7 Maj begränsa antalet loci eller mutationer som upptäcks. Således är detektionstekniker med högre multiplexering kapacitet som krävs för att åtgärda kända luckor i MDR-TB POC diagnostik.
Microarrays och WHO-godkända Hain linjeprobanalyser kan ta itu med "multipel genen, multipla mutationer" utmaningen att diagnostisera MDR-TB 8-29. Tyvärr är dessa hybridisering-baserade, multiplex plattformar upptäckt använder flerstegs, komplicerade, och öppen-Amplicon protokoll som kräver betydande utbildning och kunskaper i molekylära tekniker. Förstärkningsmicroarray 30 var utformad för att ta itu med några av dessa microarray arbetsflödet och operativa frågor. De förenklar fluidic principerna är att utveckla, hybridisera, och upptäcka nukleinsyramål inom en enda mikroflödeskammare. Användaren introducerar nukleinsyra och amplifiering master blanda in en fluidic kammare med en pipett och startar termisk cykling protokollet. För satsvis bearbetningsmetod som visas här, är microarrays tvättades därefter i bulklösning, torkades och avbildas. Denna studie visar funktionaliteten hos en förstärkningsmikromatris med användning av en multiresistent tuberkulos microarray testet för rpoB (30 mutations), katG (två mutationer), Inha (4 mutationer), rpsL (två mutationer), embB (en mutation), IS1245, IS6110 och en inre förstärkning och hybridisering kontroll. Minst ett matchat par av microarray sonder (vildtyp (WT) och single-nukleotid mutant (MU)) ingår för varje mutation av intresse. Renade nukleinsyror från multiresistent M. tuberkulos är från TDR Tuberkulos Strain Bank 31. Gel elementet microarrays tillverkas på glassubstrat genom sampolymerisation i huvudsak som beskrivs på annan plats 32, förutom att vi använder 4% monomer och 0,05 mM varje sond i polymerization blandningen. Arrayer är omgivna med en 50 ml packning före användning. Efter termisk cykling, hybridisering och tvättsteg, är amplifiering microarrays avbildas på en Akonni portabel analysator. Bakgrund-korrigerad, integrerade signalintensiteter erhålls från den råa. Tif bilder med hjälp av en fast cirkel algoritm. Buller för varje gel del beräknas som tre gånger standardavvikelsen för de lokala spot bakgrunder. Genmål vanligtvis anses detekterbar för signal-brusförhållande (SNR) värden ≥ 3. I syfte att fastställa närvaro eller frånvaro av en specifik mutation i varje gen eller kodon används en diskriminantanalys förhållandet beräknades från SNR-värden som (WT-MU) / (WT + MU). Diskriminantanalys kvoter <0 är indikativa för en läkemedelsresistensmutation vid lokuset, medan Förhållanden> 0 är indikativa för vildtypssekvensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För laboratorier som följer universella PCR försiktighetsåtgärder, det är operativt effektivare att inkludera flera förstärk microarrays och packningar per substrat och tvätta alla förstärk microarrays samtidigt i en bulk container, som beskrivs här. Förbruknings format finns tillgängliga för att utföra post-amplifiering microarray tvättsteg i en helt förseglad, sluten amplikon test, som redovisas på annat håll 30,33.
1. Setup
- Utdrag och rena nukleinsyror från provet under lämpliga biosäkerhet förhållanden med en metod som föredras. Kravet är att nukleinsyror att vara av tillräcklig renhet för asymmetrisk, multiplex-PCR-amplifiering.
- Förbered arbetsytan genom att torka av ytor och utrustning med saneringslösningar.
- Placera amplifieringsreagens på is eller kall blocket.
- Märk en steril 1,5 ml mikrofugrör för förstärkning Master Mix, och märka en steril 0,2 ml mikrocentrifug tuvara för varje prov.
- Efter reagens tinas, kort vortex och samla innehållet i botten av röret med en puls-spin i en mini-centrifug. Inte Vortexa Taq-polymeras. Flick försiktigt röret för att blanda och följa med en puls-spin i mini-centrifug.
- Förbered en förstärkning Master Mix med hjälp av per-prov reaktions volymer visas i tabell 1. För att beakta eventuella pipettering felaktigheter, förbereda minst en reaktionsvolym än det totala antalet prover som bearbetas. Observera att mastermixen innehåller ytterligare Taq-polymeras, utöver vad som tillhandahålls med den muliplex PCR-buffert. Lägg bara till förstärkningen / hämning kontrollen till Master Mix efter alla andra reagens kombineras, och aktiereagensrören tillbaka till lagring.
| Reagens | Per-Provvolym (^ il) | <strong> Final [] |
| Mulitplex PCR-buffert med Hotstar Taq Plus | 25 | 1x |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,55 | 0,6 mg / ml |
| Formamid | 3,8 | 7,6% |
| Ytterligare Taq-polymeras | 0,8 | enheter / | il (4 enheter totalt) |
| MDR-TB primerblandning | 15,75 | - |
| RNas-fritt H2O | 2,1 | - |
| Förstärkning / Hämning kontroll | 1 | 5,0 fg / l |
| Totalt | 49 |
Tabell 1. MDR-TB-förstärkning microarray Master Mix sammansättning.
- Vortex Master Mix och samla innehållet i botten av röret med en puls-spin i en mini-centrifug.
- Kombinera 49 l av huvudblandning och 1 l av M. DNA tuberculosis till vart och ett av provrören från steg 1.4, ovan. För en extern, ingen mall kontroll (NTC), använda ett pl av molekylärbiologisk kvalitet vatten i stället för M. tuberculosis DNA-prov. Vortex och puls-spin röret (s) när du är klar.
2. Lastförstärkning Microarrays
- Lägg till 48 l av varje huvudblandning / prov på mitten av deras respektive microarrays, var noga med att inte röra vid microarray själv.
- Placera ett täckglas ovanpå microarray packning och tätning, försiktigt så att inte fälla några luftbubblor i microarray kammaren. Luftbubblor kan negativt påverka amplifieringseffektivitetenoch kan skapa artefakter eller brus i den efterföljande microarray bild.
3. Thermal Cycling
- När alla microarrays är laddade med provet hälls substrat på plana blocket termocykeln. Se till att den uppvärmda lock är aktiverat "Av". Utrustning erhållen från Akonni Biosystems är redan prequalified för användning. Annars är det mycket viktigt att kontrollera att den plana blocket värmecykeln (s) ger (s) enhetlig, konsekvent värme i alla microarray substrat.
- Öppna värmecykel programmet väljer du lämpligt program, skriv in "50 ^" för reaktionen volym, och påbörja körningen. Den termiska cykling protokollet som beskrivs här består av:
Termisk cykling Steps 1 88 ° C 5 min 2 88 ° C 30 sek 3 55 ° C 1 min 4 65 ° C 30 sek 5 Upprepa stegen (2-4) för 50 cykler 6 65 ° C 3 min 7 55 ° C 3 tim - Det totala antalet termiska cykler och 55 ° C efter amplifiering hålltid är oberoende variabler som användaren kan modifiera, såsom behövs eller är lämpligt för det specifika experimentet. Eftersom MDR-TB Master Mix skapar asymmetriska (främst enkelsträngade) amplikoner, är det oftast bra att inkludera fler cykler än vad som annars skulle kunna användas för en konventionell, exponentiell PCR-amplifiering protokoll.
- När termisk cykling och hybridisering program är klar, avsluta programmet, ta bort förstärknings microarrays, stäng programmet, och stäng av värmecykeln (s).
4. Tvätta och torka
- För att tvätta upp till 24 substrat samtidigt förbereda minst 250 ml 1x SSPE - 0,1% Triton X-100 tvättbuffert, och två containrar med minst 250 ml avjoniserat eller Milli-Q-grade vatten vardera. Tvättbufferten kan framställas i förväg.
- Ta försiktigt bort täckglas och packning från varje förstärkningsmicroarray kammare med platt-end pincett. Detta steg är den punkt där det finns störst risk för fysiskt skadliga gel elementgrupper. Använd lämpliga PCR kontaminationskontroller för att förhindra spridning av förstärkta nukleinsyror inom arbetsmiljön.
- Placera microarray substrat i en histologi diapositivhållaren, och placera alla bilder in i tvättkorgen som innehåller tvättbufferten. Täck behållaren med ett lock.
- Tvätta microarrays under 10 min vid rumstemperatur med försiktig omrörning.
- Doppa microarrays tre gånger vardera i två på varandra följande tvättar avjoniserat ellerMilli-Q-kvalitet vatten, och lufttorka.
5. Imaging
Den asymmetriska MDR-TB primerblandning genererar Cy3-märkta amplikoner. Gel elementet microarrays kan avbildas med en vanlig microarray imager kan imaging Cy3. Följande avbildning förfarande är specifik för MDR-TB Master Mix, Dx2100 fält bärbar kameran, och automatiserad analys programvara från Akonni.
- Kontrollera att Ethernet-kabeln från kameran är ansluten till datorn.
- Slå på kameran. Strömbrytaren är placerad på baksidan av instrumentet. Blå lysdioder på framsidan av kameran tänds när kameran slås på.
- Starta datorn.
- På datorns skrivbord, dubbelklicka på ikonen programvara för att starta automatiserad bildanalys programvara.
- Vänta på programvaran för att upprätta en anslutning till kameran kamera. När anslutningen är etablerad, blir knappen Analysera tillgängliga, ochmeddelandet "Connection Successful" visas i det nedre vänstra hörnet av skärmen.
- Sätt in den torkade förstärkningsmicroarray med microarray vänd bort från användaren, och mot objektivet. Om mikromatris är felaktigt orienterade med avseende på linsen och kameran, kommer den automatiska analysprogrammet misslyckas med att placera ett rutnät på fluorescensbild.
- Stäng luckan. En förhandsgranskningsbild kommer att finnas tillgänglig på datorskärmen.
- Välj MDR-TB analys script från rullgardinsmenyn och ange önskat Exponeringstid (i millisekunder). En typisk utgångspunkt för gel elementet amplifiering microarrays är 100-500 ms.
- Mättade bildpunkter kommer att visas på förhandsgranskningsbild i rött. Justera exponeringstiden för att minimera antalet av mättade pixlar inom individuella fläckar.
- Klicka på Analysera för att förvärva och analysera fluorescens bild. Programvaran kommer automatiskt att placera enMDR-TB-analysen specifik rutnät på bilden, extrahera integrerad intensitet och bakgrundsvärden, och rapportera läkemedelsresistens och genotypning resultat. Den automatiserade analysen tar normalt ett par sekunder. För utmanande bilder som innehåller repor, damm, fluorescerande artefakter eller fysiska skador på microarray funktioner kan programvaran behöva upp till en minut att slutföra analysen.
- När analysen är klar klickar du på Spara, välj mapp, skriv in ett filnamn och klicka på OK. Underliggande microarraydata sparas som en. Xls-fil och kan exporteras för off-line analyser, om så önskas.
- När analysen är klar, ta bort förstärkningen microarray från kameran, och klicka på Ny för att initiera nästa analys.
- När du är klar att samla in data, stänga programmet, stänga av datorn, och stäng av kameran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitativ bildanalys kan ge insikt i källor experimentell ljud eller en förändring som är utmanande att identifiera i datatabeller genereras av automatiserad bildanalys programvara. Således kan det vara bra att visuellt kontrollera att 1) alla gel element är intakta och oskadade, 2) den globala bakgrunden är fri från fluorescerande artefakter som kan påverka enskilda signal-brusförhållande (SNR) värden, 3) finns det inga belägg för bubbelbildning eller icke enhetlig förstärkning / hybridisering över arrayen, och 4) att programvaran korrekt identifierat alla fläckar på microarray bild. Exempel MDR-TB-förstärkning microarray bilderna visas i figur 1, som illustrerar en högkvalitativ samling och artefakter som kan uppstå på grund av fysiska skador eller bubblor under termisk cykling. Standardmicroarray bildanalys programvara brukar kunna placera ett galler och extrahera integrerad intensitet och bakgrundsuppgifter även från dålig kvalitet bilder som shegna i figur 1B, så det åligger forskaren att fastställa kriterier för kvalitetskontroll och mått för att acceptera eller avvisa microarray bilder från vidare analys. Probe redundans kan hjälpa lindra dessa problem. Däremot skulle en helt automatiserad, diagnostisk MDR-TB-förstärkning microarray rapportering algoritm annars förklara testet från figur 1B som "ogiltig".
Amplifiering microarray SNR-värden för en utspädningsserie av vildtyp H37Ra genomisk DNA visas i tabell 2. Vid 6,25 pg ingång iskt DNA per reaktion, eller ca 1,25 x 10 3 cellekvivalenter är alla vildtyp sonder lätt detekteras. SNR-värden för var och en av de inre förstärk och hämnings kontroller varierade från 98.48 (rpoB) till 967,24 (Akonni tillförsel intern positiv kontroll), vilket indikerar att alla genen mål i den asymmetriska multiplex amplifieringsreaktionen förstärks och detekteras. Ingenmall kontroller var negativa (SNR <3) för alla givare i förstärkningsmicroarray. Genotypning mått vid 6,25 pg input DNA varierade från 0,18 till 1,00 för alla WT / MU probpar, vilket visar korrekt beteende av WT och MU prober och lämpliga genotypning.
Representativa genotypning data för en panel av Världshälsoorganisationen referensisolat av känd genotyp visas i tabell 3. Om en single nucleotide polymorphism (SNP) är representerad på gelen elementet microarray, då förstärkningen microarray testet upptäcker exakt motsvarande mutationen i MDR -TB genomet. En del av förstärkmicroarray sonder är också känsliga för nästan granne mutationer som inte uttryckligen representerade på matrisen som en unik sond. Exempelvis isolera TDR-0129 innehåller en S531E mutation i rpoB-genen, men det finns inte en specifik sond på amplifiering microarray för S531E. Trots fem andra SNP sonder targeting kodon 531 indikerar att en mutation är närvarande vid kodon 531 - förstärkningen microarray därför indikerar korrekt att detta isolat är rifampicin resistent. Liknande känslighet för rpoB S513W mutationen är uppenbart för isolat TDR-0148. Å andra sidan, vissa SNP sonder är inte känsliga för nära granne mutationer, vilket illustreras av isolat TDR-0148 och rpoB S512G mutationen, och isolera TDR-0011 och katG S315R mutationen. Vi misstänker att den här typen av sond beteende är en följd av sekundär och tertiär struktur i enkelsträngat amplicon och / eller sond 34, och är inte något som kan förutsägas på förhand. Ändå är analog med användningen av slarviga molekylära fyrar för att upptäcka flera drogresistensmutationer med en minimal uppsättning av realtids-PCR sonder 35,36 sond känslighet för nära granne mutationer, och kan vara diagnostiskt fördelaktig förutsättning testet genererar inte falska positiva förhållanTIVA fenotypisk drogkänslighet.
Figur 1. (A) Exempel förstärkning microarray bild till 100 pg vildtyp M. tuberculosis H37Ra iskt DNA och en 100 ms exponeringstid. Cy3 fyrar (för automatisk gridding och segmente programvara) är i utkanten av bilden. (B) Bild av en förstärkningsmicroarray visar en fluorescerande gloria artefakt till följd av bubbelbildning under termisk cykling, och skadade gel element / skräp. Automatiserad bildanalys programvara är fortfarande kunna placera ett galler och extrahera data från den här bilden. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
| Company | Katalognummer |
| Akonni Biosystems | Fråga |
| Qiagen | # 206143 |
| Qiagen | # 201207 |
| Qiagen | # 206143 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP227-500 |
| Sigma-Aldrich | # 3B6917 |
| Akonni Biosystems | Fråga |
| Akonni Biosystems | Fråga |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP1328-4 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP151-500 |
| Aktuella Technologies, Inc. | # BRSPRAY128 |
| Decon Labs, Inc. | # 8416 |
| Company | Katalognummer |
| Akonni Biosystems | 100-20011 |
| 100-10021 | |
| ArrayIt | HTW |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # 10-300 |
| VWR | # 3365040 |
| VWR | # 93000-196 |
| Central Pneumatisk | # 95630 |
Tabell 2. Material som behövs och utrustning.
| Kodon | Probe ID | WT Probe SNR Värden | 500 pg | 100 pg | 50 pg | 25 pg | 12,5 pg | 6,25 pg | |||||||
| rpoB | 507 | 1 | 900,22 | 644,46 | 523,17 | 431,08 | 364,49 | 287,47 | |||||||
| 3 | 1016,37 | 699,38 | 600,16 | 525,07 | 446,51 | 361,64 | |||||||||
| 511 | 5 | 867,67 | 611,97 | 529,90 | 451,73 | 403,76 | 307,68 | ||||||||
| 512 | 8 | 810,69 | 544,04 | 488,85 | 436,89 | 391,62 | 257,46 d> | ||||||||
| 513 | 11 | 824,36 | 547,04 | 496,00 | 472,01 | 408,96 | 242,25 | ||||||||
| 515 | 15 | 715,48 | 536,59 | 416,96 | 335,81 | 267,48 | 189,10 | ||||||||
| 516 | 17 | 723,83 | 496,44 | 402,95 | 69 "> 329,09270,10 | 201,98 | |||||||||
| 522 | 27 | 674,37 | 413,33 | 360,40 | 316,75 | 236,19 | 153,40 | ||||||||
| 524 | 29 | 269,46 | 153,69 | 117,71 | 118,02 | 110,13 | 51,22 | ||||||||
| 526 | 31 | 136,37 | <td class = "xl69"> 109.9082,63 | 76,76 | 53,61 | 37,76 | |||||||||
| 531 | 44 | 219,92 | 136,31 | 109,16 | 96,18 | 80,58 | 26,44 | ||||||||
| 533 | 51 | 130,54 | 83,60 | 76,03 | 63,47 | 61,35 | 41,54 | ||||||||
| rpsL | = "Xl71"> 43 | 54 | 10,41 | 12,75 | 53,30 | 767,18 | 5,39 | 362,42 | |||||||
| 88 | 56 | 655,54 | 542,79 | 527,43 | 690,34 | 403,86 | 456,05 | ||||||||
| katG | 315 | 58 | 1037,03 | 873,46 | tfn: ingen "> 816,64974,83 | 811,79 | 876,47 | ||||||||
| embB | 306 | 66 | 940,81 | 781,13 | 788,75 | 837,65 | 787,05 | 696,69 | |||||||
| Inha | 8 | 82 | 1069,43 | 934,38 | 862,58 | 936,88 | 809,85 | 682 0,56 | |||||||
| 15 | 85 | 1111,66 | 931,88 | 918,22 | 957,87 | 795,72 | 723,16 | ||||||||
| 17 | 87 | 1114,49 | 926,03 | 920,60 | 970,70 | 854,15 | 744,41 | ||||||||
Tabell 3. Signal till brusförhållanden för vildtyp sonder och en spädningsserie av M. tuberculosis H37Ra iskt DNA. SNR-värden> 3 anses upptäckas.
ntent "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Tabell 4. Representativa genotypning data från MDR-TB-isolat av känd genotyp vid 25 pg per förstärkningsmicroarray reaktion. Asterisker identifiera mutationer som inte representeras av en unik sond på gelen elementet microarray. WT = vildtyp nukleinsyrasekvens. Negativa värden (fetstil och skuggade) är tecken på en mutation, alltså fenotypisk drogresistens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattningen av multiplexeringen med en förstärkningsmicroarray slutligen dikteras av effektiviteten i multiplex asymmetrisk PCR, ej microarray. Enligt vår erfarenhet kan 10-12 unika primerpar lätt multiplexeras i en förstärkningsmicroarray-format. Konventionella primer och sond konstruktionskriterier gäller därför nya analyser, förutom att man också måste beakta potentiella interaktioner mellan lösning-fas nukleinsyror och immobiliserade microarray sonder, den termiska verkningsgraden hos termocykeln, och sondhybridisering beteende i en PCR-buffert som också innehåller PCR-primers och låga vikt amplifiering artefakter molekyl. Mycket multiplexade amplifiering metoder som hela genom förstärkning främjar inte en enda kammare förstärkning microarray protokoll för ett antal tekniska skäl, bland annat störningar mellan slumpmässiga hexamerer och immobiliserade prober, och ineffektiv hybridisering av långa, dubbelsträngade amplikoner. Detär också en inbördes förhållandet mellan enkel-i-bruk, total analystid och detektionsgränser som enskilda användare kommer att behöva tänka på när man utformar egna analyser eller med hjälp av MDR-TB-test som beskrivs här. Till exempel kommer en minskning av antalet amplifieringscykler och med eliminera den post-amplifiering hybridiseringssteget avsevärt minska den totala analystiden, men på bekostnad av provkänslighet. Å andra sidan, kan uppnå en reproducerbar 10 gen gräns kopia upptäckt kräver fler amplifieringscykler eller hybridisering tid, och därigenom förlänga den totala analystiden längre än ett enda arbetspass.
Generna, mutationer, Imager, analysprogram och rapportering algoritm beskrivs här illustrerar förstärkningsmicroarray metod och system, snarare än en rapport om deras analytiska prestanda och klinisk nytta. Till exempel kan den starta provet vara sputum, saneras sediment, fast-eller flytande kulturer - kravetför förstärkning microarray är helt enkelt att de extraherade nukleinsyror är förstärkningsbar med asymmetrisk, multiplex PCR. Vissa forskare eller kliniker kan finna lite att ingen kliniskt värde i att upptäcka rpsL eller embB mutationer som ger resistens mot streptomycin och etambutol, respektive, endast resistens mot rifampicin och isoniazid definierar MDR-TB. Sålunda kan dessa PCR-primers och microarray prober ersättas med primrar och prober som riktar gener och mutationer som ger resistens mot andra första eller andra linjens antibiotika. Det är möjligt att skriva en rapport algoritm för att förse användaren med detaljerad information om de specifika mutationer som upptäcks i ett givet prov, snarare än ett enkelt "motstånd upptäckt" eller "motstånd inte upptäcks" resultat. För de forskare som är intresserade av att använda denna specifika analys för att analysera M. tuberculosis-isolat, är det också möjligt att tillhandahålla de genotyping data även om IS6110-elementet är inte detected i provet.
Oavsett de möjliga analys och rapportering permutationer är förstärkningsmicroarray och protokoll som beskrivs här utformade för att avsevärt förenkla microarray arbetsflödet genom att kombinera flera molekylärbiologiska steg till en enda biokemisk reaktion och mikroflödeskammare. De representativa data visar effekten av strategin genom att förstärka nio MDR-TB iska regioner och upptäcka de asymmetriska amplikoner med en låg densitet gel elementet microarray. Protokollet som beskrivs här använder en bulk tvättförfarande som kräver att användaren fysiskt ta bort packningen och locket glida ur förstärkningsmicroarray före tvätt, och är därför lämpligare för forskning-bruk-bara applikationer snarare än klinisk diagnostik. Såsom beskrivits på annat ställe, men det är säkert möjligt att införliva ett tvättsteg på-chip med lateralt flöde fluidics 33 och därför behålla en helt sluten amplikon konsumerbar, inkluding en som lätt kan införlivas i ett prov-angående ut diagnostiskt system som är lämpligt för point-of-care tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) i bidrags RC3 AI089106.
MDR-TB nukleinsyror lämnades av FN: s barnfond / FN: s utvecklingsprogram / Världsbanken / Världshälsoorganisationen särskilda program för forskning och utbildning om tropiska sjukdomar (TDR), Genève, Schweiz.
Vi tackar Dr Tom Shinnick av US Centers for Disease Control and Prevention för vägledning om de specifika gener och mutationer som ska ingå i prototypen analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
