Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados em ambientes com recursos mais baixos.
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Artigo de método
Demonstrando um multi-resistente
Neste artigo
Resumo
Resumo
Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de MDR-TB diagnósticos baseados em microarray que podem ser rotineiramente usados em ambientes com recursos mais baixos. Um microarray amplificação combina amplificação PCR assimétrico, a seleção tamanho do alvo, rotulagem alvo, e hibridização microarray dentro de uma única solução e em uma única câmara microfluídicos. Um método de processamento em lote é demonstrada com uma mistura mestre assimétrica 9-plex e baixa densidade elemento gel microarray para a genotipagem da multi-droga resistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). O protocolo aqui descrito pode ser concluída em 6 horas e fornecer genotipagem correcta com, pelo menos, 1.000 equivalentes de células de ADN genómico. A incorporação no chip passos de lavagem é possível, o que irá resultar num método amplicão totalmente fechada e sistema. O grau de multiplexagem, com um microarray de amplificação é relacionada ao número de pares de iniciadores que podem ser combinados num único mestre mix e ainda atingir a sensibilidade desejada e as métricas de desempenho especificidade, em vez do número de sondas que são imobilizados na matriz. Do mesmo modo, o tempo total de análise pode ser reduzido ou aumentado, dependendo do uso específico a que se destinam, questão de pesquisa, e limites desejados de detecção. No entanto, a abordagem geral agiliza significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final, reduzindo o número de etapas de processamento manualmente intensivos e demorados, e fornece um caminho bioquímico e microfluídicos simplificado para traduzir diagnósticos baseados em microarrays para a prática clínica de rotina.
Introdução
Detecção precoce de casos e tratamento rápido são consideradas as estratégias de controle mais eficazes para reduzir o Mycobacterium tuberculosis (MTB) Transmissão 1, e agora há um amplo consenso na comunidade TB que um ponto de atendimento (POC) ou próximo teste POC para diagnosticar simultaneamente TB e resistência a drogas (DR) é necessária. Tecnologias como GeneXpert de Cepheid e outros testes de amplificação de ácidos nucleicos reduzir o tempo de diagnóstico para muitos pacientes com TB, e proporcionar uma leitura rápida, indicando resistência à rifampicina ou mutações que conferem resistência selecionados para outros de primeira ou segunda l....
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Protocolo
Para laboratórios que seguem as precauções universais de PCR, é operacionalmente mais eficiente para incluir várias microarrays de amplificação e juntas por substrato e lavar todos os microarrays de amplificação simultaneamente em um recipiente a granel, como descrito aqui. Formatos de consumo estão disponíveis para a realização de pós-amplificação etapas de lavagem microarray em um totalmente selado, teste amplicon fechado, como relatado em outros lugares 30,33.
1. Setup
- Extrair e purificar ácidos nucléicos a partir da amostra em condições de biossegurança adequadas, com método de escolha. O requisito é que os ácido....
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Resultados
Análise de imagem qualitativa pode fornecer informações sobre as fontes de ruído experimental ou variabilidade que são difíceis de identificar em tabelas de dados gerados pelo software automatizado de análise de imagem. Assim, ele pode ser útil para determinar visualmente que 1) todos os elementos de gel estão intactos e não danificado, 2) o fundo global é livre de artefactos fluorescentes que podem afectar o sinal individual de valores de ruído (SNR), 3), não há evidência de formação de bolhas ou não uniforme amplifica.......
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Discussão
O grau de multiplexagem, com um microarray de amplificação é, em última análise ditada pela eficácia do multiplex PCR assimétrica, não o microarray. Em nossa experiência, 10-12 pares de primers exclusivos podem ser facilmente multiplexados em um formato amplificação microarray. Critérios de primers e sonda de design convencionais, portanto, aplicar-se a novos testes, a não ser que a pessoa também precisa considerar possíveis interações entre os ácidos nucléicos em fase de solução e sondas de microarranjo imobilizados, a.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH), sob concessão RC3 AI089106.
MDR-TB ácidos nucléicos foram fornecidos por / Programa das Nações Unidas Programa Fundo / United Nations Development do Banco Mundial / Organização Mundial da Saúde Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais (TDR), Genebra, Suíça.
Agradecemos ao Dr. Tom Shinnick dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças para orientação sobre os genes e mutações específicas para incluir no ensaio do protótipo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microarrays de amplificação MDR-TB, com junta aplicada e lamínulas pré-cortadas | Akonni Biosystems | Inquire | |
| , contendo tampão de PCR 2X com HotStar Taq mais | Qiagen | #206143 | |
| Taq polimerase | Qiagen | #201207 | |
| água livre de RNAse | Qiagen | #206143 | |
| Formamida | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 albumina de soro bovino não acetalisada (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X mistura de primer concentrado MDR-TB | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplificação e controle de inibição | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Spray Desinfetante | Tecnologias Atuais, Inc. | ||
| Álcool isopropílico 70% | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Gerador de imagens de microarray, com software automatizado de análise de imagem e dados | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Termociclador com inserção de bloco plano | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| Estação de lavagem de alto rendimento e suporte de lâmina | ArrayIt | HTW | |
| Pinça de dissecação | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrífuga | VWR | #93000-196 | |
| Kit Compressor de Aerógrafo | Central Pneumática | #95630 |
Referências
- Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40(2010).
- World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al.
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Reimpressões e permissões
