Demonstration av en multiresistent<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Amplification Microarray
Summary
En förstärkning microarray kombinerar asymmetrisk PCR-förstärkning och microarray-hybridisering till en enda kammare, som avsevärt effektiviserar microarray arbetsflödet för slutanvändaren. Förenkla microarray arbetsflödet är ett nödvändigt första steg för att skapa microarray-baserad diagnostik som kan rutinmässigt används i miljöer med lägre resurs.
Abstract
Förenkla microarray arbetsflödet är ett nödvändigt första steg för att skapa MDR-TB microarray-baserad diagnostik som kan rutinmässigt används i miljöer med lägre resurs. En förstärkning microarray kombinerar asymmetrisk PCR-amplifiering, målstorlek val, mål-märkning, och microarray-hybridisering i en enda lösning och i en enda mikroflödeskammare. Ett parti bearbetningsmetod demonstreras med en 9-Plex asymmetrisk Master Mix och låg densitet gel elementet microarray för genotypning multiresistent Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). Protokollet som beskrivs här kan fyllas i 6 timmar och ge korrekt genotypning med minst 1.000 cellekvivalenter av genomiskt DNA. I förening med on-chip tvättstegen är möjligt, vilket kommer att resultera i en helt sluten amplikon förfarande och system. Omfattningen av multiplexering med en förstärkningsmicroarray är ytterst begränsad av antalet primerpar som kan kombineras till en enda huvud mix och ändå uppnå önskad känslighet och specificitet prestandamått, snarare än antalet prober som är immobiliserade på matrisen. På samma sätt kan den totala analystiden förkortas eller förlängas, beroende på den specifika avsedda användningen, forskningsfråga, och önskade detektionsgräns. Trots den allmänna strategin effektiviserar avsevärt microarray arbetsflödet för slutanvändaren genom att minska antalet manuellt intensiva och tidskrävande processteg, och ger en förenklad biokemisk och mikroflödesbana för att översätta microarray-baserad diagnostik i klinisk vardag.
Introduction
Tidig fall upptäckt och snabb behandling anses vara de mest effektiva styrstrategier för att minska Mycobacterium tuberculosis (MTB) överföring 1, och det finns nu en bred enighet i TB gemenskap som en punkt av omsorg (POC) eller i närheten av POC-test för att samtidigt diagnostisera tbc och det krävs läkemedelsresistens (DR). Tekniker som Cepheid s Genexpert och andra nukleinsyraamplifiering tester minska tiden till diagnos för många TB-patienter, och ger en snabb avläsning indikerar resistens mot rifampicin eller valda mutationer som ger resistens mot andra första eller andra linjens läkemedel 2. Även realtid och isoterm nukleinsyraamplifiering tester är utformade för att identifiera drogresistensmutationer som leder till MDR-TB, är det spektrum av mutationer som de upptäcker ofta otillräckliga för att utforma en individualiserad medicinering motsvarar läkemedelsresistens profilen hos patienten, och tekniska begränsningar som rörtill optisk överhörning eller komplexiteten i förstärknings-och rapporterings kemier 3-7 Maj begränsa antalet loci eller mutationer som upptäcks. Således är detektionstekniker med högre multiplexering kapacitet som krävs för att åtgärda kända luckor i MDR-TB POC diagnostik.
Microarrays och WHO-godkända Hain linjeprobanalyser kan ta itu med "multipel genen, multipla mutationer" utmaningen att diagnostisera MDR-TB 8-29. Tyvärr är dessa hybridisering-baserade, multiplex plattformar upptäckt använder flerstegs, komplicerade, och öppen-Amplicon protokoll som kräver betydande utbildning och kunskaper i molekylära tekniker. Förstärkningsmicroarray 30 var utformad för att ta itu med några av dessa microarray arbetsflödet och operativa frågor. De förenklar fluidic principerna är att utveckla, hybridisera, och upptäcka nukleinsyramål inom en enda mikroflödeskammare. Användaren introducerar nukleinsyra och amplifiering master blanda in en fluidic kammare med en pipett och startar termisk cykling protokollet. För satsvis bearbetningsmetod som visas här, är microarrays tvättades därefter i bulklösning, torkades och avbildas. Denna studie visar funktionaliteten hos en förstärkningsmikromatris med användning av en multiresistent tuberkulos microarray testet för rpoB (30 mutations), katG (två mutationer), Inha (4 mutationer), rpsL (två mutationer), embB (en mutation), IS1245, IS6110 och en inre förstärkning och hybridisering kontroll. Minst ett matchat par av microarray sonder (vildtyp (WT) och single-nukleotid mutant (MU)) ingår för varje mutation av intresse. Renade nukleinsyror från multiresistent M. tuberkulos är från TDR Tuberkulos Strain Bank 31. Gel elementet microarrays tillverkas på glassubstrat genom sampolymerisation i huvudsak som beskrivs på annan plats 32, förutom att vi använder 4% monomer och 0,05 mM varje sond i polymerization blandningen. Arrayer är omgivna med en 50 ml packning före användning. Efter termisk cykling, hybridisering och tvättsteg, är amplifiering microarrays avbildas på en Akonni portabel analysator. Bakgrund-korrigerad, integrerade signalintensiteter erhålls från den råa. Tif bilder med hjälp av en fast cirkel algoritm. Buller för varje gel del beräknas som tre gånger standardavvikelsen för de lokala spot bakgrunder. Genmål vanligtvis anses detekterbar för signal-brusförhållande (SNR) värden ≥ 3. I syfte att fastställa närvaro eller frånvaro av en specifik mutation i varje gen eller kodon används en diskriminantanalys förhållandet beräknades från SNR-värden som (WT-MU) / (WT + MU). Diskriminantanalys kvoter <0 är indikativa för en läkemedelsresistensmutation vid lokuset, medan Förhållanden> 0 är indikativa för vildtypssekvensen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfattningen av multiplexeringen med en förstärkningsmicroarray slutligen dikteras av effektiviteten i multiplex asymmetrisk PCR, ej microarray. Enligt vår erfarenhet kan 10-12 unika primerpar lätt multiplexeras i en förstärkningsmicroarray-format. Konventionella primer och sond konstruktionskriterier gäller därför nya analyser, förutom att man också måste beakta potentiella interaktioner mellan lösning-fas nukleinsyror och immobiliserade microarray sonder, den termiska verkningsgraden hos termocykeln, och …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) i bidrags RC3 AI089106.
MDR-TB nukleinsyror lämnades av FN: s barnfond / FN: s utvecklingsprogram / Världsbanken / Världshälsoorganisationen särskilda program för forskning och utbildning om tropiska sjukdomar (TDR), Genève, Schweiz.
Vi tackar Dr Tom Shinnick av US Centers for Disease Control and Prevention för vägledning om de specifika gener och mutationer som ska ingå i prototypen analysen.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
