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Abstract
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Immunology and Infection

एक बहु दवा प्रतिरोधी दिखाते<em> माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em> प्रवर्धन माइक्रोएरे

Published: April 25, 2014
doi:
10.3791/51256
, , , , , , ,
1Akonni Biosystems, Inc.

Summary

एक प्रवर्धन माइक्रोएरे काफी अंत उपयोगकर्ता के लिए माइक्रोएरे कार्यप्रवाह streamlines जो एक ही कक्ष में असममित पीसीआर प्रवर्धन और माइक्रोएरे संकरण को जोड़ती है. माइक्रोएरे कार्यप्रवाह सरल नियमित कम संसाधन वातावरण में इस्तेमाल किया जा सकता है कि माइक्रोएरे आधारित निदान बनाने के लिए एक आवश्यक पहला कदम है.

Abstract

माइक्रोएरे कार्यप्रवाह सरल नियमित कम संसाधन वातावरण में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एमडीआर टीबी माइक्रोएरे आधारित निदान बनाने के लिए एक आवश्यक पहला कदम है. एक प्रवर्धन माइक्रोएरे एक समाधान के भीतर और एक microfluidic चेंबर में असममित पीसीआर प्रवर्धन, लक्ष्य आकार चयन, लक्ष्य लेबलिंग, और माइक्रोएरे संकरण को जोड़ती है. एक बैच प्रसंस्करण विधि बहु – दवा प्रतिरोधी माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमडीआर टीबी) जीनोटाइपिंग के लिए एक 9 परिसर असममित मास्टर मिश्रण और कम घनत्व जेल तत्व माइक्रोएरे के साथ प्रदर्शन किया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 6 घंटा में पूरा किया और जीनोमिक डीएनए के कम से कम 1,000 सेल समकक्ष के साथ सही जीनोटाइपिंग प्रदान किया जा सकता है. पर चिप धोने कदम शामिल एक पूरी तरह से बंद amplicon विधि और प्रणाली में जो परिणाम होगा, संभव है. एक प्रवर्धन माइक्रोएरे साथ बहुसंकेतन की हद अंततः एक मास्टर एम में जोड़ा जा सकता है कि प्राइमर जोड़े की संख्या से विवश हैनौवीं और अभी भी बल्कि सरणी पर स्थिर रहे हैं कि जांच की संख्या की तुलना में वांछित संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदर्शन मेट्रिक्स, को प्राप्त करने. इसी तरह, कुल विश्लेषण समय विशिष्ट उद्देश्य का उपयोग, अनुसंधान सवाल है, और पता लगाने के लिए वांछित सीमा के आधार पर छोटा या lengthened किया जा सकता है. फिर भी, सामान्य दृष्टिकोण काफी मैन्युअल रूप से गहन और समय लेने वाली प्रसंस्करण कदम की संख्या को कम करने से अंत उपयोगकर्ता के लिए माइक्रोएरे कार्यप्रवाह streamlines, और नियमित नैदानिक ​​व्यवहार में माइक्रोएरे आधारित निदान के अनुवाद के लिए एक सरल जैव रासायनिक और microfluidic रास्ता प्रदान करता है.

Introduction

जल्दी मामले का पता लगाने और तेजी से उपचार माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमटीबी) संचरण 1 कम करने के लिए सबसे प्रभावी नियंत्रण रणनीति पर विचार किया, और देखभाल (पीओसी) की या पीओसी परीक्षण के निकट एक बिंदु एक साथ टीबी का निदान करने के लिए कि टीबी समुदाय में एक व्यापक सहमति वहाँ अब कर रहे हैं और दवा प्रतिरोध (डा.) की जरूरत है. ऐसे Cepheid के GeneXpert और अन्य न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण के रूप में प्रौद्योगिकियों के कई टीबी रोगियों के लिए निदान के लिए समय कम है, और rifampin या अन्य पहली या दूसरी लाइन ड्रग्स 2 के लिए प्रतिरोध प्रदान चयनित परिवर्तन करने के लिए प्रतिरोध का संकेत एक तेजी से पढ़ने के लिए बाहर प्रदान करते हैं. वास्तविक समय और इज़ोटेर्माल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण एमडीआर टीबी के लिए नेतृत्व कि दवा प्रतिरोध म्यूटेशनों की पहचान करने के लिए डिजाइन कर रहे हैं, वे पता लगाने के परिवर्तन के स्पेक्ट्रम, रोगी की दवा प्रतिरोध प्रोफाइल को इसी एक individualized दवा आहार डिजाइन करने के लिए अक्सर अपर्याप्त है और संबंधित तकनीकी बाधाओंऑप्टिकल पार से बात या प्रवर्धन और रिपोर्टिंग chemistries की जटिलता को 3-7 loci या पता चला रहे हैं कि परिवर्तन की संख्या सीमित कर सकता है. इस प्रकार, उच्च बहुसंकेतन क्षमता के साथ प्रौद्योगिकियों का पता लगाने एमडीआर टीबी पीओसी निदान में जाना जाता अंतराल को संबोधित करने के लिए आवश्यक हैं.

प्रोटीन और डब्ल्यूएचओ का समर्थन किया हैं लाइन जांच assays एमडीआर टीबी 8-29 निदान की "कई जीन, कई म्यूटेशनों" चुनौती का पता कर सकते हैं. दुर्भाग्य से, इन संकरण आधारित, मल्टिप्लेक्स पता लगाने प्लेटफार्मों Multistep, जटिल, और आणविक तकनीक में महत्वपूर्ण प्रशिक्षण और दक्षता की आवश्यकता है कि खुले amplicon प्रोटोकॉल का उपयोग करें. प्रवर्धन माइक्रोएरे 30 इन माइक्रोएरे काम के प्रवाह और परिचालन संबंधी चिंताओं का कुछ पता करने के लिए डिजाइन किया गया था. सरल बनाने fluidic सिद्धांतों, बढ़ाना संकरण, और एक microfluidic कक्ष के भीतर न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य का पता लगाने के लिए कर रहे हैं. उपयोगकर्ता न्यूक्लिक एसिड और प्रवर्धन मास का परिचयआतंकवाद एक विंदुक के साथ एक fluidic चेंबर में मिश्रण और थर्मल साइकिल प्रोटोकॉल शुरू होता है. यहाँ दिखाया बैच प्रसंस्करण विधि के लिए, प्रोटीन बाद में, थोक समाधान में धोया सूखे, और imaged हैं. इस अध्ययन rpoB के लिए एक एमडीआर टीबी माइक्रोएरे परीक्षण (30 म्यूटेशन), katG (2 उत्परिवर्तन), Inha (4 म्यूटेशन), rpsL (2 उत्परिवर्तन), embB (1 उत्परिवर्तन), IS1245, IS6110 का उपयोग कर एक प्रवर्धन माइक्रोएरे की कार्यक्षमता को दर्शाता है , और एक आंतरिक प्रवर्धन और संकरण नियंत्रण. माइक्रोएरे जांच (wildtype (WT) और एकल nucleotide उत्परिवर्ती (यू)) के कम से कम एक जोड़ी मिलान ब्याज की प्रत्येक उत्परिवर्तन के लिए शामिल है. बहु – दवा प्रतिरोधी एम. से शुद्ध न्यूक्लिक एसिड तपेदिक टीडीआर क्षय रोग तनाव बैंक 31 से कर रहे हैं. कहीं 32 में वर्णित के रूप में जेल तत्व प्रोटीन हम polymeriz में हर जांच 4% monomer और 0.05 मिमी का उपयोग, सिवाय इसके कि अनिवार्य रूप से copolymerization द्वारा ग्लास substrates पर निर्मित कर रहे हैंव्यावहारिक मिश्रण. सारणियों का उपयोग करने से पहले एक 50 मिलीलीटर गैस्केट से घिरे हुए हैं. थर्मल साइकिल, संकरण, और धोने के कदम के बाद, प्रवर्धन प्रोटीन एक Akonni पोर्टेबल विश्लेषक पर imaged हैं. पृष्ठभूमि सही, एकीकृत संकेत तीव्रता कच्चे से प्राप्त कर रहे हैं. एक निश्चित सर्कल कलन विधि का उपयोग TIF छवियाँ. प्रत्येक जेल तत्व के लिए शोर स्थानीय मौके पृष्ठभूमि के तीन बार मानक विचलन के रूप में गणना की है. शोर अनुपात (SNR) के लिए संकेत के लिए ≥ 3 मूल्यों जीन लक्ष्य आमतौर पर detectable माना जाता है. प्रत्येक जीन या कोडोन में एक विशिष्ट उत्परिवर्तन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए, एक विभेदक अनुपात (WT-यू) / (गुम्मट + यू) के रूप में SNR मूल्यों से गणना की है. विभेदक अनुपात 0 जंगली प्रकार के अनुक्रम का संकेत कर रहे हैं <अनुपात जबकि 0, ठिकाना पर एक दवा प्रतिरोध उत्परिवर्तन का संकेत कर रहे हैं>.

Protocol

यूनिवर्सल पीसीआर सावधानियों का पालन कि प्रयोगशालाओं के लिए, यह कई प्रवर्धन प्रोटीन और सब्सट्रेट प्रति गास्केट में शामिल हैं और यहां वर्णित के रूप में, एक थोक कंटेनर में एक साथ सभी प्रवर्धन प्रोटीन धो?…

Representative Results

गुणात्मक विश्लेषण छवि स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न डेटा तालिकाओं में पहचान करने के लिए चुनौती दे रहे हैं कि प्रयोगात्मक शोर या परिवर्तनशीलता के स्रोतों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर…

Discussion

एक प्रवर्धन माइक्रोएरे साथ बहुसंकेतन की हद अंततः मल्टीप्लेक्स असममित पीसीआर की दक्षता, नहीं माइक्रोएरे से निर्धारित होता है. हमारे अनुभव में, 10-12 अद्वितीय प्राइमर जोड़े आसानी से एक प्रवर्धन माइक्रोए?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम अनुदान RC3 AI089106 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित किया गया.

एमडीआर टीबी न्यूक्लिक एसिड उष्णकटिबंधीय रोगों (टीडीआर), जिनेवा, स्विट्जरलैंड में अनुसंधान एवं प्रशिक्षण के लिए संयुक्त राष्ट्र बाल कोष / संयुक्त राष्ट्र विकास कार्यक्रम / विश्व बैंक / विश्व स्वास्थ्य संगठन का विशेष कार्यक्रम द्वारा प्रदान किया गया.

हम प्रोटोटाइप परख में शामिल करने के लिए विशिष्ट जीन और परिवर्तन पर मार्गदर्शन के लिए रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए अमेरिकी केंद्र के डॉ. टॉम Shinnick धन्यवाद.

Materials

MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Equipment Company  Catalog Number 
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630
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References

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Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).
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