Summary
Мы опишем протокол для изучения развития опиоидной индуцированных гипералгезии и толерантности у мышей. На основе измерения тепловых и механических ноцицептивных реакций наивных и морфина обработанных животных, он позволяет количественно оценить увеличение болевой чувствительности (гипералгезии) и снижение обезболивания (допуска), связанного с хронической администрации опиатов.
Abstract
Опиоидной индуцированных гипералгезии и толерантность серьезно повлиять клиническую эффективность опиатов как болеутоляющих у животных и человека. Молекулярные механизмы, лежащие в основе обоих явлений не до конца понятны и их выяснение должны получать выгоду от изучения животных моделях и от дизайна соответствующих экспериментальных протоколов.
Мы описываем здесь методологический подход для индукции, записи и количественной морфина вызванной гипералгезию а также для подтверждающие обезболивающее терпимости, используя хвост-погружения и хвост испытания давлением у мышей дикого типа. Как показано на видео, протокол разделен на пять последовательных шагов. Обработка и привыкания фазы обеспечивают безопасный определение базальной ноцицептивной реакции животных. Хроническое введение морфина вызывает значительное гипералгезии, как показано увеличением как тепловой и механической чувствительности, тогда как сравнение анальгезии временных курсов после острого или агентeated лечение морфин ясно указывает на развитие толерантности проявляется снижением амплитуды обезболивающего ответа. Этот протокол может быть аналогичным образом приспособлены к генетически модифицированных мышей, чтобы оценить роль отдельных генов в модуляции ноцицепции и морфина обезболивания. Она также обеспечивает модельную систему для расследования эффективности потенциальных терапевтических агентов для улучшения опиатов обезболивающее эффективность.
Introduction
Опиоидной индуцированных гипералгезии (OIH) и толерантность анальгетик ограничить клиническую эффективность опиатов в животных и человека 1-3. Участие провоспалительных 4,5 или про-ноцицептивных (анти-опиоидных) 6,7 систем в настоящее время изучены гипотез. Выяснение механизмов, лежащих OIH и терпимости требуется совместное использование в естественных условиях и в подходах пробирке, используя соответствующие животные модели, экспериментальные протоколы и молекулярных инструментов.
Поведенческая фармакология является доминирующей парадигмой для мониторинга и количественной обезболивающее и повышенной болевой состояния в лабораторных животных (крыс, мышей). Применение болевые раздражители (термических, механических или химических) в удобной части тела (заднюю лапу, хвост) животного приводит к nocifensive вывода, которые могут быть легко забили.
Мы предлагаем здесь методологический подход для стимулирования, учета и количественного OIH итолерантность в мышей дикого типа, используя хвост-погружения и хвост испытания давлением. Процедура позволяет легко, чувствительный и воспроизводимый определение тепловых и механических ноцицептивных значений отклика у мышей. Как показано в протоколе видео, C57BL / 6 мышей испытывают значительные гипералгезии после хронического введения морфина и поддерживать этот течение нескольких дней. Оба тепловые и механические ноцицептивных значения значительно уменьшается, по сравнению с исходными измерений на наивных животных. Кроме того, наша Экспериментальная установка позволяет контролировать, в дополнение к разработке OIH, упадка ответ обезболивающее к морфину (терпимости). Представленные данные подтверждают мнение, что гипералгезии и терпимость может привлечь общие клеточные и молекулярные механизмы 8,9, хотя это оспаривается в литературе 1,10-12. Наконец, этот протокол может быть аналогичным образом адаптированы к генетически модифицированных мышей, чтобы оценить роль отдельных генов в модуляцииния боли. Она также обеспечивает модельную систему для оценки эффективности потенциальных терапевтических агентов для улучшения опиатного обезболивающее действие.
Protocol
Все эксперименты проводились в строгом соответствии с европейскими принципами для ухода за лабораторными животными (Директива Европейского Совета Сообщества 86/609/ECC) и этических принципов для расследования экспериментальной боли в сознании животных 13. Мужской C57BL6 / N Tac мышей (10 недель, 25 - 30 г) были размещены в институциональной объекта животного с персоналом по уходу, отвечающий эксплуатации объекта в соответствии с экологическими стандартами. Животных содержали в группах (максимум пять мышей в клетке) при 12-часовом / 12 ч цикле свет / темнота при постоянной температуре (21 ± 1 ° С) со свободным доступом к пище и воде. Все эксперименты проводились в то же время суток (10:00 утра до 4:00 вечера), используя когорту 16 мышей. Конкретные материалы и оборудование указаны в таблице материалов.
Процедура пятиступенчатый контролировать индуцированной морфином-гипералгезию и терпимости
Протоколразделены на пять последовательных шагов (AE) в течение периода 15 дней рисунке 1.
. 1 Мыши Обработка (стадия а; г-7 для D-5)
- Ручка мышей и приучить их свободно войти в фиксатор. Это предварительный шаг уменьшает стресс - тем самым сводя к минимуму не перепутать их с стресс-индуцированной анальгезии - и позволяет животным быть приучены к следователю, обработки и манипуляции в фиксатор мыши. Каждая мышь мягко обрабатываются в течение 5 мин каждый день.
. 2 базальной Ноцицептивная отклика (Стадия B, г-4 до Д-1)
- Измерьте хвост отмены задержки с помощью хвоста испытание погружением (ТТИ):
- Установите термостат на 48 ° С.
- Аккуратно ввести мышь в фиксатор. Опустите выступающий 2/3 конец его хвоста в водяной бане и начать хронометр.
- Остановить хронометр, как только мышь отзывает свой хвост от горячей воды и запишите задержки времени (в сек). В гоэ отсутствие болевой реакции, 25 сек отсечки используется для предотвращения повреждения тканей.
- Заменить мышь в клетку и не проверить следующую до конца ряда.
- Повторные измерения ноцицептивного ответа еще два раза, проводя измерения от животных в том же порядке. Ноцицептивной задержки ответа (сек) для каждой мыши определяется как среднее значение для трех последовательных определений.
- Измерьте механические ответы, используя тест Хвост давления (TPT)
- Аккуратно ввести мышь в фиксатор и установить свой хвост под конической оконечности analgesimeter.
- Нажмите ножной переключатель не применять равномерно все большее давление на проксимальной части хвоста до первого ноцицептивной реакции (борется, скрип) происходит. В настоящее время животное реагирует, записи текущего силы (в граммах), которое вызывает болевого ответа. В отсутствие какой-либо реакции, 600 г пороговое значение используется, чтобы избежать твыдавать ущерб.
- Повторите эту меру на срединных и дистальных отделах хвосте той же мыши. Интервал не менее 30 сек наблюдается между мерами на данном мыши, чтобы избежать адаптации или предвзятости стресс. Заменить мышь в клетку и не проверки следующей животное до конца ряда (т.е. все мыши проверено). Ноцицептивный значение (грамм) для каждой мыши берется как среднее значение для трех измерений (т.е. проксимальных, срединных и дистальных отделах хвосте каждого животного).
- Повторите ноцицептивная тестирования (все процедуры, описанные в шаге 2) в последующие дни, D-3 до Д-1.
. 3 Измерение аналгезию морфином (Шаг C; d0)
- Определите наилучшее сочетание животных, что позволяет выбор из двух групп (N = 8 на группу) мышей с устойчивыми и сопоставимых средних ноцицептивных ценностей, в зависимости от того ноцицептивная модальности (ТТИ или ТРТ) считается. Это значение будет рассматриваться как базальнойноцицептивная ответ отсчета для будущих "засоленных" и "Морфий" групп.
- Измеряют вес тела каждого животного.
- Готовят раствор морфина (0,5 мг морфина на мл) в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl) для подкожного введения (5 мг морфина на кг массы тела животного).
- Измерьте болевого задержки отклика (взято как момент времени 0) для каждой мыши обоих «Салин» и групп «Морфий» в ТТИ (все шаги в рамках 2,1 выше). Затем измерьте ноцицепцию в ТРТ (все шаги под 2,2 выше).
- Введите подкожно морфин (обычно 0,25 мл 0,5 мг / мл морфина раствора на 25 г веса мыши) и солевым раствором (0,25 мл на 25 г веса мыши) к морфину '»и« солевых »групп, соответственно.
- Измерьте ноцицептивные значения на ТТИ и ТРТ (все процедуры, изложенные выше в разделе шаги 2.1 и 2.2, соответственно) за время цикла (на 30 мин интерваламдр.) для оценки морфин (5 мг / кг)-индуцированной анальгезии:
- Через 30 мин после инъекции измеряют ноцицептивной реакции (один) определения для каждой мыши в физиологическом растворе '' и 'групп' морфина, используя на входе турбины то TPT.
- Затем измерьте ноцицептивные значения ответов (Тит и ТРТ) у всех мышей в моменты времени (в час): 1-1.5-2-2.5-3 и 3,5 после инъекции.
4 Хронический Морфин Лечение - Морфин-индуцированной Гипералгезию. (Стадия D; d1 до d6)
- В День: d1
- Измерьте ноцицептивные значения реагирования на ТТИ и ТРТ, как описано выше (шаги 2.1 и 2.2). Тщательно комментировать отмены задержки и ограничения давления для каждого животного.
- Подготовка свежий раствор морфина, как указано в п. 3.2.
- Введите подкожно морфин (5 мг / кг веса тела) для всей группы "Морфий" и физиологический раствор (0,25 мл на одно 25 г веса мыши) к группе "засоленных '. Пусть йе животные не успокоится, пока на следующий день.
- На днях: d2, d3, d4, d5 и d6 повторить операции, описанные в соответствии с разделом 4.1
. 5 Доказательства анальгезирующего терпимости (Шаг E; d7)
- Оцените морфина-индуцированной анальгезии в соответствии с временем, конечно, парадигмы уже подробно в разделе 3.
6. Сбор данных и Статистический анализ
- Оценка значений отклика базальной ноцицептивных (стадия В)
- Рассчитать для каждого дня (над г-4 до Д-1 период) среднее ± значений SEM (N = 8) для базальных ноцицептивных реакций, как, предоставляемых из ТТИ и ТРТ в рамках «Салин» и групп «Морфий».
- Участок средние исходные ноцицептивные значения, в зависимости от времени (день) для обеих групп Рисунок 2.
- Анализ Морфин Обезболивание Time-курс в Days d0 (стадия C) и d7 (Стадия Е)
- Рассчитать, в каждый момент времени после морфинаинъекций, среднее ± SEM значений (N = 8) для ноцицептивных реакций, как, предоставляемых из входе турбины (в сек) и ТПТ (в г) в каждой группе.
- Земля означает ноцицептивные значения реагирования как функция времени для «Салин» и групп «Морфий» в день 0 рис. 3 и 7 день Рисунок 5.
- Развитие Морфин-индуцированной гипералгезии (стадии D)
- Рассчитать для каждого дня (за период лечения d0-d7) среднее ± значений SEM (N = 8) для базальных ноцицептивных значений реагирования, предоставляемых из ТТИ и ТРТ в рамках "физиологический раствор» и «морфин-лечение" групп.
- Участок средние исходные ноцицептивные значения реагирования как функцию времени (день) для "Соленая обращению" и "Морфий обращению» группы Рисунок 4.
- Доказательства анальгезирующего терпимости (Шаги С и Е)
- Определите от морфина время блюд еXperiment осуществляется на d0 рисунке 3 значения времени (или диапазона времени), необходимое для морфина, чтобы вызвать максимальный ответ обезболивающее.
- Возьмите это значение (обычно 30 мин), а начало отсчета времени для оценки на d7 рисунке 5 ноцицепция базовое значение (физиологический раствор обращению группа) и фактической ответ анальгетик (морфин-обработанная группа) к острой морфина.
- Ноцицептивные значения, принимаемые в момент времени 30 мин от морфина экспериментов времени, конечно, выполненных в D0 и D7 для вводят физиологический раствор и морфин обработанных групп, представлены в виде гистограммы Рисунок 6.
- Статистика: Анализ данных с помощью одностороннего повторными измерениями ANOVA. Факторы изменения были лечение (между субъектами) и время (в пределах субъекта). Для проверки различий отдельно в каждой группе, повторные измерения ANOVA проводили. Сравнения между двумя группами были проведены с использованием непарного т-тест или парного критерия Стьюдента в случае необходимости.
- Уровень существенности Р <0,05. Все Статистический анализ осуществляются с помощью Statview Software.
Representative Results
Оценка базальной Ноцицептивная значений простых мышей (стадия В)
ТИТ и ТРТ последовательно применяется ко всей когорты мышей (п = 16), обеспечивая средние ноцицептивные значения реагирования. Наилучшее сочетание животных разрешено апостериорной определение две группы (N = 8) мышей, называют физиологическим раствором и морфин, которые показывают подобные стабильные и базальные ноцицептивных значения Рисунок 2. Эквивалентность обеих группах действует независимо от ноцицептивной тест ( ТИТ: 2А; ТРТ: Рисунок 2B), который был выбран.
Время-курс для аналгезию морфином в день 0 (стадия C)
Морфин обезболивание оценивали после однократной инъекции (SC) морфина (5 мг / кг) в наивных мышей с использованием как ТТИ Рисунок 3A и TPT рисунке 3b. В обоих тестах, статистического анализа с той повторных измерений ANOVA reveaл, что существует значительное взаимодействие между лечением и время для ТТИ (F (7, 98) = 72, р <0,001) и ТРТ (F (7, 98) = 31, р <0,001). TIT и данные ТПТ анализ с использованием повторных измерений ANOVA показывает, что нет эффект физиологического раствора (F (7, 49) = 0,49, р> 0,05) и F (7, 49) = 1,85, р> 0,05 соответственно для входе турбины и TPT Тесты), в то время как морфин впрыска индуцирует сильный обезболивание у мышей (F (7, 49) = 92,46, р <0,001) и F (7, 49) = 34,37, р <0,001 соответственно для ТТИ и испытаний ТРТ). Максимальный анальгетический эффект морфина была достигнута после 30 мин в входе турбины и после 60 мин в TPT как по сравнению с инъецированных физиологическим раствором управления (р <0,001, непарного т-тест).
Повторные Морфин Администрации Вызывает Гипералгезию у мышей (Стадия D)
Базальные ноцицептивные значения были измерены каждый деньдо физиологического или морфина администрации (см. протокол). Как показано на рисунке 4, один раз в день морфина администрации за период 6 дней лечения вызвало значительное и прогрессирующее снижение теплового (F (7, 56) = 11,6, р <0,001, повторные меры ANOVA; Рисунок 4а) и механический (F ( 7,56) = 15,55, р <0,001, повторил меры ANOVA; Рисунок 4б) базальные ноцицептивные значения. Гипералгезию быстро развивается, поскольку это начало быть значительными в один день в входе турбины (р <0,01, непарный т-тест, по сравнению с инъецированных физиологическим раствором управления) и на 2-й день в TPT (р <0,05, непарный т-тест, по сравнению с физиологическим раствором впрыском управления).
Время-курс для Морфий Анальгезии на 7-й день, после хронической Морфин лечения (стадии Е)
На 7-й день мышей, получавших ежедневно морфина или инъекции физиологического раствора в течение 7-дневного периода (d0, чтобы d6) были рассмотрены в TИТ Рисунок 5А и TPT рисунке 5б сначала для их базальных ноцицептивных значений, а затем для их обезболивающего ответ на острый морфина (5 мг / кг, подкожно.). В соответствии с развитием гипералгезии, показанном на фиг.4, базальный ноцицептивной значение (время 0) мышей, которые были хронически получавших морфина была значительно ниже, чем у инъецированных физиологическим раствором контрольных мышей (Р <0,001, непарный т-тест). После острого морфина, ноцицептивной реакции хронического морфина группе, получавшей значительно увеличилась, но незначительно превышает базальный ноцицептивной значение контрольных мышей, инъецированных физиологическим раствором, измеренную при 30 мин в входе турбины и ТРТ (р <0,01 и р <0,05, непарный т Тест, соответственно) и при температуре 60 мин в входе турбины (р <0,05; непарный т-тест). С 2 ч после обработки морфина до конца эксперимента, ноцицептивных реакций не вернулась к более низкими значениями, чем у контрольных мышей (р<0,001, непарный т-тест).
Сравнение максимальных анальгетик Ответы мышей к морфину до (день 0) и после Хронический Морфин Лечение (День 7).
Ноцицептивные пороговые значения, представленные на рисунке 6 взяты из ТТИ (а) и ТПТ (B) выполняется через 30 мин после солевого раствора или инъекции морфина, как показано на фиг.3 (день 0) и 5 (7 день). Сильное падение морфина обезболивания наблюдался у мышей после хронического лечения морфина в течение 7 дней по сравнению с их первоначальной реакции обезболивания в день 0 в обоих ноцицептивных испытаний (р <0,001 в паре т-тест). Эти данные показывают, что толерантность же развиваться в болевых сверхчувствительных животных.
Рисунок 1. Пятиступенчатый пропроцедура для мониторинга индуцированной морфином-гипералгезию и терпимости. Протокол делится на пять последовательных шагов (АЭ) по общей продолжительностью 15 дней.
. Рисунок 2 Определение базальных ноцицептивных значений отклика (стадия б; D-4 до Д-1). Хвост погружения (ТТИ) (А) и хвост давления (TPT) (B) Тесты применяются к целой серии животных для того, чтобы оценить их базальные ноцицептивные значения. После этого две группы мышей (n = 8), называют «физиологический раствор" и группы "морфин", определены так, что они демонстрируют устойчивые и сравнимые средние значения ноцицептивных, независимо от ноцицептивной модальность, которая считается.
Рисунок 3. Время-курс для морфина обезболивания в день 0 (Шаг C) в ТТИ (А) и ТРТ (B). Базальная ноцицептивная значение отклика мышей определяли каждые 30 мин после одного морфина (5 мг / кг, подкожно. ) или солевые инъекции. Данные выражены как среднее ± SEM, n = 8 мышей на группу. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001, непарный т-тест, по сравнению с контрольной группой.
. Рисунок 4 Развитие гипералгезии после неоднократного введения морфина (Шаг D; d1 на d6). Базальная ноцицептивная значение мышей определялась ТТИ (А) и ТПТ (B) один раз в день перед морфина (5 мг / кг,подкожно.) или введение физиологического раствора. Данные выражены в виде средних значений ± SEM, n = 8 мышей на группу. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001 по непарного т-теста по сравнению с контрольной группы вводят физиологический раствор.
Рисунок 5. Времени курс для морфина анальгезии в хронической морфина мышей на 7-й день (стадия е) в входе турбины (А) и ТПТ (B). Мышей, которые были обработаны с хронически морфина (черные точки) или физиологический раствор (белые треугольники) с 0 до 6 дня, получил на 7-й день одну инъекцию морфина (5 мг / кг, подкожно.) или физиологический, соответственно. Ноцицептивной реакции мышей определяли каждые 30 мин после морфина или инъекции физиологического раствора. Данные выражены как среднее ± SEM, n = 8 мышей на группу. * Р <0,05, ** Р & #60; 0,01 помощью непарного т-теста по сравнению с контрольной группы вводят физиологический раствор. Планки погрешностей, которые не превышают размер символов скрыты.
Рисунок 6. Сравнение максимальных обезболивающих ответов мышей к морфину (5 мг / кг, подкожно.) До (день 0) и после лечения хронических морфин (7 дней). Значения, указанные здесь, взяты из экспериментов, показанных на рисунке 3 и рисунке 5. Ноцицептивные значения были измерены с помощью ТИТ (А) и TPT (B) через 30 мин после морфина или инъекции физиологического раствора. Данные выражены как среднее ± SEM, n = 8 мышей на группу. *** Р <0,001 по парного критерия Стьюдента.
Discussion
Критические шаги
Выбор животной модели для измерений ноцицепции
Изменчивость в ноцицептивной и обезболивающее чувствительности среди штаммов мышей был рассмотрен (отзывы 14-16) отзывы использованием различных моделей боли, отличающиеся по своей этиологии (ноцицептивных, воспалительных, нейропатическая), модальность (тепловая, химическая, механическая), продолжительность (острый, тоник, хронический) и местом введения (кожный, подкожный, висцеральный). По сравнению с другими штаммами, C57BL/6J ("J" для Jackson Laboratory) мышей стал популярным животная модель для исследования боли, что они проявляют высокой начальной ноцицептивный чувствительность 17,18 и умеренное обезболивающей к опиатам 14,19. После лечения хронических морфина, они также развивать значительные терпимости обезболивающее 20,21, гипералгезию 21,22 и зависимость 20,23.
нт "> Здесь Эксперименты проводились на C57BL/6N Tac мышей (" N "для Национального института здравоохранения и" Тас "для Taconics фермы), которые принадлежат к отдельному филиала B6 линии. Несмотря на то, C57BL / 6, уже давно рассматриваться как взаимозаменяемые, недавние исследования указывают на значительные различия в поведении между C57BL/6J и C57BL/6N штаммы 24. В частности, более низкая чувствительность из трех C57BL/6N субштаммах (в том числе Tac одного) к острой тепловой боль можно рассматривать как преимущество для тестирования этой фенотип.Самцов мышей были выбраны в качестве подавляющего большинства исследований боли, с использованием мышей в качестве модели животного, выполняются на молодых самцов 25. В наших руках, они обеспечили надежную и воспроизводимую данные при исследовании от обезболивания или гипералгезии точек зрения. Иногда, мы заметили тенденцию к C57BL/6N самки, чтобы обеспечить более вариабельных ответов, как в ТТИ и испытаний ТРТ. Хотя это наблюдение можетотражают естественные изменения, связанные с гормональным статусом женщин, габаритные механизмы, лежащие половые различия в боли и обезболивания до сих пор остаются предметом споров. Некоторые аспекты этой горячей дискуссии будут кратко представлены в следующих «Ограничения методики» разделе.
Животное привыкание
Мыши были впервые позволил, чтобы привыкнуть к объекту животного в течение одной недели. Подобно любой другой поведенческой исследования, тестирование проводилось после периода 3 дня акклиматизации (рис. 1, стадия А). Как ноцицептивные тесты чувствительны к стрессу, первые меры могут дать более длинные задержки, чем последующие, особенно в не-привычной мышей 26,27. Шаг привыкание позволяет также выбирание из более стабильных ноцицептивных значений отклика в тот же день, а также между дней рисунках 2 и 4. Для уменьшения циркадные воздействие на ноцицептивную и анальгетикЧувствительность 28,29, все тестирований были проведены с 10:00 до 4:00 вечера.
Выбор ноцицептивных испытаний
Ноцицептивные Тесты использовать либо тепловой, механической, химической или электрические стимулы (обзор 26,27,30. Их выбор имеет решающее значение, как различные ноцицептивные условия могут быть обработаны с помощью различных болевых рецепторов и волокон 18,31,32.
Мы выбрали тест хвост погружения (ТТИ) 33, модифицированную версию классического теста одергивани хвоста разработанной d'Amour и Smith 34 и тест хвост давления (TPT), адаптированный от Randall и Selitto 35, в качестве примеров тепловой и механические методы для изучения морфин-индуцированной анальгезии, гипералгезию и терпимости у мышей. Оба теста были широко использованы в крысах. Отрезаны время систематически определены, чтобы избежать или ограничить риск повреждения тканей.
Морфин-индукцииред обезболивание, гипералгезии и толерантность
Морфин, прототипом мю-опиатных агонистов, здесь было выбрано, поскольку это является мощным обезболивающим и OIH-индуктором, как в людях и мышах 1,2,36. Морфин анальгетик потенции, как известно, меняются в зависимости от штаммов мышей, путей введения и ноцицептивных механизмов. В мышей C57BL / 6, надежный обезболивание обычно получают после подкожной инъекции морфина в диапазоне 1-20 мг / кг дозы 14,21. Соответственно, мы выбрали для изучения острой обезболивание после однократного введения (подкожно) морфина в дозе 5 мг / кг, недалеко от его ED 50 значения (7-20 мг / кг) оценивается от теплового ноцицепции 19,21.
Повторное введение морфина часто сопровождается обезболивающего толерантности (о чем свидетельствует либо из сдвига вправо кривой доза-реакция или уменьшением обезболивающего амплитуды отклика или продолжительности) и гипералгезии (усугубляется чувствительности к болезненным Стимуля свидетельствует от снижением базальной ноцицептивной значения). Оба неблагоприятные явления зависит от видов грызунов, от природы опиатов соединения, которое выбрано и его дозировки, от длительности лечения и на ноцицептивных механизмов 21. Например, экспериментальные парадигмы для изучения толерантности и гипералгезии состоять в ежедневного приема высокой и постоянной (от 20 до 40 мг / кг в сутки) или 22 эскалации (до 50 или даже 200 мг / кг) 20,21 морфина дозы. Соответственно, мы способствовали развитию гипералгезии и толерантности в C57BL / 6 мышей через ежедневного введения морфина (5 мг / кг; подкожно) в течение 8 дней. Этот умеренный доза морфина была предпочтительнее, чем более высокие в лучшей мимической использования клиники.
Настройка операционной окне ТТИ
Возможный ловушка в ТТИ может быть связано с роли хвоста в терморегуляции грызунов 26,37. Как температура окружающей среды является ключевым фактором в nociceptив вариации реагирования, она должна оставаться постоянной (здесь при 21 ° С) в течение экспериментов 38. Интенсивность тепла обычно устанавливается для обнаружения ноцицептивной реакции в 5 до 10 сек 27. В самом деле, большие задержки может увеличить риск для мониторинга движения животного, не связанных с ноцицептивной стимул, в то время как более короткие может уменьшить перепад силу теста. Мы провели измерения Tit при фиксированной температуре 48 ° С. Хвост отмены задержки были близки к 9 сек (базальная ноцицептивная значение) и варьировала от 4 сек (гипералгезии) до 25 сек (максимальная обезболивания; отрезать). В дополнение к практическим причинам, измерения ноцицептивных значений отклика при фиксированной температуре может априори включать один и тот же репертуар болевых рецепторов и схем, что облегчает интерпретацию данных.
Возможные Модификации
Оптимизация рабочего диапазона ТТИ для обезболивания и OIH MeasureMeНТС
При фокусировке на ответ обезболивающее, низкие значения базовых (выше интенсивность тепла) может способствовать обнаружению задержкой в ответе. В свою очередь, для решения следствием болевого раздражителя или развитие OIH, более высокие значения исходных условиях (ниже интенсивности тепла; здесь 48 ° C) может способствовать выявлению быстрее ответов Рисунок 4.
Хотя мы обнаружили морфин в дозе 5 мг / кг удобным дозу индуцировать надежную анальгетический ответ рисунок 3 и содействовать (при повторном введении) значительное гипералгезии фиг.4, его доза может быть приспособлен как упоминалось ранее (важный шаг: морфин-индуцированной анальгезии, гипералгезии и терпимость). Например, более низкие дозы могут быть использованы для снижения обезболивание амплитуду (тем самым, избегая ограничений отсечения), тогда как более высокие дозы могут быть выбраны для ускорения гипералгезию начало и увеличить его амплитуду.
ОвеRall, оптимизация "ноцицептивной окна" должны быть адаптированы к генетического фона мышей при исследовании и принять во внимание возможность для участия различных массивов ноцицепторов и схем.
Альтернативные агонисты опиатных (фентанил, remifentanyl)
Хотя большинство клинически используемые опиаты целевой MU-опиоидных рецепторов в качестве агонистов, они значительно отличаются в отношении их фармакологических свойств в пробирке и в естественных условиях. Например, remifentanyl и фентанила, резко контрастирует с морфина, ведут себя как полные агонисты и содействовать интернационализации мю-опиоидные рецепторы 39. Опиатные анальгетики, такие как морфин и фентанил имеют период полураспада в диапазоне часов 40, в то время как remifentanyl имеет ультра-короткого периода полураспада в несколько минут 41. У людей, лучшее доказательство для OIH от пациентов, получавших опиаты во время операции, в том числе короткого действия сompounds такие как remifentanyl 2,42. Таким образом, фентанил и remifentanyl может быть ценным инструментом слишком изучать развитие гипералгезии и толерантности у мышей, под ТТИ и ТРТ парадигм.
Альтернативные способы индукции OIH (хронический против острого администрации)
OIH видно в организме человека и животных моделях, как следствие введения опиатов, будь то при очень низких или очень высоких дозах 1,2. Мы сообщаем о развитии OIH после хронического лечения мышей с умеренных доз морфина. Несколько дней лечения мышей C57BL/6N были необходимы, чтобы свидетельствовать ясную и воспроизводимую повышенной болевой государственного деятеля 4 Ежедневные инъекции морфина может быть адекватно заменены имплантированных морфина гранул:. После их удаления, как тепловой гипералгезии и механическая аллодиния уже сообщалось в мышей 43. Настой опиатов через микро-осмотического насоса и другая возможность 44. У грызунов, долговечный гипералгезии также достижимы после острого введения фентанила с использованием протокола имитируя использование этого мю-опиоидных агонистов в человеческой хирургии 36,45,46.
Ограничения техники
Виды животных и модели для боли
Сравнительные исследования многочисленных линий мышей выявлен весьма различными ситуациями в ноцицептивных ответов на болезненные раздражители 17,31,47 и в уровнях OIH после лечения 22 4-дневный морфина. Будь механизмы, лежащие обработку боли и модуляцию на животных моделях (мышей и крыс) актуальны для пациентов с хронической болью остается фундаментальной и открыл вопрос. Таким образом, большая осторожность следует уделять интерпретации данных животных и их прогностической валидности для человека 16.
Половые различия в боли и обезболивания
ntent "> Большинство доклинические исследования на животных моделях для боли были проведены на самцов грызунов 16,25,48. Несмотря на это смещения отбора, возникающие вид был рассмотреть самцов, как лучше реагирующих на опиатных анальгетиков 49,50, менее склонны к развитию опиоидов вызванной гипералгезию 51,52 и более терпимы к морфина обезболивания 53, чем их коллеги-женщины (обзор 54). Тем не менее, половые различия в отношении ноцицепции и анальгетиков эффективности не возобновятся в такой «один размер подходит всем» парадигму. Действительно, Большое количество данных теперь указывает, что многочисленные переменные могут влиять на величину и направление половых различий, таких как опиоидной эффективности препарата и селективности, ноцицептивной анализа, генетического фона, возраста, gonado-гормонального статуса или социального взаимодействия 48,54. У людей, клиническая боль является более распространенным в женщин, но, отражает ли этот факт фактические половые различия остается предметом дискуссий 48,55,56. Фог, например, глобальный анализ пятидесяти клинических испытаний не указано никаких существенных различий в обезболивающим между полами в то время как мета-анализов выполняется на субъектов пациентов контролируемых указал на значительно большей опиоидной эффективности у женщин 57. Последнее наблюдение, которое заметно контрастирует с тем, что было найдено на грызунах, снова возникает ряд вопросов относительно происхождения такого расходимости 16,48,55,57. В общей сложности, половые различия в обезболивания существуют и заслуживают дальнейшего сосредоточиться на основных механизмов и клинических проявлений.О ноцицептивных испытаний
Тест хвост вывод является спинного рефлекс, но это может быть предметом супраспинальных воздействий 58. TIT относительно легко выполнить на крысах, но требует больше опыта у мышей. Потенциальный трудность заключается в поддержании мыши в правильном положении, не вызывая нежелательные стресс. Предлагаемый протокол может быть скорректирована в соответствии сРазмер когорты. 16 животных (8 контроль и 8 лечение) можно легко управлять, насколько измерения их базальных ноцицептивных значений отклика (с использованием ТИТ, а затем ТРТ для всей серии мышей) находится под беспокойства. Мониторинг времени курсы анальгезии требует создания точного графика и оценку максимального числа животных, которые могут быть проверены (Тит, а затем TPT) в переданной промежуток времени (здесь 30 мин). Вся когорта животных таким образом, может быть разделена на подгруппы, чтобы экспериментатор уважать кинетические ограничения.
Значение Техники в отношении существующих / альтернативных методов
OIH у крыс по сравнению с мышью
Крысы широко используются для изучения опиоидных анальгезии, гипералгезию и терпимости, после острой или хронической опиатной администрации 46,59-61. Действительно, несколько практических соображений, они могут быть рассмотрены вышемышей в качестве животной модели для болевых экспериментов 16,61. Тем не менее, до недавнего времени, поколение генетически модифицированных крыс не было простой процедурой. Как показывают многочисленные генетически модифицированные линии мышей уже доступны, наша модель предлагает возможность изучать вклад многочисленных индивидуальных генов в OIH и развития толерантности у мышей.
ТИТ и ТРТ по сравнению с другими ноцицептивных испытаний
ТТИ является вариантом теста одергивани хвоста, наиболее очевидным различием, площадь стимуляции. В отличие от лучистого тепла, погружение хвоста в горячей воде приводит к быстрой и равномерное увеличение его температуры. По сравнению с другими формами испытаний тепловой ноцицепции (горячей плиты или Hargreaves тесты), ТТИ предоставляет довольно воспроизводимые результаты и между странами и внутри субъектов.
ТРТ является очень популярным тестом для изучения механических ноцицепции 26,27,35 который, вероятно, включает в себяразличных ноцицептивных волокон и молекулярные преобразователи затем ТТИ 32. Это обеспечивает быстрый и надежные измерения 59, но требует определенного опыта от экспериментатора и больших когорт животных. В качестве альтернативы analgesimeter, используемого в настоящем исследовании, других процедур или устройства опираясь на тензодатчиков существуют (обзор 27). ТРТ лучше всего подходит для изучения механической гипералгезии в то время как фон Фрей нити обычно принято оценивать механическую аллодинию (обзор 27).
Будущие приложения или проезда после освоения этой техники
Экспериментальная модель OIH / допуск приведем здесь, могут быть аналогичным образом приспособлены к генетически модифицированных мышей, чтобы оценить роль отдельных генов в модуляции боли. Она также обеспечивает модельную систему для расследования эффективности потенциальных терапевтических агентов для облегчения хронической боли.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, Франция) за его поддержку.
Эта работа была поддержана CNRS, INSERM, Université де Страсбург BioValley и грантами Conectus, Agence Национальной де ла Recherche (ANR 08 EBIO 014,02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine де Страсбург (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Направление Générale де Entreprises (Pharmadol).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30 g) |
| Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS no. 52-26-6 | Delivered with special authorization |
| Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene, sterile, volume: 1 ml |
| Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
| Mouse restrainer | Home-made | Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples | |
| Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
| Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
| Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
| STATview software | Free download, statistics |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D. Opioid-induced hyperalgesia. A qualitative systematic review. Anesthesiology. 104, 570-587 (2006).
- Chu, L. F., Angst, M. S., Clark, D. Opioid-induced hyperalgesia in humans. Molecular mechanisms and clinical considerations. Clin. J. Pain. 24, 479-496 (2008).
- Lee, M., Silverman, S., Hansen, H., Patel, V., Manchikanti, L. A comprehensive review of opioid-induced hyperalgesia. Pain Physician. 14, 145-161 (2011).
- Hutchinson, M. R., Shavit, Y., Grace, P. M., Rice, K. C., Maier, S. F., Watkins, L. R. Exploring the neuroimmunopharmacology of opioids: An integrative review of mechanisms of central immune signaling and their implications for opioid analgesia. Pharmacol. Rev. 63, 772-810 (2011).
- Wang, X., et al. Morphine activates neuroinflammation in a manner parallel to endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 6325-6330 (2012).
- Colpaert, F. C. System theory of pain and of opiate analgesia: No tolerance to opiates. Pharmacol. Rev. 48, 355-402 (1996).
- Simonnet, G., Rivat, C. Opioid-induced hyperalgesia: abnormal or normal pain. NeuroReport. 14, 1-7 (2003).
- Mao, J., Sung, B., Ji, R. R., Lim, G. Chronic morphine induces downregulation of spinal glutamate transporters: implications in morphine tolerance and abnormal pain sensitivity. J. Neurosci. 22, 8312-8323 (2002).
- King, T., Ossipov, M. H., Vanderah, T. W., Porreca, F., Lai, J. Is paradoxical pain induced by sustained opioid exposure an underlying mechanism of opioid antinociceptive tolerance. Neurosignals. 14, 194-205 (2005).
- DuPen, A., Shen, D., Ersek, M. Mechanisms of opioid-induced tolerance and hyperalgesia. Pain Management Nursing. 8, 113-121 (2007).
- Chu, L. F., et al. Analgesic tolerance without demonstrable opioid-induced hyperalgesia : A double-blinded, randomized, placebo-controlled trial of sustained-release morphine for treatment of chronic nonradicular low-back. 153, 1583-1592 (2012).
- Ferrini, F., et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl- homeostasis. Nature Neurosci. 16, 183-192 (2013).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigation of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
- Mogil, J. S. The genetic mediation of individual differences in sensitivity to pain and its inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 7744-7751 (1999).
- Mogil, J. S., et al. Screening for pain phenotypes : Analysis of three congenic mouse strains on a battery of nine nociceptive tests. Pain. 126, 24-34 (2006).
- Mogil, J. S. Animal models of pain : progress and challenges. Nature Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
- Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception I : Responses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception. Pain. 80, 67-82 (1999).
- Larivière, W. R., et al. Heritability of nociception. III. Genetic relationships among commonly used assays of nociception and hypersensitivity. Pain. 97, 75-86 (2002).
- Elmer, G. I., Pieper, J. O., Negus, S. S., Woods, J. H. Genetic variance in nociception and its relationship to the potency of morphine-induced analgesia in thermal and chemical tests. Pain. 75, 129-140 (1998).
- Eidelberg, E., Erspamer, R., Kreinick, C. J., Harris, J. Genetically determined differences in the effects of morphine on mice. Eur. J. Pharmacol. 32, 329-336 (1975).
- Kest, B., Hopkins, E., Palmese, C. A., Adler, M., Mogil, J. S. Genetic variation in morphine analgesic tolerance: A survey of 11 inbred mouse strains. Pharmacol. Biochem. Behav. 73, 821-828 (2002).
- Liang, D. -Y., Liao, G., Wang, J., Usuka, J., Guo, Y., Peltz, G., Clark, J. D. A genetic analysis of opioid-induced hyperalgesia in mice. Anesthesiology. 104, 1054-1062 (2006).
- Kest, B., Palmese, C. A., Hopkins, E., Adler, M., Juni, A., Mogil, J. S. Naloxone-precipitated withdrawal jumping in 11 inbred mouse strains : Evidence for common genetic mechanisms in acute and chronic morphine physical dependence. Neurosci. 115, 463-469 (2002).
- Bryant, C. D., et al. Behavioral differences among C57BL/6 substrains: Implications for transgenic and knockout studies. J. Neurogenet. 22, 315-331 (2008).
- Mogil, J. S., Chanda, M. L. The case for the inclusion of female subjects in basic science studies of pain. Pain. 117, 1-5 (2005).
- Le Bars, D., Gozariu, M., Cadden, S. W.
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neurosci. 211, 39-50 (2012).
- Kavaliers, M., Hirst, M. Daily rythms of analgesia in mice: effects of age and photoperiod. Brain Res. 279, 387-393 (1983).
- Castellano, C., Puglisi-Allegra, S., Renzi, P., Oliverio, A. Genetic differences in daily rhythms of pain sensivity in mice. Pharmacol. Biochem., and Behavior. 23, 91-92 (1985).
- Sandkühler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol. Rev. 89, 707-758 (2009).
- Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception II. ‘Types’ of nociception revealed by genetic correlation analysis. Pain. 80, 83-93 (1999).
- Scherrer, G., et al. Dissociation of the opioid receptor mechanisms that control mechanical and heat. 137, 1148-1159 (2009).
- Janssen, P. A. J., Niemegeers, C. J. E., Dony, J. G. H. The inhibitory effect of fentanyl and other morphine-like analgesics on the warm water induced tail withdrawal reflex. Arzneimittelforsch. 13, 502-507 (1963).
- Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 72, 74-79 (1941).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 111, 409-419 (1957).
- Elhabazi, K., et al. Involvement of neuropeptides FF receptors in neuroadaptative responses to acute and chronic opiate treatments. Br. J. Pharmacol. 165, 424-435 (2012).
- Berge, O. -G., Garcia-Cabrera, I., Hole, K. Response latencies in the tail-flick test depend on tail skin temperature. Neurosci. Lett. 86, 284-288 (1988).
- Benoist, J. -M., Pincedé, I., Ballantyne, K., Plaghi, L., Le Bars, D. Peripheral and central determinants of a nociceptive reaction: An approach to psychophysics in the rat. PLoS ONE. 3, e3125 (2008).
- Morgan, M. M., Christie, M. J. Analysis of opioid efficacy, tolerance, addiction and dependence from cell culture to human. Br. J. Pharmacol. 164, 1322-1334 (2011).
- Trescot, A. M., Datta, S., Lee, M., Hansen, H.
- Egan, T. D., et al. The pharmacokinetics of the new short-acting opioid remifentanil (GI87084B) in healthy adult male volunteers. Anesthesiology. 79, 881-892 (1993).
- Hansen, E. G., Duedahl, T. H., Rømsing, J., Hilsted, K. L., Dahl, J. B. Intra-operative remifentanil might influence pain levels in the immediate post-operative period after major abdominal surgery. Acta Anaesthesiol Scand. 49, 1464-1470 (2005).
- Li, X., Angst, M. S., Clark, J. D. A murine model of opioid-induced hyperalgesia. Mol. Brain Res. 86, 56-62 (2001).
- Varnado-Rhodes, Y., Gunther, J., Terman, G. W., Chavkin, C. Mu opioid analgesia and analgesic tolerance in two mouse strains. C57BL/6 and 129/SvJ. Proc. West Pharmacol. Soc. 43, 15-17 (2000).
- Celerier, E., et al. Long-lasting hyperalgesia induced by fentanyl in rats: preventive effect of ketamine. Anesthesiology. 92, 465-472 (2000).
- Celerier, E., Simonnet, G., Maldonado, R. Prevention of fentanyl-induced delayed pronociceptive effects in mice lacking the protein kinase C gamma gene. Neuropharmacol. 46, 264-272 (2004).
- Larivière, W. R., Chesler, E. J., Mogil, J. S. Transgenic studies of pain and analgesia: Mutation or background phenotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 467-473 (2001).
- Mogil, J. S. Sex differences in pain and pain inhibition: multiple explanations of a controversial phenomenon. Nature Rev. Neurosci. 13, 859-866 (2012).
- Kest, B., Wilson, S. G., Mogil, J. S. Sex differences in supraspinal morphine analgesia are dependent on genotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1370-1375 (1999).
- Kest, B., Sarton, E., Dahan, A.
- Holtman, J. R., Wala, E. P. Characterization of morphine-induced hyperalgesia in male and female rats. Pain. 114, 62-70 (2005).
- Juni, A., et al. Sex differences in hyperalgesia during morphine infusion: effect of gonadectomy and estrogen treatment. Neuropharmacol. 54, 1264-1270 (2008).
- Craft, R. M., et al. Sex differences in development of morphine tolerance and dependence in the rat. Psychopharmacol. 143, 1-7 (1999).
- Bodnar, R. J., Kest, B. Sex differences in opioid analgesia, hyperalgesia, tolerance and withdrawal: central mechanisms of action and roles of gonadal hormones. Hormones Behav. 58, 72-81 (2010).
- Greenspan, J. D., et al. Studying sex and gender differences in pain and analgesia: A consensus report. Pain. 132, S26-S45 (2007).
- Fillingim, R. B., Ness, T. J. Sex-related hormonal influences on pain and analgesic responses. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 485-501 (2000).
- Niesters, M., et al. Do sex differences exist in opioid analgesia? A systematic review and meta-analysis of human experimental and clinical studies. Pain. 151, 61-68 (2010).
- Millan, M. J.
- Celerier, E., Laulin, J. -P., Corcuff, J. -B., Le Moal, M., Simonnet, G. Progressive enhancement of delayed hyperalgesia induced by repeated heroin administration : A sensitization process. J. Neurosci. 21, 4074-4080 (2001).
- Simonin, F., et al. RF9, a potent and selective neuropeptide FF receptor antagonist, prevents opioid-induced tolerance associated with hyperalgesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 466-471 (2006).
- Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav. Brain Res. 125, 65-73 (2001).
