Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdering av Morphine-indusert hyperalgesi og smertestillende Toleranse i Mus Bruke termiske og mekaniske nociceptiv modaliteter

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biotechnology and Cellular Signalling, UMR 7242 CNRS, Université de Strasbourg

Summary

Vi beskriver en protokoll for å undersøke utviklingen av opioid-indusert hyperalgesi og toleranse hos mus. Basert på måling av termiske og mekaniske nociceptive svar av naive og morfin-behandlede dyr, gjør det mulig å tallfeste økningen i smertefølsomhet (hyperalgesi) og reduksjon i smertebehandling (toleranse) forbundet med kronisk opiat administrasjon.

Abstract

Opioidindusert hyperalgesi og toleranse sterkt påvirke den kliniske effekten av opiater som smertestillende midler i dyr og mennesker. De molekylære mekanismene bak begge fenomener er ikke godt forstått, og deres forklaring skal ha nytte av studiet av dyremodeller og fra utforming av egnede eksperimentelle protokoller.

Vi beskriver her en metodisk tilnærming for å fremkalle, innspilling og kvantifisering av morfin-indusert hyperalgesi samt for godgjøre analgetisk toleranse, ved hjelp av halen-immersion og hale trykktester i villtype mus. Som vist i videoen, blir protokollen delt inn i fem etterfølgende trinn. Håndtering og tilvenning faser tillate en sikker bestemmelse av basal nociceptive responsen av dyrene. Kronisk administrering av morfin induserer signifikant hyperalgesi, som vist ved en økning i både termisk og mekanisk følsomhet, mens sammenligning av analgesi tid-baner etter akutt eller repflere ganger for morfinbehandling indikerer tydelig utvikling av toleranse manifestert av en nedgang i smertestillende respons amplitude. Denne protokollen kan tilpasses på lignende måte til genetisk modifiserte mus for å evaluere betydningen av individuelle gener i modulering av nocicepsjon og morfin analgesi. Det gir også et modellsystem for å undersøke effektiviteten av potensielle terapeutiske midler for å forbedre opiat analgetisk effekt.

Introduction

Opioidindusert hyperalgesi (OIH) og smertestillende toleranse begrenser den kliniske effekten av opiater i dyr og mennesker 1-3. Involvering av pro-inflammatorisk 4,5 eller av pro-nociceptive (anti-opioid) 6,7 systemene er for tiden utforsket hypoteser. Den forklaring av mekanismene som ligger til grunn OIH og toleranse nødvendiggjør en kombinasjon av in vivo-og in vitro-metoder, ved hjelp av egnede dyremodeller, eksperimentelle protokoller og molekylære verktøy.

Behavioral farmakologi er det dominerende paradigmet for å overvåke og kvantifisere smertestillende og hyperalgesibestemmelsen stater i forsøksdyr (rotter, mus). Anvendelsen av et skadelig stimulus (termisk, mekanisk eller kjemisk) til et passende kroppsdelen (hindpaw, hale) til dyret fører til en nocifensive uttak som lett kan skåres.

Vi foreslår her en metodisk tilnærming for å fremkalle, innspilling og kvantifisere OIH ogtoleranse i villtype mus, ved hjelp av halen-immersion og hale trykktester. Fremgangsmåten tillater en enkel, følsom og reproduserbar bestemmelse av termiske og mekaniske nociceptive responsverdiene i mus. Som vist i videoen protokollen, C57BL / 6 mus opplever betydelig hyperalgesia etter kronisk morfin administrasjon og opprettholde dette i flere dager. Både termiske og mekaniske nociceptive verdier er betydelig redusert, sammenlignet med grunnlinjemålinger på naive dyr. Videre tillater vårt eksperimentelle oppsett for å overvåke, i tillegg til utvikling av OIH, nedgangen av den analgetiske respons til morfin (toleranse). Presentert data støtter det syn at hyperalgesia og toleranse kan innebære felles cellulære og molekylære mekanismer 8,9, selv om dette er omstridt i litteraturen 1,10-12. Endelig kan denne protokoll tilpasses på lignende måte til genetisk modifiserte mus for å evaluere betydningen av individuelle gener i modulasjon av smerte. Det gir også et modellsystem for å evaluere effekten av potensielle terapeutiske midler for å forbedre opiat smertestillende effekter.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i henhold til de europeiske retningslinjene for behandling av forsøksdyr (European Communities rådsdirektiv 86/609/ECC) og de ​​etiske retningslinjene for undersøkelse av eksperimentell smerte i bevisste dyr 13. Mann C57BL6 / N Tac mus (10 uker, 25 - 30 g) ble plassert i en institusjonell dyr anlegget med en omsorg stab med ansvar for drift av anlegget i samsvar med miljøstandarder. Dyrene ble plassert i grupper (maksimum fem mus per bur) under en 12 timers / 12 timers lys / mørke-syklusen på en konstant temperatur (21 ± 1 ° C) med fri tilgang til mat og vann. Alle forsøkene ble utført på samme periode av dagen (10:00-16:00) ved hjelp av en kohort av 16 mus. Spesifikke materialer og utstyr er angitt i Materials tabellen.

En fem-trinns prosedyre for å overvåke morfin indusert-hyperalgesi og toleranse

Protokollen eroppdelt i fem sekvensielle trinn (AE) over en varighet på 15 dager Figur 1.

. En Mus Håndtering (Trinn A, d-7 til d-5)

  1. Håndter mus og tilvenne dem til fritt gå inn i rainer. Denne innledende skritt reduserer stress - og dermed minimere eventuelle misforståelser stress-indusert analgesi - og lar dyrene til å være vant til etterforsker, håndtering og manipulering i musen rainer. Hver mus blir skånsomt behandlet i 5 minutter hver dag.

. 2 Basal Nociceptive Response (Trinn B, d-4 til d-1)

  1. Mål hale abstinensventetider ved hjelp av Tail Immersion Test (TIT):
    1. Still termostaten til 48 ° C.
    2. Forsiktig introdusere musen inn i rainer. Dypp utstikkende 2/3 enden av halen inn i vannbadet og starte kronometeret.
    3. Stopp kronometer så snart musa trekker halen fra det varme vannet og registrere ventetid tid (i sek). I the fravær av nociceptive reaksjon, er en 25 sek cut-off som brukes for å forhindre vevsskade.
    4. Sett på mus i buret og teste den neste til slutten av serien.
    5. Gjenta nociceptive måldata to flere ganger, ta målinger fra dyrene i samme rekkefølge. Den nociceptiv respons latency (sek) for hver mus bestemmes som middelverdi for tre etterfølgende bestemmelser.
  2. Mål mekanisk respons ved å bruke Tail Trykktest (TPT)
    1. Forsiktig introdusere musen inn i rainer og plassere halen under kjeglespissen av analgesimeter.
    2. Trykk på fot-bryter for å anvende jevnt økende trykk mot den proksimale del av halen til den første nociceptive reaksjon (sliter, squeaking) oppstår. I øyeblikket dyret reagerer, spille inn den nåværende styrken (i gram) som utløser den nociceptiv respons. I fravær av en hvilken som helst reaksjon, er en 600 g cut-off-verdi som brukes til å unngå tutstede skade.
    3. Gjenta dette mål på median-og distale deler av halen til den samme musen. Et intervall på minst 30 sek er observert mellom tiltak på et gitt musen til å unngå tilpasning eller stress bias. Sett på mus i buret og teste neste dyret helt til slutten av serien (dvs. alle mus blir testet). Den nociceptive-verdi (g) for hver mus er tatt som en middelverdi for tre målinger (dvs. proksimale, median-og distale deler av halen på hvert dyr).
  3. Gjenta nociceptiv testing (alle prosedyrene skissert i trinn 2) på påfølgende dager, d-3 til d-en.

. Tre Measurement of Morphine analgesi (Trinn C; d0)

  1. Definer den beste kombinasjonen av dyr som tillater valg av to grupper (n = 8 per gruppe) av mus med stabile og sammenligngjennomsnitts nociceptive verdier, avhengig av hva nociceptiv modalitet (TIT eller TPT) er vurdert. Denne verdien vil bli tatt som basalnociceptiv respons av referanse for fremtidige 'Saline "og" Morphine "grupper.
  2. Mål kroppsvekt av hvert dyr.
  3. Tilbered en morfin-løsning (0,5 mg morfin pr ml) i sterilt fysiologisk saltvann (0,9% NaCl) for subkutan administrering (5 mg morfin pr kg av dyrets kroppsvekt).
  4. Mål nociceptiv respons latency (tatt som tidspunkt 0) for hver mus av både 'Saline' og 'Morphine' grupper i TIT (alle trinnene under 2.1 ovenfor). Deretter måler nociception i TPT (alle trinnene under 2.2 ovenfor).
  5. Injiser subkutant morfin (typisk 0,25 ml av en 0,5 mg / ml morfinløsning per 25 g musevekt) og saltløsning (0,25 ml per 25 g musevekt) til "morfin-og 'saltgrupper, henholdsvis.
  6. Mål nociceptive verdiene på TIT og TPT (alle prosedyrer som er skissert ovenfor under trinn 2,1 og 2,2 henholdsvis) over en gang-kurs (på 30 min interval) for å vurdere morfin (5 mg / kg)-indusert analgesi:
    1. Etter 30 min post-injeksjon, måle nociceptive respons (enkel bestemmelse) for hver mus av "saltvann" og "Morfin-grupper, ved hjelp av TIT deretter TPT.
    2. Deretter måler nociceptive grenseverdier (TIT og TPT) i alle mus på tidspunkter (i hr): 1-1.5-2-2.5-3 og 3,5 etter injeksjon.

4 Kronisk morfinbehandling - Morfin-indusert hyperalgesi. (Trinn D; d1 til d6)

  1. På dag: d1
    1. Mål nociceptive grenseverdier på TIT og TPT som beskrevet ovenfor (trinn 2,1 og 2,2). Nøye kommentere abstinensventetider og trykkgrenser for hvert dyr.
    2. Forbered en frisk morfin løsning som beskrevet i trinn 3.2.
    3. Injiser subkutant morfin (5 mg / kg kroppsvekt) til hele 'Morfin-gruppe, og fysiologisk saltvann (0,25 ml per 25 g musevekt) til "Saline' gruppe. La the dyr hvile til neste dag.
  2. På dager: d2, d3, d4, d5 og d6 gjenta operasjonene beskrevet under punkt 4.1

. 5 Bevis for Analgesic Toleranse (Trinn E; d7)

  1. Evaluere morfin-indusert analgesi i henhold til tid-retters paradigmet allerede beskrevet i kapittel 3.

6. Datainnsamling og Statistiske analyser

  1. Vurdering av Basal nociceptiv grenseverdier (Trinn B)
    1. Beregn for hver dag (over D-4 til D-1 periode) gjennomsnitt ± SEM-verdiene (n = 8) for basal nociceptive respons som gis av TIT og TPT innenfor "saltvann" og "Morfin-grupper.
    2. Plot betyr basal nociceptive verdier som en funksjon av tid (dager) for begge grupper Figur 2..
  2. Analyse av Morphine analgesi Time-kurs på dager d0 (Trinn C) og d7 (trinn E)
    1. Beregn, ved hvert tidspunkt etter at morfininjeksjon, gjennomsnitt ± SEM verdier (n = 8) for nociceptive svar som gis fra TIT (i sek) og TPT (ig) i hver gruppe.
    2. Plot betyr nociceptive responsverdier som en funksjon av tid for den "saltvann" og "Morfin 'grupper ved dag 0 Figur 3 og dag 7. Figur 5.
  3. Utvikling av morfin-indusert hyperalgesi (Trinn D)
    1. Beregn for hver dag (over D0-D7 behandlingsperioden) middelverdien ± SEM verdier (n = 8) for basale nociceptive responsverdier som gis fra TIT og TPT innenfor "Saline-behandlet" og "Morfin behandlet grupper.
    2. Plot betyr basal nociceptive responsverdier som en funksjon av tid (dager) for at 'saltløsning-behandlede "og" Morfin-behandlede grupper' Figur 4.
  4. Bevis for Analgesic Toleranse (trinn C og E)
    1. Bestem fra morfin tid-retters eXperiment utført ved d0 Figur 3 tidsverdien (eller tidsområde) morfin som kreves for å indusere en maksimal analgetisk respons.
    2. Ta denne verdi (vanligvis 30 min) som referanse tid til å anslå at d7 Figur 5 er nociception referanseverdi (saltvann-behandlet gruppe) og den faktiske analgetiske respons (morfin-behandlet gruppe) til akutt morfin.
    3. Nociceptive verdier målt ved tidspunkt 30 min fra morfin tid-retters eksperimenter utført på d0 og d7 for saltvann-behandlet og morfin-behandlede grupper, blir presentert som histogrammer Figur 6.
    4. Statistikk: Analyser av data ved hjelp av enveis gjentatte tiltak ANOVA. Faktorene av variasjon var behandlingen (mellom fagene) og tid (innen faget). For å kontrollere forskjeller separat i hver gruppe, ble gjentatt tiltak ANOVA utført. Sammenligninger mellom to grupper ble utført ved hjelp av uparet t-test eller paret t-test når det passer.
  5. Signifikansnivået er satt til p <0,05. Alle Statistiske analyser er gjennomført med STATview Software.

Representative Results

Vurdering av Basal nociceptiv Verdier av naive Mus (Trinn B)

TIT og TPT ble sekvensielt benyttet for hele kullet av mus (n = 16), noe som gir gjennomsnitts nociceptive responsverdier. Beste kombinasjon av dyrene tillates en a posteriori definisjon av to grupper (n = 8) til mus, referert til som Saline og morfin, som har tilsvarende og stabil basal nociceptive verdier Figur 2.. Den tilsvarende i begge grupper er gyldig uansett nociceptive test ( TIT: Figur 2A; TPT: figur 2B) som ble valgt.

Time-kurs for Morphine analgesi ved dag 0 (Trinn C)

Morfin analgesi ble evaluert etter en enkelt injeksjon (sc) av morfin (5 mg / kg) hos naive mus ved hjelp av både TIT Figur 3A og TPT figur 3B. I begge testene, statistiske analyser med en måte gjentatt tiltak ANOVA reveal at det er en signifikant interaksjon mellom behandling og tid for TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) og TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT og TPT data-analyser ved bruk av repeterte målinger ANOVA indikerer at det ikke er noen effekt av saltinjeksjon (F (7, 49) = 0,49, p> 0,05) og F (7, 49) = 1,85, p> 0,05 for henholdsvis TIT og TPT tester), mens morfin injeksjon induserer en sterk analgetisk hos mus (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) og F (7, 49) = 34,37, p <0,001 henholdsvis for TIT og TPT tester). Den maksimale smertestillende effekten av morfin ble nådd etter 30 min i TIT og etter 60 minutter i TPT som sammenlignet med saltvann-injiserte kontroller (p <0,001, uparet t-test).

Gjentatte Morphine administrasjonene induserer hyperalgesia i Mus (Trinn D)

Basal nociceptive verdier ble målt hver dagfør saltvann eller morfin administrasjon (se protokoll). Som vist i figur 4, en gang daglig morfinadministreringer i løpet av en 6 dagers behandlingsperiode induserte en signifikant og progressiv senking av termisk (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, repeterte målinger ANOVA, Fig. 4A) og mekaniske (F ( 7,56) = 15,55, p <0,001, gjentatt tiltak ANOVA; Figur 4B) basale nociceptive verdier. Hyperalgesi utviklet seg raskt som det begynte å være signifikant ved dag 1 i TIT (p <0,01, uparet t-test sammenlignet med saltvann-injiserte kontroller), og ved dag 2 i TPT (p <0,05, uparet t-test sammenlignet med saltvann -injisert kontroller).

Time-kurs for Morphine analgesi ved Dag 7, etter at Kronisk morfinbehandling (trinn E)

På dag 7, ble musene som fikk daglige morfin eller saltvann injeksjoner over en 7-dagers periode (d0 til d6) undersøkt i TIT Figur 5A og figur 5B TPT først for deres basale nociceptive verdier, og deretter for deres smertestillende respons på akutt morfin (5 mg / kg, sc.). I overensstemmelse med utvikling av hyperalgesi vist i figur 4, den basale nociceptive verdi (tid 0) i mus som ble behandlet med kronisk morfin var signifikant lavere enn den til saltvann-injiserte kontroll mus (p <0,001, uparet t-test). Etter akutt morfin, den nociceptive respons av kronisk morfin-behandlede gruppen betydelig økt, men bare litt overskredet den basale nociceptive verdien av saltvann-injiserte kontroll mus målt til 30 min i TIT og TPT (p <0,01 og p <0,05, uparet t -test, henholdsvis), og ved 60 minutter i TIT (p <0,05, uparet t-test). Fra 2 time etter at morfin behandlingen til slutten av forsøket, nociceptive respons tilbake til lavere verdier enn dem for kontroll mus (p<0,001, uparet t-test).

Sammenligning av Maksimale Smertestillende Responses av Mus til morfin før (Dag 0) og etter Kronisk morfinbehandling (Dag 7).

Nociceptive terskelverdier presentert i Figur 6 er fra TIT (A) og TPT (B) utført 30 min etter saltvann-eller morfininjeksjon som illustrert i figurene 3 (dag 0) og fem (dag 7). En sterk reduksjon av morfin smertelindring ble observert i mus etter kronisk morfinbehandling i 7 dager, sammenlignet med deres initielle analgetisk respons på dag 0 i begge nociceptive tester (p <0,001 paret t-test). Disse dataene viser at toleranse fikk utvikle seg i smerte overfølsom dyr.

Figur 1
Figur 1. En fem-trinns proprosedyren for å overvåke morfin indusert-hyperalgesia og toleranse. Protokollen er delt inn i fem sekvensielle trinn (AE) over en total varighet på 15 dager.

Fig. 2
. Figur 2 Definisjon av de basale nociceptive responsverdier (Trinn B; D-4 til D-1). Hale nedsenking (TIT) (A) og hale trykket (TPT) (B) tester er benyttet for hele serien av dyr for å evaluere sine basale nociceptive verdier. Deretter ble to grupper av mus (n = 8), referert til som "saltløsning" og "Morfin-grupper, er definert slik at de utviser stabil og sammenlignbare gjennomsnittlige nociceptive verdier, uansett nociceptive modalitet som betraktes.

Figur 3 Fig. 3. Time-kurs for morfin analgesi ved dag 0 (trinn C) i TIT (A) og TPT (B). Ble Det basale nociceptive responsverdi på mus bestemt hvert 30. min etter at enkelt morfin (5 mg / kg, sc. ) eller saltvann injeksjoner. Dataene er uttrykt som middel ± SEM, n = 8 mus per gruppe. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, uparet t-test sammenlignet med kontroll-gruppen.

Figur 4
. Figur 4 Utvikling av hyperalgesi etter gjentatt administrering av morfin (Trinn D; d1 til d6). Den basale nociceptive verdien hos mus ble bestemt ved TIT (A) og TPT (B) en gang daglig før morfin (5 mg / kg,fm.) eller saltvann administrasjon. Dataene er uttrykt som middelverdier ± SEM, n = 8 mus per gruppe. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ved uparet t-test sammenlignet med saltvann-behandlede kontrollgruppe.

Figur 5
Figur 5. Time-kurs for morfin analgesi ved kronisk morfin-behandlede mus ved dag 7 (trinn E) i TIT (A) og TPT (B). Mus som var kronisk behandling med morfin (sorte prikker) eller saltløsning (hvite trekanter) fra dag 0 til dag 6, fikk på dag 7 en enkelt injeksjon av morfin (5 mg / kg, sc.) eller saltløsning, henholdsvis. Den nociceptive respons hos mus ble bestemt hver 30. minutter etter morfin saltholdig eller injeksjon. Dataene er uttrykt som middel ± SEM, n = 8 mus per gruppe. * P <0,05, ** P & #60; 0,01 ved uparet t-test sammenlignet med saltvann-behandlede kontrollgruppe. Feilfelt som ikke overstiger symboler størrelse er skjult.

Figur 6
Figur 6. Sammenligning av maksimal smertestillende responser hos mus til morfin (5 mg / kg, sc.) Før (dag 0) og etter kronisk morfin behandling (dag 7). Verdier rapportert her, er fra eksperimentene er vist i figur 3, og Figur 5. nociceptive-verdier ble målt ved bruk av TIT (A) og TPT (B), 30 minutter etter morfin saltholdig eller injeksjon. Dataene er uttrykt som middel ± SEM, n = 8 mus per gruppe. *** P <0,001 ved paret t-test.

Discussion

Kritiske Steps

Valg av en dyremodell for nociception målinger

Variasjon i nociseptive og smertestillende følsomhet blant muse stammer har blitt undersøkt (anmeldelser 14-16) vurderinger ved hjelp av ulike smertemodeller med ulik deres etiologi (nociceptive, provoserende, nevropatisk), modalitet (termisk, kjemisk, mekanisk), varighet (akutt, tonic, kronisk) og administrasjonsstedet (cutaneous, subkutan, visceral). Sammenlignet med andre stammer, C57BL/6J ("J" for Jackson Laboratory) mus ble et populært dyremodell for smerte studier som viser de en høy basal nociceptiv følsomhet 17,18 og en moderat smertestillende respons på opiater 14,19. Etter kronisk morfinbehandling, de også utvikle betydelige smertestillende toleranse 20,21, hyperalgesia 21,22 og avhengighet 20,23.

nt "> Her eksperimenter ble utført på C57BL/6N Tac mus (" N "for National Institute of Health og" Tac "for Taconics gård) som tilhører en egen gren av B6 avstamning. Selv C57BL / 6 mus har vært lang ansett som utskiftbare, nyere studier pekt på betydelige atferdsforskjeller mellom C57BL/6J og C57BL/6N stammer 24. Spesielt lavere følsomhet av de tre C57BL/6N substrains (inkludert Tac ett) til akutt termisk smerte kan betraktes som en fordel for å teste dette fenotype.

Hannmus ble valgt som de aller fleste av smerte studier ved bruk av mus som dyremodell, blir utført på juvenile hanner 25. I våre hender, forutsatt at de robuste og reproduserbare data når undersøkt fra smertelindring eller hyperalgesia synspunkter. Av og til, vi la merke til en tendens til at C57BL/6N kvinner å gi flere variable responser, både i TIT og TPT tester. Selv om denne observasjonen kanreflektere naturlige variasjoner knyttet til hormonelle status for kvinner, generelle mekanismene bak kjønnsforskjeller i smerte og smertelindring fortsatt et spørsmål om kontrovers. Noen aspekter av denne varme debatten vil bli kort presentert i den neste "Begrensninger av teknikken"-delen.

Animal tilvenning

Mus ble først tillatt å venne seg til dyrefasilitet i løpet av en uke. I likhet med en hvilken som helst annen atferdsstudie, testing ble utført etter en 3-dagers-akklimatiseringsperiode (fig. 1, trinn A). Som nociceptive tester er følsomme for stress, kan første tiltak gi lengre ventetider enn etterfølgende hendelsene, spesielt i ikke-tilvent mus 26,27. Den tilvenning trinn tillater også oppnåelse av mer stabile nociceptive responsverdier innenfor samme dag, og mellom dagene Figurene 2 og 4. For å redusere døgnrytmen effekter på nociseptive og smertestillendefølsomhet 28,29, ble alle prøvelser gjennomført 10:00-04:00.

Valg av nociceptive tester

Nociceptive tester bruker enten termisk, mekanisk, kjemisk eller elektrisk stimuli (gjennomgang 26,27,30. Deres valg er kritisk som ulike nociceptive modaliteter kan bli behandlet gjennom ulike nociceptors og fiber 18,31,32.

Vi valgte hale nedsenking test (TIT) 33, en modifisert versjon av den klassiske hale flick test utviklet av D'Amour og Smith 34, og haletrykktest (TPT), tilpasset etter Randall og Selitto 35, som eksempler på termisk og mekaniske modaliteter å studere morfin-indusert analgesi, hyperalgesi og toleranse hos mus. Begge testene har vært mye brukt i rotter. Et avskåret tid ble systematisk definert for å unngå eller begrense vesentlig skade på vev.

Morfin-induksjoned analgesi, hyperalgesi og toleranse

Morfin, den prototypiske mu-opiat agonist, ble valgt her som det er en potent analgetikum og OIH-induser, både hos mennesker og mus 1,2,36. Morfin analgetisk potens er kjent for å variere med muse stammer, administrasjonsveier og nociceptive modaliteter. I C57BL / 6 mus, er pålitelig analgesi vanligvis oppnås etter subkutane injeksjoner av morfin i 1-20 mg / kg doseområdet 14,21. Følgelig, valgte vi å studere akutt smertelindring etter en enkelt administrasjon (sc) av morfin på 5 mg / kg, nær sin ED 50 verdi (7-20 mg / kg) vurdert fra termisk nociception 19,21.

Gjentatt administrering av morfin er ofte ledsaget av smertestillende toleranse (påvist enten fra en høyrerettet forskyvning av dose-responskurve eller fra en reduksjon i analgetisk respons amplitude eller varighet) og hyperalgesi (en forsterket følsomhet for smerte stimuli dokumentert fra en reduksjon i basal nociceptive verdi). Begge uønskede fenomener er avhengig av gnager-stammer, av arten av opiat forbindelse som er valgt, og doseringen, behandlingsvarighet, og på nociceptive modaliteter 21. For eksempel eksperimentelle paradigmer å studere toleranse og hyperalgesi består i daglig administrasjon av høye og konstante (20 til 40 mg / kg per dag) 22 eller av økende (opp til 50 eller til og med 200 mg / kg) 20,21 morfin doser. Følgelig fremmes vi utvikling av hyperalgesi og toleranse i C57BL / 6 mus ved daglig administrering av morfin (5 mg / kg; sc) i løpet av en 8-dagers periode. Dette moderat morfindose ble foretrukket framfor høyere seg til bedre etterligner klinikk bruk.

Sett opp av TIT operativ vindu

En mulig fallgruve i TIT kan være relatert til rollen av halen i termoregulering av gnagere 26,37. Som omgivelsestemperatur er en nøkkelfaktor i nociceptive responsvariasjoner, bør det holdes konstant (her ved 21 ° C) gjennom eksperimenter 38. Varme intensitet er vanligvis satt opp til å oppdage en nociceptiv svar innen 5 til 10 sek 27. Faktisk kan større latencies øke risikoen for overvåkning av dyr bevegelser som ikke er relatert til den nociceptive stimuli, mens kortere kan redusere differensialstrøm av testen. Vi utførte TIT målinger ved en fast temperatur på 48 ° C. Tail abstinensventetider var nær 9 sek (basal nociceptiv verdi) og varierte fra 4 sek (hyperalgesi) til 25 sek (maksimal analgesi; avskåret). I tillegg til praktiske grunner målinger av nociceptive responsverdier ved en fast temperatur, kan a priori bære samme repertoaret av nociceptors og kretser, og derved tilrettelegge for tolking.

Mulige Modifikasjoner

Optimalisering av TIT operative vinduet for analgesi og OIH measurements

Ved å fokusere på en smertestillende respons, kan lave utgangsverdier (høyere varmeintensitet) favoriserer påvisning av en forsinkelse i responsen. I sin tur, å ta konsekvensen av en smertefull stimulus eller utvikling av OIH, høyere utgangsverdiene (lavere varme intensitet, her 48 ° C) kan legge til rette for påvisning av raskere svar Figur 4.

Selv om vi har funnet morfin ved 5 mg / kg en enkel dose til å indusere en sterk analgetisk respons figur 3, og for å fremme (ved gjentatt administrering) signifikant hyperalgesi figur 4, kan doseringen være tilpasset som nevnt tidligere (kritisk trinn: morfin-indusert analgesi, hyperalgesia og toleranse). Eksempelvis kan lavere doser anvendes for å redusere analgesi amplitude (for derved å unngå Tids begrensninger), mens kan velges høyere doser for å akselerere hyperalgesi utbruddet og øke dens amplitude.

OveRall, optimalisering av "nociceptiv vinduet 'bør tilpasses den genetiske bakgrunnen til mus under studien og ta hensyn til muligheten for involvering av ulike sammensetninger av nociceptors og kretser.

Alternative opiat agonister (fentanyl, remifentanyl)

Selv om de fleste klinisk brukte opiater målrette det mu-opioid-reseptoren som agonister, de skiller seg vesentlig med hensyn til deres farmakologiske egenskaper både in vitro og in vivo. For eksempel, remifentanyl og fentanyl, i markert kontrast med morfin, oppfører seg som fulle agonister og fremme internalisering av mu-opioidreseptorer 39. Opiat-smertestillende midler som morfin og fentanyl har halveringstider i størrelsesorden 40 timer, mens remifentanyl har en ultra-korte halveringstid på flere minutter 41. Hos mennesker er beste bevis for OIH fra pasienter som fikk opiater under operasjonen, inkludert korttidsvirkende compounds som remifentanyl 2,42. Dermed kan fentanyl og remifentanyl være verdifulle verktøy for å studere utviklingen av hyperalgesi og toleranse i mus under TIT og TPT paradigmer.

Alternative moduser av induksjon av OIH (kronisk vs akutt administrasjon)

OIH er sett hos mennesker og dyremodeller som en konsekvens av opiat administrering, enten ved svært lave eller svært høye doser 1,2. Vi rapporterer her på OIH utvikling etter kronisk behandling av mus med moderate doser av morfin. Flere dager med behandling av C57BL/6N mus var nødvendig å bevis en klar og reproduserbar hyperalgesibestemmelsen stat Figur 4 Daglig morfininjeksjoner kan være tilstrekkelig erstattet med implanterte morfin pellets:. Ved fjerning sin, har både termisk hyperalgesi og mekanisk allodyni er allerede rapportert hos mus 43. Infusjon av opiater gjennom en mikro-osmotisk pumpe er en annen mulighet 44.. Hos gnagere, langvarig hyperalgesi er også oppnåelig ved akutt administrering av fentanyl ved hjelp av en protokoll ligne bruken av denne mu-opioid-agonist i human kirurgi 36,45,46.

Begrensninger av teknikken

Dyrearter og modeller for smerte

Komparative studier av en rekke musestammer gitt bevis for store variasjoner i nociceptive responser på smertefulle stimuli 17,31,47 og i OIH nivåer etter 4-dager morfinbehandling 22. Enten mekanismene bak smertebehandling og modulasjon i dyremodeller (mus og rotter) er relevant for kroniske smertepasienter er fortsatt en grunnleggende og åpnet spørsmål. Derfor bør mye forsiktighet skal betales til tolkning av data fra dyreforsøk og prediktiv validitet for mennesker 16.

Kjønnsforskjeller i smerte og smertelindring

ntent "> De fleste prekliniske studier på dyremodeller for smerte har blitt utført på mannlige gnagere 16,25,48. Til tross for dette valget bias, den nye utsikten var å vurdere menn som bedre respondere til opiat smertestillende 49,50, mindre utsatt for å utvikle opioid -indusert hyperalgesi 51,52 og mer tolerant til morfin analgesi 53 enn sine kvinnelige kolleger (54). Men kjønnsforskjeller med hensyn til nociception og smertestillende legemidler effekt ikke fortsette i en slik "en one size fits all" paradigme. Faktisk, en mengde data indikerer nå at en rekke variable kan påvirke størrelsen og retningen av kjønnsforskjeller som opioid medikament-effektivitet og selektivitet, nociceptive assay, genetisk bakgrunn, alder, gonado-hormonell status eller sosial interaksjon 48,54. Hos mennesker kliniske smerte er mer utbredt hos kvinner, men om dette faktum gjenspeiler faktiske kjønnsforskjeller er fortsatt et spørsmål om debatt 48,55,56. For eksempel global analyse av femti kliniske studier indikerte ingen signifikante forskjeller i smertestillende egenskaper mellom kjønnene, mens meta-analyser utført på pasienter-kontrollerte fag pekte på et betydelig større opioid effekt hos kvinner 57. Sistnevnte observasjon, som markert kontrast til hva som har vært funnet hos gnagere, reiser igjen flere spørsmål om opprinnelsen for slike avvik 16,48,55,57. Til sammen kjønnsforskjeller i smertelindring finnes og fortjener ytterligere fokus på underliggende mekanismer og kliniske implikasjoner.

Om nociceptive tester

Halen tilbaketrekning test er en spinal refleks, men det kan være gjenstand for supra påvirkninger 58. TIT er relativt lett å utføre på rotter, men krever mer kompetanse hos mus. Et potensielt problem er å holde musen i en riktig stilling uten å indusere uønsket stress. Den foreslåtte protokoll kan bli justert i henhold tilkohort størrelse. 16 dyr (8 kontroll og åtte behandlet) er enkel å håndtere så langt som måling av sine basale nociceptive grenseverdier (ved hjelp av TIT først, deretter TPT for hele serien av mus) er under bekymring. Overvåking analgesi tid kurs krever opprettelse av et nøyaktig tidsskjemaet og evalueringen av den maksimale antall dyr som kan bli testet (TIT først, deretter TPT) innen meddelt tidsintervall (her 30 min). Hele kullet av dyr kan dermed deles inn i undergrupper for å tillate eksperimentator å respektere kinetiske begrensninger.

Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende / Alternative metoder

OIH i rotter versus mus

Rotter har vært mye brukt for å studere opioid analgesi, hyperalgesi og toleranse, ved akutt eller kronisk opiat administrasjon 46,59-61. Faktisk, av flere praktiske grunner, at de kan betraktes som overlegenmus som en dyremodell for smerte eksperimenter 16,61. Men inntil nylig, generering av genmodifiserte rotter var ikke en enkel prosedyre. Som mange genmodifiserte musestammer er allerede tilgjengelig, tilbyr vår modell muligheten til å studere bidrag av mange individuelle gener i OIH og toleranseutvikling hos mus.

TIT og TPT versus andre nociceptive tester

TIT er en variant av halen flick test, den mest åpenbare forskjell er området for stimulering. I kontrast med strålevarme, nedsenking av halen i varmt vann fører til en rask og ensartet økning i temperaturen. Sammenlignet med andre former for termisk nociception testing (hot-plate eller Hargreaves tester), gir TIT ganske reproduserbare resultater både på tvers av og innenfor fag.

TPT er en svært populær test for studiet av mekanisk nociception 26,27,35 som trolig innebærerdistinkte nociceptive fiber og molekylære transdusere deretter TIT 32. Det gir raske og pålitelige målinger 59, men krever litt kompetanse fra eksperimentator og store dyre kohorter. Som et alternativ til den analgesimeter anvendt i foreliggende studie, andre fremgangsmåter eller apparater avhengig av strekklappene finnes (gjennomgang 27). TPT er best egnet for å studere mekanisk hyperalgesi mens von Frey filamenter er vanligvis tatt for å evaluere mekanisk allodyni (review 27).

Fremtidige Applications eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken

Den eksperimentelle OIH / toleranse modellen vi presenterer her kan være like tilpasset genmodifiserte mus for å vurdere rollen til enkelte gener i modulering av smerte. Det gir også et modellsystem for å undersøke effektiviteten av potensielle terapeutiske midler for å lindre kronisk smerte.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankrike) for hans støtte.

Dette arbeidet ble støttet av CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley og med tilskudd fra Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014,02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6N Tac mice Taconic, Ry, Denmark C57BL/6N Tac B6-M Male mice (25-30 g)
Morphine hydrochloride Francopia, Paris, France CAS no. 52-26-6 Delivered with special authorization
Syringes (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050000 Polypropylene, sterile, volume: 1 ml
Needles (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050101 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1)
Mouse restrainer Home-made Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples
Thermostated water bath GR150 Grant Instruments, Cambridge, UK GP 0540003
Analgesimeter Panlab, Barcelona, Spain LE 7306
Kaleidagraph software Synergy software, Reading, PA, USA Kaleidagraph 4.03  Scientific graphing
STATview software Free download, statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angst, M. S., Clark, J. D. Opioid-induced hyperalgesia. A qualitative systematic review. Anesthesiology. 104, 570-587 (2006).
  2. Chu, L. F., Angst, M. S., Clark, D. Opioid-induced hyperalgesia in humans. Molecular mechanisms and clinical considerations. Clin. J. Pain. 24, 479-496 (2008).
  3. Lee, M., Silverman, S., Hansen, H., Patel, V., Manchikanti, L. A comprehensive review of opioid-induced hyperalgesia. Pain Physician. 14, 145-161 (2011).
  4. Hutchinson, M. R., Shavit, Y., Grace, P. M., Rice, K. C., Maier, S. F., Watkins, L. R. Exploring the neuroimmunopharmacology of opioids: An integrative review of mechanisms of central immune signaling and their implications for opioid analgesia. Pharmacol. Rev. 63, 772-810 (2011).
  5. Wang, X., et al. Morphine activates neuroinflammation in a manner parallel to endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 6325-6330 (2012).
  6. Colpaert, F. C. System theory of pain and of opiate analgesia: No tolerance to opiates. Pharmacol. Rev. 48, 355-402 (1996).
  7. Simonnet, G., Rivat, C. Opioid-induced hyperalgesia: abnormal or normal pain. NeuroReport. 14, 1-7 (2003).
  8. Mao, J., Sung, B., Ji, R. R., Lim, G. Chronic morphine induces downregulation of spinal glutamate transporters: implications in morphine tolerance and abnormal pain sensitivity. J. Neurosci. 22, 8312-8323 (2002).
  9. King, T., Ossipov, M. H., Vanderah, T. W., Porreca, F., Lai, J. Is paradoxical pain induced by sustained opioid exposure an underlying mechanism of opioid antinociceptive tolerance. Neurosignals. 14, 194-205 (2005).
  10. DuPen, A., Shen, D., Ersek, M. Mechanisms of opioid-induced tolerance and hyperalgesia. Pain Management Nursing. 8, 113-121 (2007).
  11. Chu, L. F., et al. Analgesic tolerance without demonstrable opioid-induced hyperalgesia : A double-blinded, randomized, placebo-controlled trial of sustained-release morphine for treatment of chronic nonradicular low-back. 153, 1583-1592 (2012).
  12. Ferrini, F., et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl- homeostasis. Nature Neurosci. 16, 183-192 (2013).
  13. Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigation of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
  14. Mogil, J. S. The genetic mediation of individual differences in sensitivity to pain and its inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 7744-7751 (1999).
  15. Mogil, J. S., et al. Screening for pain phenotypes : Analysis of three congenic mouse strains on a battery of nine nociceptive tests. Pain. 126, 24-34 (2006).
  16. Mogil, J. S. Animal models of pain : progress and challenges. Nature Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
  17. Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception I : Responses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception. Pain. 80, 67-82 (1999).
  18. Larivière, W. R., et al. Heritability of nociception. III. Genetic relationships among commonly used assays of nociception and hypersensitivity. Pain. 97, 75-86 (2002).
  19. Elmer, G. I., Pieper, J. O., Negus, S. S., Woods, J. H. Genetic variance in nociception and its relationship to the potency of morphine-induced analgesia in thermal and chemical tests. Pain. 75, 129-140 (1998).
  20. Eidelberg, E., Erspamer, R., Kreinick, C. J., Harris, J. Genetically determined differences in the effects of morphine on mice. Eur. J. Pharmacol. 32, 329-336 (1975).
  21. Kest, B., Hopkins, E., Palmese, C. A., Adler, M., Mogil, J. S. Genetic variation in morphine analgesic tolerance: A survey of 11 inbred mouse strains. Pharmacol. Biochem. Behav. 73, 821-828 (2002).
  22. Liang, D. -Y., Liao, G., Wang, J., Usuka, J., Guo, Y., Peltz, G., Clark, J. D. A genetic analysis of opioid-induced hyperalgesia in mice. Anesthesiology. 104, 1054-1062 (2006).
  23. Kest, B., Palmese, C. A., Hopkins, E., Adler, M., Juni, A., Mogil, J. S. Naloxone-precipitated withdrawal jumping in 11 inbred mouse strains : Evidence for common genetic mechanisms in acute and chronic morphine physical dependence. Neurosci. 115, 463-469 (2002).
  24. Bryant, C. D., et al. Behavioral differences among C57BL/6 substrains: Implications for transgenic and knockout studies. J. Neurogenet. 22, 315-331 (2008).
  25. Mogil, J. S., Chanda, M. L. The case for the inclusion of female subjects in basic science studies of pain. Pain. 117, 1-5 (2005).
  26. Le Bars, D., Gozariu, M., Cadden, S. W. Animal models of nociception. Pharm. Rev. 53, 597-652 (2001).
  27. Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neurosci. 211, 39-50 (2012).
  28. Kavaliers, M., Hirst, M. Daily rythms of analgesia in mice: effects of age and photoperiod. Brain Res. 279, 387-393 (1983).
  29. Castellano, C., Puglisi-Allegra, S., Renzi, P., Oliverio, A. Genetic differences in daily rhythms of pain sensivity in mice. Pharmacol. Biochem., and Behavior. 23, 91-92 (1985).
  30. Sandkühler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol. Rev. 89, 707-758 (2009).
  31. Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception II. ‘Types’ of nociception revealed by genetic correlation analysis. Pain. 80, 83-93 (1999).
  32. Scherrer, G., et al. Dissociation of the opioid receptor mechanisms that control mechanical and heat. 137, 1148-1159 (2009).
  33. Janssen, P. A. J., Niemegeers, C. J. E., Dony, J. G. H. The inhibitory effect of fentanyl and other morphine-like analgesics on the warm water induced tail withdrawal reflex. Arzneimittelforsch. 13, 502-507 (1963).
  34. Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 72, 74-79 (1941).
  35. Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 111, 409-419 (1957).
  36. Elhabazi, K., et al. Involvement of neuropeptides FF receptors in neuroadaptative responses to acute and chronic opiate treatments. Br. J. Pharmacol. 165, 424-435 (2012).
  37. Berge, O. -G., Garcia-Cabrera, I., Hole, K. Response latencies in the tail-flick test depend on tail skin temperature. Neurosci. Lett. 86, 284-288 (1988).
  38. Benoist, J. -M., Pincedé, I., Ballantyne, K., Plaghi, L., Le Bars, D. Peripheral and central determinants of a nociceptive reaction: An approach to psychophysics in the rat. PLoS ONE. 3, e3125 (2008).
  39. Morgan, M. M., Christie, M. J. Analysis of opioid efficacy, tolerance, addiction and dependence from cell culture to human. Br. J. Pharmacol. 164, 1322-1334 (2011).
  40. Trescot, A. M., Datta, S., Lee, M., Hansen, H. Opioid pharmacology. Pain Physician. 11, S133-S153 (2008).
  41. Egan, T. D., et al. The pharmacokinetics of the new short-acting opioid remifentanil (GI87084B) in healthy adult male volunteers. Anesthesiology. 79, 881-892 (1993).
  42. Hansen, E. G., Duedahl, T. H., Rømsing, J., Hilsted, K. L., Dahl, J. B. Intra-operative remifentanil might influence pain levels in the immediate post-operative period after major abdominal surgery. Acta Anaesthesiol Scand. 49, 1464-1470 (2005).
  43. Li, X., Angst, M. S., Clark, J. D. A murine model of opioid-induced hyperalgesia. Mol. Brain Res. 86, 56-62 (2001).
  44. Varnado-Rhodes, Y., Gunther, J., Terman, G. W., Chavkin, C. Mu opioid analgesia and analgesic tolerance in two mouse strains. C57BL/6 and 129/SvJ. Proc. West Pharmacol. Soc. 43, 15-17 (2000).
  45. Celerier, E., et al. Long-lasting hyperalgesia induced by fentanyl in rats: preventive effect of ketamine. Anesthesiology. 92, 465-472 (2000).
  46. Celerier, E., Simonnet, G., Maldonado, R. Prevention of fentanyl-induced delayed pronociceptive effects in mice lacking the protein kinase C gamma gene. Neuropharmacol. 46, 264-272 (2004).
  47. Larivière, W. R., Chesler, E. J., Mogil, J. S. Transgenic studies of pain and analgesia: Mutation or background phenotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 467-473 (2001).
  48. Mogil, J. S. Sex differences in pain and pain inhibition: multiple explanations of a controversial phenomenon. Nature Rev. Neurosci. 13, 859-866 (2012).
  49. Kest, B., Wilson, S. G., Mogil, J. S. Sex differences in supraspinal morphine analgesia are dependent on genotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1370-1375 (1999).
  50. Kest, B., Sarton, E., Dahan, A. Gender differences in opioid-mediated analgesia. Anesthesiology. 93, 539-547 (2000).
  51. Holtman, J. R., Wala, E. P. Characterization of morphine-induced hyperalgesia in male and female rats. Pain. 114, 62-70 (2005).
  52. Juni, A., et al. Sex differences in hyperalgesia during morphine infusion: effect of gonadectomy and estrogen treatment. Neuropharmacol. 54, 1264-1270 (2008).
  53. Craft, R. M., et al. Sex differences in development of morphine tolerance and dependence in the rat. Psychopharmacol. 143, 1-7 (1999).
  54. Bodnar, R. J., Kest, B. Sex differences in opioid analgesia, hyperalgesia, tolerance and withdrawal: central mechanisms of action and roles of gonadal hormones. Hormones Behav. 58, 72-81 (2010).
  55. Greenspan, J. D., et al. Studying sex and gender differences in pain and analgesia: A consensus report. Pain. 132, S26-S45 (2007).
  56. Fillingim, R. B., Ness, T. J. Sex-related hormonal influences on pain and analgesic responses. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 485-501 (2000).
  57. Niesters, M., et al. Do sex differences exist in opioid analgesia? A systematic review and meta-analysis of human experimental and clinical studies. Pain. 151, 61-68 (2010).
  58. Millan, M. J. Descending control of pain. Prog. Neurobiol. 66, 355-474 (2002).
  59. Celerier, E., Laulin, J. -P., Corcuff, J. -B., Le Moal, M., Simonnet, G. Progressive enhancement of delayed hyperalgesia induced by repeated heroin administration : A sensitization process. J. Neurosci. 21, 4074-4080 (2001).
  60. Simonin, F., et al. RF9, a potent and selective neuropeptide FF receptor antagonist, prevents opioid-induced tolerance associated with hyperalgesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 466-471 (2006).
  61. Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav. Brain Res. 125, 65-73 (2001).

Tags

Neuroscience mus nociception hale nedsenking test hale trykktest morfin analgesi opioidindusert hyperalgesi toleranse
Vurdering av Morphine-indusert hyperalgesi og smertestillende Toleranse i Mus Bruke termiske og mekaniske nociceptiv modaliteter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., … More

Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., Simonin, F. Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities. J. Vis. Exp. (89), e51264, doi:10.3791/51264 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter