Summary
我们描述了一个协议，研究阿片类药物引起的痛觉过敏和耐受小鼠的发展。基于对幼稚和吗啡处理的动物的热和机械伤害性反应的测量，它允许以量化的增加疼痛的敏感性（痛觉过敏）和减少在慢性阿片类施用相关镇痛（公差）。
Abstract
阿片类药物引起的痛觉过敏和耐受严重影响阿片类药物的临床疗效在动物和人类的止痛药。这两种现象背后的分子机制尚不十分清楚，并阐明他们应该从动物模型的研究，并从相应的实验方案的设计中获益。
我们在这里描述用于诱导，记录和量化吗啡诱导的痛觉过敏以及用于证明镇痛耐受性，使用尾浸没和尾部压力测试在野生型小鼠中的方法途径。如图所示，在视频中，协议分为五个连续的步骤。处理和习惯的阶段允许进行安全测定动物的基础伤害性反应。慢性吗啡诱导显著痛觉过敏如通过增加热和机械感度，而镇痛时间课程后，比较急性或代表eated吗啡治疗清楚地表明宽容在镇痛响应幅度的下降体现的发展。这个协议可以同样适应于转基因小鼠，以评估各个基因在伤害感受和吗啡镇痛的调节作用。它还提供了一个模型系统来调查潜在的治疗药物的有效性，以提高阿片类药物镇痛效果。
Introduction
阿片类药物引起的痛觉过敏（OIH），镇痛耐受性限制了动物和人类的1-3阿片 类药物的临床疗效。亲伤害性（抗阿片）6,7系统的促炎性4,5或参与正在探讨的假设。相关OIH和宽容机制的阐明就必须的组合在体内和体外的方法，使用合适的动物模型，实验方案和分子的工具。
行为药理学的主导范式，以监测和量化实验动物的镇痛和痛觉过敏状态（大鼠，小鼠）。有害刺激（热，机械或化学）的动物的一个方便的身体部位（后爪，尾）的应用导致nocifensive停药，可以轻松得分。
在这里我们提出一个方法途径诱导，记录和量化OIH和公差在野生型小鼠中，使用尾浸没和尾部压力测试。该程序允许一种简单，灵敏，重现性测定小鼠热和机械伤害的响应值。这表现在视频协议，C57BL / 6小鼠体验显著以下痛觉过敏慢性吗啡管理和维护这几天。热和机械痛觉值显著减少，相比于幼稚动物的基线测量。此外，我们的实验装置允许监视，除了OIH，镇痛回应吗啡（公差）的衰落的发展。给出的数据支持这样的观点痛觉过敏和耐受性可能涉及共同的细胞和分子机制8,9，尽管这是有争议的文献1,10〜12。最后，这个协议可以同样适应于转基因小鼠，以评估各个基因在调制中的作用化的痛苦。它还提供了一个模型系统来评估潜在的治疗药物的有效性，以提高阿片类药物的镇痛效果。
Protocol
所有实验均严格按照实验动物（欧共体理事会指令86/609/ECC）以及对实验性疼痛的动物意识调查13道德准则的照顾欧洲指南。雄性C57BL6 / N西塔小鼠（10周，25 - 30克）被安置在一个机构动物设施与保健人员负责符合环保标准经营设施的。动物饲养在组（每笼最高五只小鼠）下12小时/ 12小时亮/暗周期在一个恒定的温度（21±1℃）免费获得食物和水。所有实验均在每天的同一时段（上午10:00至下午4:00）使用16个小鼠的队列进行。具体的材料和设备都显示在材料表。
五步程序监督吗啡诱导痛觉过敏和耐受性
该协议是分为五个连续的步骤（AE）超过15天图1的持续时间。
1小鼠处理（步骤A，D-7 D-5）
- 处理小鼠和习惯于他们自由进入限制器。这第一步减轻压力 - 从而减少应激诱导的镇痛任何混乱 - 和使动物的习惯的调查，处理和操作到鼠标限制器。每个鼠标轻轻5分钟每天要处理的。
2，基础伤害性反应（步骤B，D-4 D-1）
- 使用尾部浸渍试验（TIT）测量尾退缩潜伏期：
- 温控器设置为48°C。
- 轻轻地引入鼠标放到限制器。沾其尾部的突起2/3的一端插入水浴启动计时器。
- 只要鼠标撤回它的尾巴从热水停止计时器并记录等待时间（以秒为单位）。在日ë没有任何伤害性反应的，一个25秒的截止是用来防止组织损伤。
- 代替鼠标在笼子里，并做下一个，直到系列的结尾。
- 重复的伤害性反应的测量两次，取测量从在同一顺序的动物。伤害性反应潜伏期（秒）为每只小鼠被确定为三个连续测定的平均值。
- 测量力学响应使用尾部压力试验（TPT）
- 轻轻地引入鼠标放到限制器和analgesimeter的锥顶下放置它的尾巴。
- 踩下脚踏开关适用均匀增加压力到尾部的近端部分，直到第一个伤害性反应（挣扎，吱吱）发生。在动物反应的时刻，记录当前的力（单位为克），该引出的疼痛反应。在没有任何反应时，600克截止值用于避免吨发出的损害。
- 重复此测量在相同的小鼠的尾部的中间和远侧部分。至少30秒的时间间隔在给定的鼠标措施，以避免适应或应力偏压之间观察到。代替鼠标在笼子里，并测试下一个动物直到系列（ 即所有小鼠进行测试）结束。感受伤害值（克）对每只小鼠取为三个测量（ 即近端，中位数，每个动物的尾巴的顶端部分）的平均值。
- 重复伤害性测试（根据第2步中列出的所有程序），在随后的日子里，D-3 D-1。
3，测量吗啡镇痛的（步骤C; D0）
- 确定动物的最佳组合，使小鼠两次与稳定和可比的平均伤害值组（n = 8每组），取其伤害性方式（TIT或TPT）的选择考虑。这个值将被当作基底对未来“盐”和“吗啡”参照群体伤害性反应。
- 测量体重每一个动物。
- 在无菌的生理盐水（0.9％生理盐水），用于皮下施用（每千克动物体重5毫克吗啡）准备一个吗啡溶液（每毫升0.5毫克吗啡）。
- 测量疼痛反应潜伏期（取时间点0）为“盐碱地”，并在TIT'吗啡'组（2.1根据以上所有步骤）的每只小鼠。然后测量痛觉的TPT（在2.2以上的所有步骤）。
- 皮下注入吗啡（通常为0.25毫升每25克鼠标重量的0.5毫克/毫升吗啡溶液）和生理盐水（每25克鼠标重量0.25毫升）的'吗啡'和'盐水'组，分别为。
- 测量在TIT和TPT伤害值（根据以上列出的所有程序步骤2.1和2.2，分别）在一个时间过程（在30分钟INTERV人），以评估吗啡（5毫克/公斤）的镇痛作用：
- 30分钟后喷射之后，测量疼痛反应（单测定）为“盐水”和“吗啡'基团的各小鼠，使用TIT那么TPT。
- 1-1.5-2-2.5-3和3.5注射后：然后，在时间点（以小时为单位）衡量在所有小鼠疼痛反应值（TIT和TPT）。
4慢性吗啡处理 - 吗啡诱发的痛觉过敏。（步骤D，D1至D6）
- 在第一天：D1
- 在如上所述的TIT和TPT测量疼痛反应值（步骤2.1和2.2）。仔细标注退缩潜伏期，并为每个动物的压力限制。
- 准备一个新的吗啡溶液如在步骤3.2详述。
- 皮下注入吗啡（5 mg / kg体重），以整个'吗啡'组和生理盐水（每25克鼠标重量0.25毫升）的'盐'组。让日ë动物休息，直到第二天。
- 关于天：D2，D3，D4，D5和D6重复下4.1节所述之业务
5，证据镇痛耐受性（步骤E; D7）
- 根据第3节中已经详述的时间过程范式评估吗啡的镇痛作用。
6，数据采集和统计分析
- 的基础伤害性反应的评估值（步骤B）
- 计算出的每一天（在D-4 D-1期）的平均值±标准误差值（N = 8），用于从TIT和TPT的“盐”和“吗啡”组内给予基础伤害性反应。
- 情节意味着基础伤害值的时间（天）的函数两组图2。
- 吗啡镇痛时间，当然在天D0分析（步骤C）和D7（步骤E）
- 计算，在吗啡后各时间点注射，平均值±标准误差值（N = 8），用于从TIT各组给予（以秒为单位）和TPT（克）伤害性反应。
- 积平均伤害性反应的值作为时间的“盐”和“吗啡'基团在天的函数0 图3和7天图5。
- 吗啡诱导的痛觉过敏（步骤D）的发展
- 计算出的每一天（在D0-D7治疗期）的平均值±标准误差值（N = 8），用于从TIT和TPT中的“盐水处理”和“吗啡治疗团体给予基础伤害性反应值。
- 情节意味着基础伤害性反应值随时间（天）为'盐水处理“和”吗啡治疗团体图4的功能。
- 为镇痛耐受性的证据（步骤C和E）
- 从吗啡时期间E确定xperiment在D0 图3诱导的最大止痛效果所需的吗啡的时间价值（或时间范围）进行。
- 取这个值（通常为30分钟）作为基准时间来估计在D7 图5中的伤害感受基线值（生理盐水处理组）和实际止痛反应（吗啡处理组），以急性吗啡。
- 在时间点来自于D0和D7为生理盐水治疗组和吗啡处理组进行吗啡时程实验30分钟采取伤害性的值，被作为直方图图6。
- 统计：使用单向重复测量方差分析分析数据。变化的因素是治疗（受试者之间）和时间（内主体）。要单独检查各组中的差异，重复测量的方差分析。采用非配对t检验或配对t检验在适当的时候进行了两组之间的比较。
- 显着性水平设为P <0.05。所有统计分析使用的是STATview软件进行。
Representative Results
天真的小鼠基础伤害性价值评估（步骤B）
TIT和TPT依次应用到小鼠的整个队列（N = 16），提供的平均疼痛反应值。动物的最佳组合，使2组（n = 8）小鼠的称为盐水和吗啡，其显示类似的，稳定的基础伤害值图2。两组的等价是有效的任何伤害性试验（的后验概率的定义多： 图2A; TPT： 图2B）被选中。
时间课程吗啡镇痛在第0天（步骤C）
以下吗啡单次注射（SC）（5毫克/千克）在幼稚小鼠同时使用TIT 图3A和TPT 图3B吗啡镇痛进行评价。在两种测试中，有一种方式重复测量ANOVA revea统计分析升，有用于治疗TIT和时间之间的显著交互作用（F（7，98）= 72，P <0.001）和TPT（F（7，98）= 31，P <0.001）。 TIT和TPT数据分析采用重复测量方差分析表明，有盐水注射没有影响（F（7，49）= 0.49，P> 0.05）和F（7，49）= 1.85，P> 0.05分别为TIT和TPT试验），而吗啡注射诱导小鼠较强的镇痛（F（7，49）= 92.46，P <0.001）和F（7，49）= 34.37，P <0.001分别为TIT和TPT测试）。后在TIT 30分钟，并在TPT 60分钟相比，注射了生理盐水的对照组（P <0.001，配对t-检验）之后达到吗啡的最大止痛作用。
反复主管吗啡诱导痛觉过敏小鼠（步骤D）
基础伤害值的测定每一天生理盐水或吗啡给药前（见协议）。如示于图4中 ，每日一次给药吗啡在6天的治疗期间引起一个显著和逐步降低的热（F（7，56）= 11.6，P <0.001，重复测量ANOVA， 图4A）和机械式（F（ 7,56）= 15,55，P <0.001，重复测量的方差分析; 图4B）基础伤害值。痛觉过敏的发展很快，因为它开始是显著在第1天在TIT（P <0.01，配对t-检验，相比于盐水注射的对照组）和在TPT 2天（P <0.05，配对t-检验，相比于盐水喷射控制）。
时间过程的吗啡镇痛的7天，慢性吗啡处理（步骤E）后
第7天，超过7天期间（D0到D6）每天接受吗啡或生理盐水注射的小鼠进行了检查T中IT 图5A和TPT 图5B第一为他们的基础伤害值，然后他们对急性吗啡镇痛的响应（5毫克/公斤，SC）。在与痛觉过敏的图4中所示的开发协议，即分别慢性吗啡处理后的小鼠的基础伤害值（时间为0）显着高于盐水注射的对照小鼠（P <0.001，配对t-检验）的显著更低。以下急性吗啡，慢性吗啡处理组的疼痛反应显著增加，但仅稍微超过注射盐水的对照小鼠在TIT 30分钟和TPT（P <0.01 和 p <0.05， 配对 t测得的基底伤害性值测，分别）和在TIT 60分钟（P <0.05，配对t-检验）。从2小时吗啡处理后直至实验结束，伤害性反应回到较低的值比对照组小鼠的（对<0.001，配对t-检验）。
慢性吗啡处理（7天）的小鼠的最大镇痛回应吗啡比较前（0天）后。
如图6所示，痛觉阈值是从TIT（A）和示于图3（第7天）（第0天）和5 TPT（B）中进行30分钟的盐水或吗啡注射后。在吗啡镇痛一个强大的下降，观察小鼠后，在两个伤害性测试在第0天他们最初的镇痛反应（P <0.001配对t检验）比较，慢性吗啡治疗7天。这些数据表明，宽容并发展过敏性疼痛的动物。
图1：五步亲cedure监控吗啡诱导的痛觉过敏和耐受性。协议分为五个连续的步骤（AE）超过15天的总工期。
图2定义的基感受伤害响应值（步骤B，D-4 D-1）的尾部浸入（TIT）（A）和尾部压力（TPT）（B）的测试也适用于整个系列的动物为了评估其基础伤害值。此后，两组小鼠（ 每组 8 只 ），被称为“盐”和“吗啡'基团，被定义为使得它们显示出稳定的和可比较的平均疼痛值，无论伤害性方式被考虑。
图3。时间课程在第0天（步骤三）在TIT（A）和TPT（B）吗啡镇痛。小鼠的基础伤害性反应值确定单吗啡（5毫克/千克，皮下注射后每隔30分钟。 ）或生理盐水注射。数据表示为平均值±SEM，每组n = 8只小鼠。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，配对t-检验比较对照组。
。以下吗啡反复给药（步骤D，D1至D6）图4发展痛觉过敏。小鼠的基础伤害值由TIT确定 （A）和TPT（B）每日一次前吗啡（5毫克/公斤，SC）或生理盐水给药。数据表示为平均值±SEM，每组n = 8只小鼠。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001通过非配对t检验，与盐水处理的对照组进行比较。
图5。时间课程吗啡镇痛慢性吗啡处理的小鼠在第7天（步骤E）在TIT（A）和TPT（B）的小鼠进行了长期使用吗啡（黑点）或生理盐水（白色三角形）处理从第0天至第6天，第7天接受单次注射吗啡（5毫克/千克，皮下注射）或生理盐水，分别。小鼠的疼痛反应测定吗啡或生理盐水注射后每隔30分钟。数据表示为平均值±标准差，正每组= 8只小鼠。 * P <0.05，** P＆＃60; 0.01通过非配对t检验，与盐水处理的对照组进行比较。误差线不超过符号的大小是隐藏的。
图6的小鼠的前（第0天）和后这里报道慢性吗啡治疗（7天）。的值是从图3和图5所示的实验最大的镇痛反应，吗啡（5毫克/千克，皮下注射）的比较 。伤害性值使用TIT（A）和TPT（B）吗啡或生理盐水注射后30分钟测量。数据表示为平均值±标准差，正每组= 8只小鼠。 *** P <0.001通过配对t检验。
Discussion
关键步骤
动物模型的痛觉测量的选择
其中小鼠品系变异性疼痛和镇痛的敏感性已被审查（评论14-16）评论使用各种疼痛模型在不同的病因（疼痛，炎症，神经性），情态（热学，化学，机械），持续时间（急性，补虚，慢性）和站点管理（皮肤，皮下，内脏）。相较于其他菌株，C57BL/6J（“J”的杰克逊实验室）小鼠成为一个受欢迎的动物模型，为疼痛的研究，因为他们表现出高的基础痛觉敏感性17,18和稳健的镇痛反应阿片类药物14,19。下面慢性吗啡处理，他们也制定显著镇痛耐受20,21，痛觉过敏21,22和20,23的依赖。
NT“>在这里，实验在C57BL/6N小鼠交咨会进行（”N“为美国国立卫生研究院和”西塔“的Taconics农场），其中属于B6血统的一个独立分支。虽然C57BL / 6小鼠已久认为是可以互换的，最近的研究指出，C57BL/6J和C57BL/6N菌株24之间显著行为上的差异，特别是，这三个C57BL/6N substrains（包括西塔1）急性热疼痛的较低灵敏度可被视为一个优势，为测试这种表型。雄性小鼠被选为疼痛的研究绝大多数，利用老鼠作为动物模型，对未成年男性25执行。在我们的手中，他们提供了强大的和可重复的数据来看镇痛或痛觉检查点时。偶尔，我们注意到一个倾向C57BL/6N女性提供更多的变量的反应，无论是在TIT和TPT测试。虽然这可能会观察反映挂女性的荷尔蒙状态的自然变化，相关的疼痛和镇痛的性别差异整体机制目前仍争议的问题。这个热议的某些方面进行简要介绍一节中的下一个'技术的局限性“。
动物习惯
小鼠首次获准以熟悉的动物设施内一个星期。类似于任何其他行为的研究中，试验进行以下3天的驯化期（ 图1，步骤A）。由于伤害性测试是压力敏感的，第一措施可能获得更长的等待时间比后续的，特别是在非习惯于小鼠26,27。习惯化步骤也允许的范围内的同一天和天之间更稳定的伤害感受响应值的获得方法图2和图4。为了减少疼痛和镇痛作用的昼夜灵敏度28,29，所有的性化验是上午10:00和下午4:00进行。
选择伤害性测试
感受伤害测试使用任一热，机械，化学或电刺激（综述26,27,30，如伤害性不同的方式可以通过不同的感受器和纤维18,31,32被处理他们的选择是至关重要的。
我们选择了尾部浸渍试验（TIT）33，经典的甩尾测试由D'AMOUR和史密斯34研制的修改版本，以及尾部压力试验（TPT），改编自兰德尔和Selitto 35，作为热例子，机械方式来研究吗啡的镇痛作用，痛觉过敏和耐受小鼠。这两个测试已经被广泛地应用于大鼠。一个截止时间进行了系统的定义，以避免或限制组织损伤的风险。
吗啡电感编辑镇痛，痛觉过敏和耐受性
吗啡，原型μ-阿片受体激动剂，在这里选择的，因为它是一种强效镇痛药和OIH诱导物，无论是在人类和小鼠1,2,36。吗啡的镇痛效力是已知的随小鼠品系，给药途径和伤害感受的方式。在C57BL / 6小鼠，可靠的镇痛效果通常可以得到以下的吗啡在1-20毫克/公斤的剂量范围14,21皮下注射。因此，我们选择了研究急性镇痛下单次给药吗啡（SC）在5毫克/公斤，接近其ED 50值（7-20毫克/千克），从热痛觉19,21评估。
吗啡反复给药常伴有镇痛耐受性和痛觉过敏（对疼痛stimul的灵敏度恶化（或者从剂量 - 反应曲线的向右移位或从镇痛响应振幅或持续时间的减少证明）我从基础伤害值减少为凭证）。这两种不良现象依赖于啮齿动物品系，其上选择了鸦片化合物及其剂量，治疗持续时间和伤害性方式21的性质。例如，实验范式来研究宽容和痛觉过敏家道或升级（高达50甚至200毫克/千克）20,21吗啡剂量高而稳定的（20〜40毫克/千克每天）22日常管理。超过8天期间，因此，我们通过每天的吗啡给药（SC 5毫克/公斤）促进痛觉过敏和耐受性的发展C57BL / 6小鼠。这种温和的吗啡剂量优于以更好地模拟临床用量则较高。
设立TIT操作窗口
在TIT一个可能的缺陷可能与尾巴的老鼠26,37的体温调节中的作用。由于环境温度是在nocicept的关键因素香港专业教育学院响应变化，它应保持不变（这里是21°C时）在整个实验38。热强度通常设置为检测在5至10秒27伤害性反应。实际上，更大的延迟可能增加风险监测动物的动作无关的伤害性刺激，而较短的可能降低了测试的差分功耗。我们在48℃的固定温度下进行测量TIT尾退缩潜伏期接近9秒（基础伤害值）和25秒从不同的4秒（痛觉过敏）（最大镇痛;切断）。除了现实的原因，在一个固定的温度疼痛反应值测量可先验涉及伤害感受器和电路的同一剧目，从而便于数据的判读。
可能的修改
镇痛和OIH measureme的TIT操作窗口的优化NTS
当专注于镇痛响应，低基准值（较高的热强度）可能有利于在响应延迟的检测。反过来，以解决疼痛刺激的后果或OIH的发展，较高的基准值（较低的热强度;这里48°C）可能有助于更快地响应检测图4。
虽然我们发现吗啡在5毫克/公斤的剂量方便诱发强大的止痛效果图3和推广（后重复给药）显著痛觉过敏图4，如前（关键一步中提到其用量可适应：吗啡的镇痛作用，痛觉过敏和耐受性）。例如，较低的剂量可用于减少镇痛振幅（从而避免截断的限制），而较高剂量可被选择以加速痛觉过敏发病和增加它的幅度。
奥雅纳拉尔中，“痛觉窗口'的优化应适应所研究的小鼠的遗传背景，并考虑到的可能性对伤害感受器和电路的不同的阵列的参与。
另一种阿片受体激动剂（芬太尼，瑞芬太尼）
虽然大多数临床使用的阿片类药物靶向的μ-阿片受体的激动剂，它们明显不同相对于在体外和体内的药理性质。例如，瑞芬太尼和芬太尼，与吗啡反差明显，表现为完全激动剂，促进μ-阿片受体39的内化。阿片类镇痛药如吗啡和芬太尼的半衰期为40小时的范围内，而瑞芬太尼具有超短半衰期数分钟41。在人类中，OIH最好的证据是从谁在手术过程中接受阿片类药物，包括短效肝炎患者ompounds如瑞芬太尼2,42。因此，芬太尼和瑞芬太尼可能是有价值的工具太来研究痛觉过敏和耐受小鼠的发展，在TIT和TPT范式。
感应OIH的替代模式（慢性与急性给药）
OIH被认为是在人类和动物模型作为阿片类施用的结果，无论是在非常低或非常高的剂量1,2。在这里，我们下面的慢性治疗的小鼠与中等剂量吗啡的报告OIH发展。有必要的治疗C57BL/6N小鼠的几天，以证明一个明确的和可重复的痛觉过敏状态图4每日吗啡注射，能充分替换植入吗啡颗粒：在他们搬迁，既热痛觉过敏和机械性异常疼痛已经已经报道在小鼠43。通过微渗透泵阿片类药物的输注是另一种可能性 44，在啮齿动物中，持久的痛觉过敏也可以实现使用一个协议模仿人类手术36,45,46使用这种μ-阿片受体激动剂的下列芬太尼急性给药。
该技术的局限性
动物种类和型号的疼痛
众多小鼠品系的比较研究提供了证据之后4天的吗啡治疗22伤害性反应对疼痛刺激17,31,47和OIH水平都有很大的差异。无论是相关的疼痛处理和调制在动物模型（小鼠和大鼠）机制相关的慢性疼痛患者仍是一个根本性的，打开的问题。因此，更应谨慎支付给动物数据的解释和他们的预测效度为16人。
在疼痛和镇痛的性别差异
ntent“>动物模型的疼痛大部分临床前研究已经对雄性啮齿动物16,25,48进行，尽管这样的选择偏差，新兴的观点是，考虑男性更好的反应，以鸦片止痛剂49,50，不易发生发展阿片诱发痛觉过敏51,52和更宽容吗啡镇痛53比女性（综述54），但是，对于伤害性镇痛药物疗效的性别差异并不在这种恢复'一个一刀切'的模式。事实上，大量数据，现在指示众多变量可能影响的性别差异，如阿片类药物的功效和选择性，伤害性测定法，遗传背景，年龄，性腺激素状况或社会互动48,54的大小和方向。在人类中，临床疼痛更普遍的妇女，但这个事实是否反映实际的性别差异仍然辩论48,55,56的问题。佛r例，五十临床试验的全球分析 显示性别之间的镇痛作用无显著差异，而荟萃分析对患者控制受试者进行指出，在女性57显著更大的阿片类药物的疗效，后者的观察，这明显与什么已经对比在啮齿类动物中发现，再次提出了关于原点这种分歧16,48,55,57几个问题。总之，在镇痛的性别差异确实存在，并值得进一步专注于底层机制和临床意义。关于伤害性测试
尾巴 撤退试验是一种脊髓反射，但它可能会受到棘上的影响58。 TIT是相对容易的对大鼠进行，但需要在小鼠更多的专业知识。一个潜在的困难是保持鼠标在一个正确的姿势不引起不必要的压力。提出的协议可以根据需要调整队列的大小。 16动物（8控制和处理8）很容易，只要自己的基础伤害性反应值的测量（先用TIT，然后TPT为全系列的小鼠）正在关注管理。监测镇痛时间课程要求所传递的时间间隔（这里30分钟）内建立一个精确的时间安排和动物，可测试的最大数目的评价（TIT第一，然后TPT）。动物的整个队列可能因此被分成子组，以允许实验者尊重动力学限制。
相对于现有的/替代方法的技术意义
OIH在大鼠与小鼠
鼠已被广泛用于研究阿片类药物镇痛，痛觉过敏和耐受性，急性或慢性阿片管理46,59-61。事实上，对于一些实际原因，它们可以被认为优于小鼠作为动物模型实验的疼痛16,61。然而，直到最近，转基因鼠的产生不是一个简单的过程。众多的转基因小鼠品系已经上市，我们的模型提供了研究的OIH和宽容的发展在小鼠众多的单个基因的贡献的机会。
TIT和TPT与其他伤害性测试
TIT是在甩尾试验中，最明显的区别是刺激的区域的变体。与辐射热相比，尾部成热水浸泡导致其温度迅速而均匀增加。相对于其他形式的热痛觉测试（热板或哈格里夫斯测试）中，TIT提供了这两个问题之间和内部公平地重复的结果。
TPT是一个非常受欢迎的机械痛觉26,27,35这可能涉及到的试验研究不同的痛觉纤维和分子传感器然后TIT 32。它提供了快速，可靠的测量59，不过，需要实验者和大型动物同伙一定的专业知识。作为替代，在本研究中，其它程序或装置使用的analgesimeter依靠应变仪确实存在（评论27）。 TPT是最适合用于研究机械性痛觉过敏，而的von Frey细丝，通常采取评价机械性异常性疼痛（评论27）。
掌握这一技术后，未来的应用或路线
我们在这里介绍的实验OIH /公差模型可以类似地适用于转基因小鼠，以评估各个基因的疼痛的调制作用。它还提供了一个模型系统来调查潜在的治疗药物的有效性，以缓解慢性疼痛。
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢JL博士。 Galzi（UMR7242法国国家科学研究中心;伊尔基希，法国）的支持。
这项工作是由国家科学研究中心，INSERM，大学德斯特拉斯堡，阿尔萨斯生物谷和由Conectus，法新社法国国家（ANR 08 EBIO 014.02）的资金支持行政法院区域阿尔萨斯（Pharmadol），城市社区斯特拉斯堡（Pharmadol） ICFRC（Pharmadol），OSEO（Pharmadol），向兴德企业经营者（Pharmadol）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30 g) |
| Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS no. 52-26-6 | Delivered with special authorization |
| Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene, sterile, volume: 1 ml |
| Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
| Mouse restrainer | Home-made | Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples | |
| Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
| Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
| Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
| STATview software | Free download, statistics |
References
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