Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdering af morfin-induceret hyperalgesi og Smertestillende Tolerance i mus ved hjælp af termiske og mekaniske Nociceptive Retningslinjer

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biotechnology and Cellular Signalling, UMR 7242 CNRS, Université de Strasbourg

Summary

Vi beskriver en protokol til at undersøge udviklingen af ​​opioid-induceret hyperalgesi og tolerance i mus. Baseret på måling af termiske og mekaniske nociceptive reaktioner naive og morfin-behandlede dyr, det gør det muligt at kvantificere den øgede smertefølsomhed (hyperalgesi) og falde i analgesi (tolerance) forbundet med kronisk opiat administration.

Abstract

Opioid-induceret hyperalgesi og tolerance alvorligt påvirke den kliniske effekt af opiater som smertestillende i dyr og mennesker. De molekylære mekanismer bag begge fænomener er ikke godt forstået, og deres udredning bør drage fordel af studiet af dyremodeller og fra design af egnede forsøgsprotokoller.

Vi beskriver her en metodisk tilgang til overtalelse, optagelse og kvantificere morfin-induceret hyperalgesi samt dokumenterer smertestillende tolerance, ved hjælp af hale-fordybelse og hale trykprøver i vild-type mus. Som vist i videoen, er protokollen opdelt i fem på hinanden følgende trin. Håndtering og habituation faser tillader en sikker bestemmelse af basal nociceptive respons af dyrene. Kronisk morfin administration inducerer signifikant hyperalgesi som vist med en stigning i både termisk og mekanisk følsomhed, mens sammenligningen af ​​analgesi time-kurser efter akut eller repeated morfin behandling viser tydeligt udviklingen af ​​tolerance manifesteret ved en nedgang i smertestillende responsamplituden. Denne protokol kan ligeledes tilpasses til genetisk modificerede mus for at evaluere rollen af ​​individuelle gener i modulering af nociception og morfin analgesi. Det giver også en model for at undersøge effektiviteten af ​​potentielle terapeutiske midler til forbedring af opiat smertestillende effekt.

Introduction

Opioid-induceret hyperalgesi (OIH) og smertestillende tolerance begrænse den kliniske effekt af opiater hos dyr og mennesker 1-3. Inddragelsen af pro-inflammatoriske 4,5 eller pro-nociceptive (anti-opioid) 6,7-systemer er i øjeblikket udforskes hypoteser. Belysning af de mekanismer, der ligger til grund OIH og tolerance nødvendiggør en kombination af in vivo og in vitro metoder, ved hjælp af passende dyremodeller, forsøgsprotokoller og molekylære værktøjer.

Behavioral farmakologi er det dominerende paradigme for at overvåge og kvantificere smertestillende og hyperalgesiske stater i forsøgsdyr (rotter, mus). Anvendelsen af ​​en skadelig stimulus (termisk, mekanisk eller kemisk) til en praktisk del legeme (bagpote, hale) af dyret fører til en nocifensive tilbagetrækning, der let kan scores.

Vi foreslår her en metodisk tilgang til overtalelse, optagelse og kvantificere OIH ogtolerance i vildtypemus ved hjælp af hale nedsænkning og hale trykprøvning. Proceduren giver mulighed for en let, følsom og reproducerbar bestemmelse af termiske og mekaniske nociceptive respons værdier i mus. Som vist i videoen protokollen, C57BL / 6 mus oplever betydelige hyperalgesi efter kronisk morfinindgivelse og opretholde denne i flere dage. Både termiske og mekaniske nociceptive værdier er væsentligt reduceret i forhold til baseline målinger på naive dyr. Desuden er vores eksperimentelle opstilling gør det muligt at overvåge, i tillæg til udviklingen af ​​OIH, tilbagegang i smertestillende respons på morfin (tolerance). Præsenteret data understøtter det synspunkt, at hyperalgesi og tolerance kan indebære fælles cellulære og molekylære mekanismer 8,9, selv om dette bestrides i litteraturen 1,10-12. Endelig kan denne protokol tilsvarende tilpasset til genetisk modificerede mus for at evaluere rollen af ​​individuelle gener i modulatortion af smerte. Det giver også en model system til at vurdere effektiviteten af ​​potentielle terapeutiske agenter til at forbedre opiat smertestillende effekter.

Protocol

Alle forsøg blev udført i nøje overensstemmelse med de europæiske retningslinjer for pasning af laboratoriedyr (Europæiske Fællesskaber Rådets direktiv 86/609/ECC) og de ​​etiske retningslinjer for undersøgelse af eksperimentel smerte i bevidste dyr 13. Mand C57BL6 / N Tac-mus (10 uger, 25-30 g) blev anbragt i en institutionel dyr facilitet med en pleje personale med ansvar for driften af ​​anlægget i overensstemmelse med miljøstandarder. Dyrene blev holdt i grupper (maks. fem mus per bur) under en 12 timer / 12 timers lys / mørke cyklus ved en konstant temperatur (21 ± 1 ° C) med fri adgang til mad og vand. Alle forsøg blev udført i samme periode af dagen (10:00 til 04:00) med en kohorte af 16 mus. Specifikke materialer og udstyr er angivet i Materials tabellen.

En fem-trins procedure for overvågning morfin induceret hyperalgesi og tolerance

Protokollen eropdelt i fem på hinanden følgende trin (AE) i løbet af en periode på 15 dage, fig. 1.

. 1 Mus håndtering (Trin A d-7 til d-5)

  1. Håndtag mus og vænne dem til frit træde ind i restrainer. Denne indledende trin reducerer stress - og dermed minimere enhver forveksling med stress-induceret analgesi - og gør det muligt for dyrene at være vant til investigator, håndtering og manipulation i musen restrainer. Hver mus forsigtigt behandlet i 5 minutter hver dag.

. 2 Basal Nociceptive Response (Trin B d-4 til d-1)

  1. Inddragelsesforanstaltning hale latenstider bruge Tail Immersion Test (TIT):
    1. Indstil termostaten til 48 ° C.
    2. Forsigtigt introducere musen i restrainer. Dyp fremspringende 2/3 slutningen af ​​sin hale i vandbadet og startes stopuret.
    3. Stopuret standses, så snart musen trækker sin hale fra det varme vand og registrere latenstiden (i sek.) I the mangel af nociceptive reaktion, er en 25 sek cut-off bruges til at forhindre vævsskader.
    4. Sæt musen i sit bur og teste den næste, indtil slutningen af ​​serien.
    5. Gentag nociceptive respons målinger to gange mere, måltagning fra dyrene i samme rækkefølge. Den nociceptive respons latenstid (sek) for hver mus bestemmes som middelværdien for tre på hinanden følgende bestemmelser.
  2. Måle mekaniske reaktioner ved hjælp af Tail trykprøvning (TPT)
    1. Forsigtigt introducere musen i restrainer og placere halen under den koniske spids analgesimeter.
    2. Tryk på mund-kontakten for at anvende ensartet stigende pres på den proksimale del af halen, indtil den første nociceptive reaktion (kæmper, pibende) forekommer. I øjeblikket dyret reagerer, optage det aktuelle kraft (i gram), der fremkalder den nociceptive respons. I mangel af nogen reaktion, er en 600 g cut-off-værdien bruges til at undgå tudstede skader.
    3. Gentag denne foranstaltning på median og distale dele af halen af ​​samme mus. Observeres Et interval på mindst 30 sek mellem foranstaltningerne på en given mus for at undgå tilpasning eller stress bias. Sæt musen i sit bur og teste den næste dyret indtil udgangen af serien (dvs. alle mus testes). Den nociceptive værdi (gram) for hver mus er taget som middelværdien for tre målinger (dvs. proksimale, median og distale dele af halen af hvert dyr).
  3. Gentag nociceptive test (alle de procedurer skitseret i trin 2) på efterfølgende dage, d-3 til d-1.

. 3. Måling af morfin analgesi (Trin C; d0)

  1. Definer den bedste kombination af dyr, der tillader valg af to grupper (n = 8 per gruppe) af mus med stabile og sammenlignelige gennemsnitlige nociceptive værdier, alt efter hvilken nociceptive modalitet (TIT eller TPT) betragtes. Denne værdi vil blive taget som den basalenociceptive respons reference for fremtidige 'Saline' og 'Morfin grupper.
  2. Måle kropsvægt for hvert dyr.
  3. Forbered en morfinopløsning (0,5 mg morfin pr ml) i sterilt fysiologisk saltvand (NaCl 0,9%) til subkutan administration (5 mg morfin pr kg af dyrets legemsvægt).
  4. Mål den nociceptive respons latency (taget som tiden punkt 0) for hver mus af både "Saline" og "Morfin" grupper i TIT (alle trinene under 2.1 ovenfor). Derefter måle nociception i TPT (alle trin under 2.2 ovenfor).
  5. Injicer subkutant morfin (typisk 0,25 ml af en 0,5 mg / ml morfin opløsning pr 25 g mus vægt) og saltopløsning (0,25 ml pr 25 g mus vægt) til 'morfin "og" saltvand grupper, hhv.
  6. Mål nociceptive værdier på TIT og TPT (alle procedurer er skitseret ovenfor under trin 2.1 og 2.2, henholdsvis) mere end en time-kursus (ved 30 min interval) at vurdere morfin (5 mg / kg)-induceret analgesi:
    1. Efter 30 minutter post-injektion, måle nociceptive respons (enkelt bestemmelse) for hver mus af "Saline" og "Morfin-grupper, ved hjælp af TIT derefter TPT.
    2. Derefter måle nociceptive respons værdier (TIT og TPT) i alle mus på tidspunkter (i hr): 1-1.5-2-2.5-3 og 3,5 efter injektion.

4. Kronisk Morfin Behandling - morfinfremkaldt hyperalgesi. (Trin D, D1 til d6)

  1. På dag: d1
    1. Mål nociceptive svarværdier på TIT og TPT som beskrevet ovenfor (trin 2.1 og 2.2). Anmærke forsigtigt tilbagetrækning ventetid og trykbærende grænser for hvert dyr.
    2. Forbered en frisk morfin løsning som beskrevet i trin 3.2.
    3. Injicer subkutant morfin (5 mg / kg legemsvægt) til hele "Morfin" gruppe og fysiologisk saltvand (0,25 ml pr 25 g mus vægt) til 'Saline' gruppe. Lad the dyr hvile, før den næste dag.
  2. På Dage: D2, D3, D4, D5 og d6 gentage operationerne beskrevet under afsnit 4.1

. 5. Bevis for Smertestillende Tolerance (Trin E; d7)

  1. Vurdere morfin-induceret analgesi efter den tid-retters paradigme allerede beskrevet i afsnit 3.

6.. Dataopsamling og statistiske analyser

  1. Vurdering af Basal Nociceptive svarværdier (Trin B)
    1. Beregn for hver dag (over d-4 til d-1 periode) middelværdien ± SEM værdier (n = 8) for basal nociceptive responser ydes fra TIT og TPT i »Saline" og "Morfin-grupper.
    2. Plot betyder basale nociceptive værdier som en funktion af tiden (dage) for begge grupper figur 2.
  2. Analyse af morfin analgesi Time-kursus på Dage d0 (trin C) og d7 (Trin E)
    1. Beregn, på hvert tidspunkt efter morfininjektion, middelværdien ± SEM værdier (n = 8) for nociceptive reaktioner som ydes fra TIT (i sek) og TPT (ig) i hver gruppe.
    2. Plot betyde nociceptive respons værdier som en funktion af tiden for den "Saline" og "Morfin" grupper på dag 0 Figur 3 og dag 7. Figur 5..
  3. Udvikling af morfin-induceret hyperalgesi (trin D)
    1. Beregn for hver dag (i behandlingsperioden d0-d7) middelværdien ± SEM værdier (n = 8) for basale nociceptive svarværdier som ydes fra TIT og TPT i »Saline-behandlede" og "Morfin-behandlede grupper.
    2. Plot betyder basale nociceptive respons som funktion af tiden (dage) til »Saline-behandlede" og "Morfin-behandlede grupper Figur 4..
  4. Beviser for Smertestillende Tolerance (trin C og E)
    1. Bestem fra morfin tidsforløbet eXperiment udføres på d0 Figur 3 tidsværdien (eller tidsinterval), der kræves for morfin til at fremkalde en maksimal smertestillende respons.
    2. Tag denne værdi (normalt 30 min) som reference tid til at estimere på d7 Figur 5 nociception baseline værdi (saltvand-behandlet gruppe) og den faktiske smertestillende respons (morfin-behandlet gruppe) til akut morfin.
    3. Nociceptive værdier, der på tidspunkt 30 min fra morfinbaserede tid-kursus eksperimenter udført på d0 og d7 for saltvandsbehandlede og morfin-behandlede grupper, præsenteres som histogrammer Figur 6..
    4. Statistik: Analyser af data ved hjælp af en-vejs gentagne målinger ANOVA. Faktorerne variation var behandlingen (mellem fag) og tid (indenfor emnet). For at kontrollere forskelle separat i hver gruppe, blev gentagne målinger ANOVA udført. Sammenligninger mellem to grupper blev udført ved anvendelse af uparret t-test eller parret t-test, når det er relevant.
  5. Signifikansniveau er sat til p <0,05. Alle statistiske analyser udføres ved hjælp af StatView softwaren.

Representative Results

Vurdering af Basal Nociceptive Værdier for Naïve Mus (Trin B)

TIT og TPT var sekventielt anvendes på hele kohorte af mus (n = 16), der giver middel nociceptive respons værdier. Bedste kombination af dyr tilladt en efterfølgende definition af to grupper (n = 8) af mus, kaldet Saline og morfin, som har tilsvarende og stabile basale nociceptive værdier Figur 2.. Ækvivalensen af begge grupper er gyldige uanset nociceptive test ( TIT: 2A, TPT: Figur 2B), der blev valgt.

Time-kursus for morfin analgesi på dag 0 (Trin C)

Morfin analgesi blev evalueret efter en enkelt injektion (sc) af morfin (5 mg / kg) i naive mus ved hjælp af både TIT 3A og TPT figur 3B. I begge tests, statistiske analyser med én måde gentagne målinger ANOVA reveal, at der er en signifikant interaktion mellem behandling og tid til TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) og TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT og TPT dataanalyser anvender gentagne målinger ANOVA viser, at der ikke er nogen virkning af saltvand injektion (F (7, 49) = 0,49, p> 0,05) og F (7, 49) = 1,85, p> 0,05 for henholdsvis TIT og TPT test), mens morfin injektion inducerer en kraftig analgesi hos mus (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) og F (7, 49) = 34,37, p <0,001 for henholdsvis TIT og TPT prøver). Den maksimale analgetiske virkning af morfin blev nået efter 30 min i TIT og efter 60 minutter i TPT sammenlignet med saltvands-injicerede kontroller (p <0,001, parret t-test).

Gentagne Morfin Administrations inducerer hyperalgesi i Mus (trin D)

Basal nociceptive blev målt hver dagfør saltvand eller morfin administration (se protokol). Som vist i figur 4, en gang dagligt morfin administrationer over en 6 dages behandling periode inducerede betydelig og gradvis sænkning af termisk (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, gentagne målinger ANOVA, figur 4A) og mekanisk (F ( 7,56) = 15,55, p <0,001, gentagne foranstaltninger ANOVA, figur 4B) basal nociceptive værdier. Hyperalgesi udviklede sig hurtigt, da det begyndte at være signifikant på dag 1 i TIT (p <0,01, uparret t-test, sammenlignet med saltvandsinjicerede kontroller) og på dag 2 i TPT (p <0,05, uparret t-test, sammenlignet med saltvand injicerede kontroller).

Time-kursus for morfin analgesi ved Dag 7, efter Kronisk Morfin Behandling (Trin E)

På dag 7 blev mus, der fik daglige morfin eller saltholdige injektioner over en 7-dages periode (d0 til d6) undersøgte i TIT Figur 5A og TPT figur 5B først for deres basale nociceptive værdier og derefter for deres analgetiske respons på akut morfin (5 mg / kg, sc.). I overensstemmelse med udviklingen af hyperalgesi vist i figur 4, den basale nociceptive værdi (tid 0) i mus, der var kronisk behandlet med morfin var signifikant lavere end saltvandsinjicerede kontrolmus (p <0,001, parret t-test). Efter akut morfin, nociceptive respons kronisk morfin-behandlede gruppe signifikant forøget, men kun lidt længere end den basale nociceptive værdi saltvandsinjicerede kontrolmus målt ved 30 min i TIT og TPT (p <0,01 og p <0,05, parret t test, henholdsvis) og 60 min i TIT (p <0,05, parret t-test). Fra 2 timer efter morfin behandling indtil slutningen af eksperimentet, nociceptive respons tilbage til lavere værdier end kontrol mus (p<0,001, parret t-test).

Sammenligning af maksimale analgetiske reaktioner Mus til morfin før (dag 0) og efter kronisk morfinbehandling (dag 7).

Nociceptive tærskelværdier vist i figur 6 er fra TIT (A) og TPT (B) udført 30 minutter efter saltvand eller morfininjektion som illustreret i figur 3 (dag 0) og 5 (dag 7). En stærk nedgang i morfin analgesi hos mus efter kronisk morfinbehandling 7 dage i sammenligning med deres oprindelige analgesi respons på dag 0 i begge nociceptive test (p <0,001 parret t-test). Disse data viser, at tolerance gjorde udvikle sig i smerte overfølsomme dyr.

Figur 1
Fig. 1. En fem-trins produre til overvågning morfin induceret hyperalgesi og tolerance. Protokollen er opdelt i fem på hinanden følgende trin (AE) over en samlet varighed på 15 dage.

Figur 2
. Figur 2. Definition af de basale nociceptive svarværdier (trin b, d-4 til d-1). Halen nedsænkning (TIT) (A) og hale tryk (TPT) (B) tests anvendes på hele serien af dyr med henblik på at evaluere deres basale nociceptive værdier. Derefter to grupper af mus (n = 8), benævnt »Saline 'og' Morfin 'grupper, er defineret således, at de udviser stabile og sammenlignelige gennemsnitlige nociceptive værdier, uanset den nociceptive modalitet, der betragtes.

Figur 3 Figur 3. Tidsforløbet for morfin analgesi på dag 0 (trin C) i TIT (A) og TPT (B). Det basale nociceptive respons værdi mus blev bestemt hver 30 min efter en enkelt morfin (5 mg / kg, sc. ) eller saltvandsinjektioner. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM, n = 8 mus pr gruppe. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, parret t-test i forhold til kontrolgruppen.

Figur 4
. Figur 4 Udvikling af hyperalgesi efter gentagen administration morfin (trin D, D1 til d6). Den basale nociceptive værdi af mus blev bestemt ved TIT (A) og TPT (B) en gang dagligt før morfin (5 mg / kg,fm.) eller saltvand administration. Data er udtrykt som middelværdier ± SEM, n = 8 mus pr gruppe. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ved uparret t-test sammenlignet med saltvandsbehandlede kontrolgruppe.

Figur 5
Figur 5. Tidsforløbet for morfin analgesi hos kronisk-morfin-behandlede mus på dag 7 (trin E) i TIT (A) og TPT (B). Mus, der var kronisk behandlet med morfin (sorte prikker) eller saltvand (hvide trekanter) fra dag 0 til dag 6, modtaget på dag 7 en enkelt injektion af morfin (5 mg / kg, sc.) eller saltvand, hhv. Nociceptiv reaktion mus blev bestemt hver 30 minutter efter morfin eller saltvand injektion. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM, n = 8 mus pr gruppe. * P <0,05, ** P & #60; 0,01 ved uparret t-test sammenlignet med saltvandsbehandlede kontrolgruppe. Fejllinjer der ikke overstiger symboler størrelse er skjult.

Figur 6
Fig. 6. Sammenligning af maksimale analgetiske reaktioner af mus morfin (5 mg / kg, sc.) Før (dag 0) og efter kronisk morfinbehandling (dag 7). Værdier rapporteret her er fra eksperimenter er vist i figur 3 og 5. nociceptive værdier blev målt under anvendelse TIT (A) og TPT (B) 30 minutter efter morfin eller saltvand injektion. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM, n = 8 mus pr gruppe. *** P <0,001 ved parret t-test.

Discussion

Kritiske trin

Valg af dyremodel for nociception målinger

Variation i nociceptive og smertestillende følsomhed blandt mus stammer er blevet undersøgt (anmeldelser 14-16) Anmeldelser ved hjælp af forskellige smerter modeller afviger i deres ætiologi (nociceptive, inflammatorisk, neuropatisk), modalitet (termisk, kemisk, mekanisk), varighed (akut, tonic, kronisk) og stedet for administration (kutan, subkutan, visceral). Når man sammenligner med andre stammer, C57BL/6J ("J" for Jackson Laboratory) mus blev en populær dyremodel for smerte studier, som de udviser en høj basal nociceptive følsomhed 17,18 og en moderat smertestillende respons på opiater 14,19. Efter kronisk morfin behandling, de også udvikle en betydelig smertestillende tolerance 20,21, hyperalgesi 21,22 og afhængighed 20,23.

nt "> Her blev eksperimenter udført på C57BL/6N Tac mus (" N "for National Institute of Health og" Tac "for Taconics gård), som hører til en separat gren af ​​B6 afstamning. Selvom C57BL / 6 mus har været lang betragtes som udskiftelige, seneste undersøgelser pegede på væsentlige adfærdsmæssige forskelle blandt C57BL/6J og C57BL/6N stammerne 24. Især lavere følsomhed af de tre C57BL/6N understammerne (herunder Tac en) akut smerte ved varmepåvirkning kan betragtes som en fordel til afprøvning af denne fænotype.

Hanmus blev valgt som størstedelen af smerte gennem anvendelse af mus som dyremodellen udføres på unge mænd 25. I vores hænder, de forudsat robust og reproducerbar data, når de undersøges fra analgesi eller hyperalgesi synspunkt. Indimellem har vi bemærket en tendens til C57BL/6N kvinder til at give flere variable reaktioner, både i TIT og TPT tests. Skønt denne observation kanafspejle naturlige variationer knyttet til hormonelle status hunner overordnede mekanismer bag kønsforskelle i smerte og analgesi stadig en omdiskuteret. Nogle aspekter af denne varme debat vil kort blive præsenteret i den næste 'Begrænsninger af teknikken' sektionen.

Animal tilvænning

Musene blev først lov til at vænne sig til dyret facilitet i løbet af en uge. Svarende til en anden adfærdsundersøgelser, testning blev udført efter en 3 dages-akklimatiseringsperiode (figur 1, trin A). Som nociceptive test er følsomme over for stress, kan første foranstaltninger giver længere ventetid end efterfølgende dem, især i ikke-habituated mus 26,27. Den tilvænning trin giver også mulighed for opnåelse af mere stabile nociceptive respons værdier inden for samme dag og mellem dage figur 2 og 4.. For at reducere døgnrytmen virkninger på nociceptiv og analgetiskfølsomhed 28,29 blev alle tests udført fra 10:00 til 16:00.

Udvælgelse af nociceptive tests

Nociceptive tests bruge enten termisk, mekaniske, kemiske eller elektriske stimuli (gennemgang 26,27,30. Deres valg er kritisk, da forskellige nociceptive modaliteter kan behandles gennem forskellige nociceptorer og fibre 18,31,32.

Vi valgte halen nedsænkning test (TIT) 33, en modificeret version af den klassiske tail flick testen udviklet af D'Amour og Smith 34, og halen trykprøvning (TPT), tilpasset fra Randall og Selitto 35, som eksempler på termisk og mekaniske metoder til at studere morfin-induceret analgesi, hyperalgesi og tolerance i mus. Begge test er ofte blevet brugt i rotter. En afskåret tid systematisk defineret for at undgå eller begrænse risikoen for vævsskader.

Morfin-induced analgesi, hyperalgesi og tolerance

Morfin, den prototypiske mu-opiat-agonist, blev valgt her, da det er en potent smertestillende og OIH-inducer, både hos mennesker og mus 1,2,36. Morfin analgetiske virkning er kendt for at variere med mus stammer, administrationsveje og nociceptive modaliteter. I C57BL / 6 mus, er pålidelig analgesi normalt opnået efter subkutane injektioner af morfin i 1-20 mg / kg dosisinterval 14,21. Derfor valgte vi at studere akut analgesi efter en enkelt administration (sc) af morfin ved 5 mg / kg, tæt på sin ED 50-værdi (7-20 mg / kg) vurderes ud fra termisk nociception 19,21.

Gentagen morfinindgivelse er ofte ledsaget med analgetisk tolerance (hvad enten fra en højredrejning af dosis-respons-kurve eller et fald i smertestillende respons amplitude eller varighed) og hyperalgesi (en forværret følsomhed til smertefulde stimulJeg fremgår af et fald i basal nociceptive værdi). Begge negative fænomener afhænger gnaverrace om arten af opiat-forbindelse, der er valgt, og doseringen på behandlingsvarighed og nociceptive modaliteter 21. For eksempel eksperimentelle paradigmer for at studere tolerance og hyperalgesi består i daglig administration af høj og konstant (20 til 40 mg / kg per dag) 22 eller eskalerende (op til 50 eller endog 200 mg / kg) 20,21 morfin doser. Følgelig vi fremmet udviklingen af ​​hyperalgesi og tolerance i C57BL / 6 mus ved daglig morfinindgivelse (5 mg / kg sc) over en 8 dages periode. Denne moderate morfin dosis blev foretrukket frem højere dem til bedre efterligner klinik brug.

Opsætning af TIT operationelle vindue

En mulig faldgrube i TIT kan være relateret til den rolle, halen i termoregulering gnavere 26,37. Da den omgivende temperatur er en nøglefaktor i nociceptive respons variationer, bør det holdes konstant (her ved 21 ° C) i hele eksperimenter 38. Heat intensitet er normalt sat op til at opdage en nociceptive reaktion inden for 5 til 10 sek 27. Faktisk kan større ventetid øge risikoen for overvågning af flytninger af dyr ikke er relateret til den nociceptive stimulus, hvorimod kortere dem kan reducere forskellen styrken af ​​testen. Vi udførte TIT målinger ved en fast temperatur på 48 ° C. Tilbagetrækning hale latenstider var tæt på 9 sek (basal nociceptive værdi) og varierede fra 4 sek (hyperalgesi) til 25 sek (maksimal analgesi, afskåret). Ud over praktiske årsager kan målinger af nociceptive respons værdier ved en fast temperatur a priori indebærer samme repertoire af nociceptorer og kredsløb og dermed lette fortolkningen af ​​data.

Eventuelle ændringer

Optimering af TIT operationelle vindue til analgesi og OIH overvåNTS

Når der fokuseres på en smertestillende respons, kan lave baseline værdier (højere varme intensitet) fremme påvisningen af ​​en forsinkelse i svaret. Til gengæld for at tage fat på konsekvensen af en smertefuld stimulus eller udvikling af OIH, højere baseline værdier (lavere varme intensitet her 48 ° C), kan det lettere at afsløre hurtigere svar Figur 4..

Selvom vi fandt morfin på 5 mg / kg en bekvem dosis at fremkalde en robust smertestillende respons Figur 3 og fremme (ved gentagen administration) signifikant hyperalgesi figur 4, kan doseringen tilpasses som nævnt før (Kritisk skridt: morfininduceret analgesi, hyperalgesi og tolerance). For eksempel kan lavere doser anvendes til at reducere analgesi amplitude (og dermed undgå cut-off begrænsninger), mens kan vælges højere doser for at fremskynde hyperalgesi debut og øge dens amplitude.

OveRall, optimering af "nociceptive vinduet 'bør tilpasses den genetiske baggrund af mus under undersøgelse og tage hensyn til muligheden for inddragelse af forskellige arrays af nociceptorer og kredsløb.

Alternative opiatagonister (fentanyl, remifentanyl)

Selv om de fleste klinisk anvendte opiater målrette mu-opioid-receptoren som agonister, de afviger betydeligt med hensyn til deres farmakologiske egenskaber, både in vitro og in vivo. For eksempel remifentanyl og fentanyl, i skærende kontrast med morfin, opfører sig som fulde agonister og fremme internalisering af mu-opioidreceptorer 39. Opiater, såsom morfin og fentanyl har halveringstider i størrelsesordenen timer og 40, mens remifentanyl har en ultra-korte halveringstid på flere minutter 41. Hos mennesker, bedste bevis for OIH er fra patienter, der modtog opiater under operationen, herunder korttidsvirkende compounds såsom remifentanyl 2,42. Således kan fentanyl og remifentanyl være værdifulde redskaber for at studere udviklingen af ​​hyperalgesi og tolerance i mus under TIT og TPT paradigmer.

Alternative former for induktion af OIH (kronisk vs akut administration)

OIH ses hos mennesker og dyremodeller som følge af opiat administration, også ved meget lave eller meget høje doser 1,2. Vi rapporterer her om OIH udvikling efter kronisk behandling af mus med moderate doser af morfin. Flere dage til behandling af C57BL/6N mus var nødvendigt klart indebære en og reproducerbar hyperalgesiske tilstand Figur 4 Daglige Morfinindsprøjtninger kunne være tilstrækkeligt erstattet med implanterede morfin piller:. Ved deres fjernelse, har både termisk hyperalgesi og mekanisk allodyni allerede blevet rapporteret i mus 43.. Infusion af opiater gennem en mikro-osmotisk pumpe er en anden mulighed 44.. Hos gnavere langvarig hyperalgesi også opnåelige efter akut administration af fentanyl ved hjælp af en protokol, der efterligner brugen af denne mu-opioid agonist i human kirurgi 36,45,46.

Begrænsninger af Teknik

Dyrearter og modeller for smerte

Komparative studier af talrige musestammer fremlagt beviser for store variationer i nociceptive reaktioner på smertefulde stimuli 17,31,47 og i OIH niveauer efter 4-dages morfin behandling 22.. Uanset om mekanismerne bag smerte behandling og graduering i dyremodeller (mus og rotter), er relevante for kroniske smertepatienter stadig et grundlæggende og åbnede spørgsmål. Således bør megen forsigtighed skal betales til fortolkningen af data fra dyreforsøg og deres forudsigende gyldighed for mennesker 16.

Kønsforskelle i smerte og analgesi

ntent "> De fleste prækliniske studier i dyremodeller for smerte er blevet gennemført på hangnavere 16,25,48. Trods denne selektionsbias, det spirende visningen var at betragte mænd som bedre respons på opiater 49,50, mindre tilbøjelige til at udvikle opioid -induceret hyperalgesi 51,52 og mere tolerante over for morfin analgesi 53 end deres kvindelige modstykker (anmeldelse 54). Men kønsforskelle med hensyn til nociception og smertestillende medicin effekt ikke genoptaget i sådanne "en one size fits all" paradigme. Faktisk et væld af data viser nu, at mange variabler kan påvirke størrelsen og retningen af kønsforskelle såsom opioid effekt og selektivitet, nociceptive assay, genetisk baggrund, alder, gonado-hormonel status eller social interaktion 48,54. Hos mennesker klinisk smerte er mere udbredt hos kvinder, men om denne kendsgerning afspejler faktiske kønsforskelle er stadig et spørgsmål om forhandling 48,55,56. For eksempel, global analyse af halvtreds kliniske studier tyder ingen signifikante forskelle i analgetiske egenskaber mellem kønnene mens meta-analyser udført på patienter-kontrollerede personer pegede på en signifikant større opioid effekt hos kvinder 57. Sidstnævnte observation, som markant kontrast til hvad der har været findes i gnavere, igen rejser flere spørgsmål om oprindelse for sådanne forskelle 16,48,55,57. Sammenlagt findes kønsforskelle i analgesi og fortjener yderligere fokus på de underliggende mekanismer og kliniske implikationer.

Om nociceptive tests

Test Tilbagetrækningen hale er en spinal refleks, men det kan være genstand for supraspinale påvirkninger 58. TIT er relativt let at udføre på rotter, men kræver mere ekspertise i mus. En potentiel vanskelighed er at fastholde musen i en korrekt stilling uden at fremkalde uønskede stress. Den foreslåede protokol kan tilpasses efterkohorte størrelse. 16 dyr (8 kontrol og 8 behandlet) er let styres så vidt måling af deres basale nociceptive svarværdier (ved hjælp af TIT først, derefter TPT for hele serien af ​​mus) er under bekymring. Overvågning analgesi tidsforløb kræver etablering af en præcis tidsplan og evaluering af det maksimale antal dyr, der kan testes (TIT først, derefter TPT) inden for bibringes tidsinterval (her 30 min). Hele kohorte af dyr kan således inddeles i undergrupper for at tillade forsøgslederen at respektere kinetiske begrænsninger.

Betydningen af den teknik med hensyn til eksisterende / Alternative Metoder

OIH rotter versus mus

Rotter er blevet flittigt brugt til at studere opioid analgesi, hyperalgesi og tolerance, efter akut eller kronisk opiat administration 46,59-61. Ja, for flere praktiske grunde, at de kan betragtes som overlegen i forhold tilmus som en dyremodel for smerte eksperimenter 16,61. Men indtil for nylig, den generation af genetisk modificerede rotter var ikke en enkel procedure. Som adskillige genmodificerede musestammer er allerede tilgængelige, tilbyder vores model mulighed for at studere bidrag talrige individuelle gener i OIH og tolerance udvikling i mus.

TIT og TPT versus andre nociceptive test

TIT er en variant af halen flick testen, den mest iøjnefaldende forskel er området for stimulation. I modsætning til strålevarme, neddypning af halen i varmt vand fører til en hurtig og ensartet stigning i temperatur. Sammenlignet med andre former for termisk nociception test (hot-plade eller Hargreaves tests), TIT giver nogenlunde reproducerbare resultater både på tværs af og inden for emner.

TPT er en meget populær test for studiet af mekaniske nociception 26,27,35 som sandsynligvis indebærersærskilte nociceptive fibre og molekylære transducere derefter TIT 32. Det giver hurtige og pålidelige målinger 59, men kræver en vis ekspertise fra forsøgslederen og store dyr årgange. Som et alternativ til analgesimeter anvendes i den foreliggende undersøgelse, andre procedurer eller apparat bygger på strain gauges eksisterer (anmeldelse 27). TPT er bedst egnet til at studere mekanisk hyperalgesi henviser von Frey-filamenter normalt træffes for at evaluere mekanisk allodyni (anmeldelse 27).

Fremtidige Programmer eller instruktioner efter Mastering denne teknik

Den eksperimentelle OIH / tolerance model, som vi her præsenterer, kan være tilsvarende indrettet til genetisk modificerede mus for at evaluere rollen af ​​individuelle gener i modulering af smerte. Det giver også et modelsystem til at undersøge effektiviteten af ​​potentielle terapeutiske midler til at lindre kroniske smerter.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankrig) for hans støtte.

Dette arbejde blev støttet af CNRS, INSERM, Université de Strasbourg BioValley og af tilskud fra Conectus, Agence Nationale de la Recherche (ANR 08 Ebio 014.02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol) Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol) ICFRC (Pharmadol) OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6N Tac mice Taconic, Ry, Denmark C57BL/6N Tac B6-M Male mice (25-30 g)
Morphine hydrochloride Francopia, Paris, France CAS no. 52-26-6 Delivered with special authorization
Syringes (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050000 Polypropylene, sterile, volume: 1 ml
Needles (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050101 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1)
Mouse restrainer Home-made Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples
Thermostated water bath GR150 Grant Instruments, Cambridge, UK GP 0540003
Analgesimeter Panlab, Barcelona, Spain LE 7306
Kaleidagraph software Synergy software, Reading, PA, USA Kaleidagraph 4.03  Scientific graphing
STATview software Free download, statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angst, M. S., Clark, J. D. Opioid-induced hyperalgesia. A qualitative systematic review. Anesthesiology. 104, 570-587 (2006).
  2. Chu, L. F., Angst, M. S., Clark, D. Opioid-induced hyperalgesia in humans. Molecular mechanisms and clinical considerations. Clin. J. Pain. 24, 479-496 (2008).
  3. Lee, M., Silverman, S., Hansen, H., Patel, V., Manchikanti, L. A comprehensive review of opioid-induced hyperalgesia. Pain Physician. 14, 145-161 (2011).
  4. Hutchinson, M. R., Shavit, Y., Grace, P. M., Rice, K. C., Maier, S. F., Watkins, L. R. Exploring the neuroimmunopharmacology of opioids: An integrative review of mechanisms of central immune signaling and their implications for opioid analgesia. Pharmacol. Rev. 63, 772-810 (2011).
  5. Wang, X., et al. Morphine activates neuroinflammation in a manner parallel to endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 6325-6330 (2012).
  6. Colpaert, F. C. System theory of pain and of opiate analgesia: No tolerance to opiates. Pharmacol. Rev. 48, 355-402 (1996).
  7. Simonnet, G., Rivat, C. Opioid-induced hyperalgesia: abnormal or normal pain. NeuroReport. 14, 1-7 (2003).
  8. Mao, J., Sung, B., Ji, R. R., Lim, G. Chronic morphine induces downregulation of spinal glutamate transporters: implications in morphine tolerance and abnormal pain sensitivity. J. Neurosci. 22, 8312-8323 (2002).
  9. King, T., Ossipov, M. H., Vanderah, T. W., Porreca, F., Lai, J. Is paradoxical pain induced by sustained opioid exposure an underlying mechanism of opioid antinociceptive tolerance. Neurosignals. 14, 194-205 (2005).
  10. DuPen, A., Shen, D., Ersek, M. Mechanisms of opioid-induced tolerance and hyperalgesia. Pain Management Nursing. 8, 113-121 (2007).
  11. Chu, L. F., et al. Analgesic tolerance without demonstrable opioid-induced hyperalgesia : A double-blinded, randomized, placebo-controlled trial of sustained-release morphine for treatment of chronic nonradicular low-back. 153, 1583-1592 (2012).
  12. Ferrini, F., et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl- homeostasis. Nature Neurosci. 16, 183-192 (2013).
  13. Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigation of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
  14. Mogil, J. S. The genetic mediation of individual differences in sensitivity to pain and its inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 7744-7751 (1999).
  15. Mogil, J. S., et al. Screening for pain phenotypes : Analysis of three congenic mouse strains on a battery of nine nociceptive tests. Pain. 126, 24-34 (2006).
  16. Mogil, J. S. Animal models of pain : progress and challenges. Nature Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
  17. Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception I : Responses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception. Pain. 80, 67-82 (1999).
  18. Larivière, W. R., et al. Heritability of nociception. III. Genetic relationships among commonly used assays of nociception and hypersensitivity. Pain. 97, 75-86 (2002).
  19. Elmer, G. I., Pieper, J. O., Negus, S. S., Woods, J. H. Genetic variance in nociception and its relationship to the potency of morphine-induced analgesia in thermal and chemical tests. Pain. 75, 129-140 (1998).
  20. Eidelberg, E., Erspamer, R., Kreinick, C. J., Harris, J. Genetically determined differences in the effects of morphine on mice. Eur. J. Pharmacol. 32, 329-336 (1975).
  21. Kest, B., Hopkins, E., Palmese, C. A., Adler, M., Mogil, J. S. Genetic variation in morphine analgesic tolerance: A survey of 11 inbred mouse strains. Pharmacol. Biochem. Behav. 73, 821-828 (2002).
  22. Liang, D. -Y., Liao, G., Wang, J., Usuka, J., Guo, Y., Peltz, G., Clark, J. D. A genetic analysis of opioid-induced hyperalgesia in mice. Anesthesiology. 104, 1054-1062 (2006).
  23. Kest, B., Palmese, C. A., Hopkins, E., Adler, M., Juni, A., Mogil, J. S. Naloxone-precipitated withdrawal jumping in 11 inbred mouse strains : Evidence for common genetic mechanisms in acute and chronic morphine physical dependence. Neurosci. 115, 463-469 (2002).
  24. Bryant, C. D., et al. Behavioral differences among C57BL/6 substrains: Implications for transgenic and knockout studies. J. Neurogenet. 22, 315-331 (2008).
  25. Mogil, J. S., Chanda, M. L. The case for the inclusion of female subjects in basic science studies of pain. Pain. 117, 1-5 (2005).
  26. Le Bars, D., Gozariu, M., Cadden, S. W. Animal models of nociception. Pharm. Rev. 53, 597-652 (2001).
  27. Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neurosci. 211, 39-50 (2012).
  28. Kavaliers, M., Hirst, M. Daily rythms of analgesia in mice: effects of age and photoperiod. Brain Res. 279, 387-393 (1983).
  29. Castellano, C., Puglisi-Allegra, S., Renzi, P., Oliverio, A. Genetic differences in daily rhythms of pain sensivity in mice. Pharmacol. Biochem., and Behavior. 23, 91-92 (1985).
  30. Sandkühler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol. Rev. 89, 707-758 (2009).
  31. Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception II. ‘Types’ of nociception revealed by genetic correlation analysis. Pain. 80, 83-93 (1999).
  32. Scherrer, G., et al. Dissociation of the opioid receptor mechanisms that control mechanical and heat. 137, 1148-1159 (2009).
  33. Janssen, P. A. J., Niemegeers, C. J. E., Dony, J. G. H. The inhibitory effect of fentanyl and other morphine-like analgesics on the warm water induced tail withdrawal reflex. Arzneimittelforsch. 13, 502-507 (1963).
  34. Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 72, 74-79 (1941).
  35. Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 111, 409-419 (1957).
  36. Elhabazi, K., et al. Involvement of neuropeptides FF receptors in neuroadaptative responses to acute and chronic opiate treatments. Br. J. Pharmacol. 165, 424-435 (2012).
  37. Berge, O. -G., Garcia-Cabrera, I., Hole, K. Response latencies in the tail-flick test depend on tail skin temperature. Neurosci. Lett. 86, 284-288 (1988).
  38. Benoist, J. -M., Pincedé, I., Ballantyne, K., Plaghi, L., Le Bars, D. Peripheral and central determinants of a nociceptive reaction: An approach to psychophysics in the rat. PLoS ONE. 3, e3125 (2008).
  39. Morgan, M. M., Christie, M. J. Analysis of opioid efficacy, tolerance, addiction and dependence from cell culture to human. Br. J. Pharmacol. 164, 1322-1334 (2011).
  40. Trescot, A. M., Datta, S., Lee, M., Hansen, H. Opioid pharmacology. Pain Physician. 11, S133-S153 (2008).
  41. Egan, T. D., et al. The pharmacokinetics of the new short-acting opioid remifentanil (GI87084B) in healthy adult male volunteers. Anesthesiology. 79, 881-892 (1993).
  42. Hansen, E. G., Duedahl, T. H., Rømsing, J., Hilsted, K. L., Dahl, J. B. Intra-operative remifentanil might influence pain levels in the immediate post-operative period after major abdominal surgery. Acta Anaesthesiol Scand. 49, 1464-1470 (2005).
  43. Li, X., Angst, M. S., Clark, J. D. A murine model of opioid-induced hyperalgesia. Mol. Brain Res. 86, 56-62 (2001).
  44. Varnado-Rhodes, Y., Gunther, J., Terman, G. W., Chavkin, C. Mu opioid analgesia and analgesic tolerance in two mouse strains. C57BL/6 and 129/SvJ. Proc. West Pharmacol. Soc. 43, 15-17 (2000).
  45. Celerier, E., et al. Long-lasting hyperalgesia induced by fentanyl in rats: preventive effect of ketamine. Anesthesiology. 92, 465-472 (2000).
  46. Celerier, E., Simonnet, G., Maldonado, R. Prevention of fentanyl-induced delayed pronociceptive effects in mice lacking the protein kinase C gamma gene. Neuropharmacol. 46, 264-272 (2004).
  47. Larivière, W. R., Chesler, E. J., Mogil, J. S. Transgenic studies of pain and analgesia: Mutation or background phenotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 467-473 (2001).
  48. Mogil, J. S. Sex differences in pain and pain inhibition: multiple explanations of a controversial phenomenon. Nature Rev. Neurosci. 13, 859-866 (2012).
  49. Kest, B., Wilson, S. G., Mogil, J. S. Sex differences in supraspinal morphine analgesia are dependent on genotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1370-1375 (1999).
  50. Kest, B., Sarton, E., Dahan, A. Gender differences in opioid-mediated analgesia. Anesthesiology. 93, 539-547 (2000).
  51. Holtman, J. R., Wala, E. P. Characterization of morphine-induced hyperalgesia in male and female rats. Pain. 114, 62-70 (2005).
  52. Juni, A., et al. Sex differences in hyperalgesia during morphine infusion: effect of gonadectomy and estrogen treatment. Neuropharmacol. 54, 1264-1270 (2008).
  53. Craft, R. M., et al. Sex differences in development of morphine tolerance and dependence in the rat. Psychopharmacol. 143, 1-7 (1999).
  54. Bodnar, R. J., Kest, B. Sex differences in opioid analgesia, hyperalgesia, tolerance and withdrawal: central mechanisms of action and roles of gonadal hormones. Hormones Behav. 58, 72-81 (2010).
  55. Greenspan, J. D., et al. Studying sex and gender differences in pain and analgesia: A consensus report. Pain. 132, S26-S45 (2007).
  56. Fillingim, R. B., Ness, T. J. Sex-related hormonal influences on pain and analgesic responses. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 485-501 (2000).
  57. Niesters, M., et al. Do sex differences exist in opioid analgesia? A systematic review and meta-analysis of human experimental and clinical studies. Pain. 151, 61-68 (2010).
  58. Millan, M. J. Descending control of pain. Prog. Neurobiol. 66, 355-474 (2002).
  59. Celerier, E., Laulin, J. -P., Corcuff, J. -B., Le Moal, M., Simonnet, G. Progressive enhancement of delayed hyperalgesia induced by repeated heroin administration : A sensitization process. J. Neurosci. 21, 4074-4080 (2001).
  60. Simonin, F., et al. RF9, a potent and selective neuropeptide FF receptor antagonist, prevents opioid-induced tolerance associated with hyperalgesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 466-471 (2006).
  61. Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav. Brain Res. 125, 65-73 (2001).

Tags

Neuroscience mus nociception hale nedsænkning test hale trykprøvning morfin analgesi opioid-induceret hyperalgesi tolerance
Vurdering af morfin-induceret hyperalgesi og Smertestillende Tolerance i mus ved hjælp af termiske og mekaniske Nociceptive Retningslinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., … More

Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., Simonin, F. Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities. J. Vis. Exp. (89), e51264, doi:10.3791/51264 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter