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Neuroscience

Bewertung von Morphin-induzierte Hyperalgesie und Schmerztoleranz in Mäuse mit Thermal-und Maschinen Nozizeptive Modalitäten

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biotechnology and Cellular Signalling, UMR 7242 CNRS, Université de Strasbourg

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll, um die Entwicklung von Opioid-induzierte Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen zu untersuchen. Basierend auf der Messung der thermischen und mechanischen nozizeptiven Reaktionen von naiven und Morphin-behandelten Tieren, erlaubt es, die Steigerung der Schmerzempfindlichkeit (Hyperalgesie) zu quantifizieren und Abnahme der Analgesie (Toleranz) mit chronischer Opiat-Verwaltung verbunden.

Abstract

Opioid-induzierte Hyperalgesie und Toleranz wesentlich beeinflussen, die klinische Wirksamkeit von Opiaten, wie Schmerzmittel bei Tieren und Menschen. Die molekularen Mechanismen, die beide Phänomene sind nicht gut verstanden und ihre Erläuterung soll aus der Studie von Tiermodellen und von der Gestaltung der entsprechenden experimentellen Protokolle nutzen.

Wir beschreiben hier einen methodischen Ansatz zur Induktion, Erfassung und Quantifizierung von Morphin-induzierte Hyperalgesie sowie Nachweis analgetische Toleranz, mit den Schwanz-Immersions-und Heckdrucktests in Wildtyp-Mäusen. Wie im Video gezeigt wird, wird das Protokoll in fünf aufeinanderfolgenden Stufen unterteilt. Handhabung und Gewöhnungsphasen ermöglichen eine sichere Bestimmung der basalen nozizeptiven Reaktion der Tiere. Chronische Morphinverabreichung induziert signifikante Hyperalgesie, wie durch einen Anstieg sowohl thermische und mechanische Empfindlichkeit dargestellt, während der Vergleich der Analgesie Zeit-Kurse nach akuter oder repeated Morphinbehandlung zeigt deutlich die Toleranzentwicklung durch einen Rückgang der analgetische Reaktion Amplitude manifestiert. Dieses Protokoll kann in ähnlicher Weise genetisch veränderte Mäuse, um die Rolle einzelner Gene in der Modulation der Nozizeption und Morphinanalgesie bewerten angepasst werden. Es bietet auch eine Modellsystem, um die Wirksamkeit von potentiellen therapeutischen Mitteln untersuchen Opiat analgetische Wirksamkeit zu verbessern.

Introduction

Opioid-induzierte Hyperalgesie (OIH) und analgetische Toleranz begrenzen die klinische Wirksamkeit von Opiaten bei Tieren und Menschen 3.1. Die Beteiligung von pro-inflammatorischen 4,5 oder von pro-nozizeptiven (Anti-Opioid) 6,7 Systeme werden derzeit erforscht Hypothesen. Die Aufklärung der Mechanismen OIH und Toleranz zugrundeliegenden erfordert eine Kombination von in-vivo-und in vitro-Methoden unter Verwendung geeigneter Tiermodelle, Versuchsprotokolle und molekularen Werkzeugen.

Verhaltenspharmakologie ist der dominierende Paradigma zu überwachen und zu quantifizieren, analgetische und Hyperalgesie-Staaten bei Labortieren (Ratten, Mäuse). Die Anwendung einer schädlichen Reiz (thermische, mechanische oder chemische) zu einem bequemen Körperteil (Hinterpfote, Schwanz) des Tieres führt zu einem Rückzug nozifensiven, die leicht erzielt werden kann.

Wir schlagen hier einen methodischen Ansatz zur Induktion, Aufnahme und Quantifizierung OIH undToleranz in Wildtyp-Mäusen, mit den Schwanz-Immersions-und Heckdruckprüfungen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache, empfindliche und reproduzierbare Bestimmung der thermischen und mechanischen nozizeptiven Reaktionswerte bei Mäusen. Wie im Video gezeigt, Protokoll, C57BL / 6 Mäuse erleben signifikante Hyperalgesie nach chronischer Morphin Verwaltung und Aufrechterhaltung dieser für mehrere Tage. Beide thermischen und mechanischen nozizeptiven Werte werden deutlich reduziert, im Vergleich zur Baseline-Messungen auf naive Tiere. Darüber hinaus ermöglicht unsere Versuchsaufbau zu überwachen, die neben der Entwicklung von OIH, dem Niedergang der analgetische Reaktion auf Morphin (Toleranz). Präsentiert Daten unterstützen die Ansicht, dass Hyperalgesie und Toleranz kann es sich um gemeinsame zelluläre und molekulare Mechanismen 8,9, obwohl dies in der Literatur 1,10-12 umstritten. Schließlich kann dieses Protokoll ähnlich wie bei gentechnisch veränderten Mäusen, um die Rolle einzelner Gene in der Modulation angepasst werden bewertention von Schmerzen. Es bietet auch eine Modellsystem, um die Wirksamkeit von potentiellen therapeutischen Mitteln auszuwerten Opiat analgetische Wirkung zu verbessern.

Protocol

Alle Versuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinien für die Pflege von Labortieren (Richtlinie 86/609/ECC Europäischen Gemeinschaften Rates) und die ethischen Richtlinien für die Untersuchung von experimentellen Schmerz in 13 wachen Tieren durchgeführt. Männlich C57BL6 / N-Tac-Mäusen (10 Wochen, 25 bis 30 g) wurden in einem institutionellen Tieranlage mit einer Pflegepersonal zuständig für den Betrieb der Anlage in der Einhaltung von Umweltstandards untergebracht. Die Tiere wurden in Gruppen gehalten werden (maximal fünf Mäusen pro Käfig) unter einer 12 h / 12 h Licht / Dunkel-Zyklus bei einer konstanten Temperatur (21 ± 1 ° C) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle Versuche wurden in der gleichen Zeit des Tages (10.00 Uhr bis 04.00 Uhr) mit einem Kollektiv von 16 Mäusen durchgeführt. Spezielle Materialien und Geräte sind in der Tabelle angegebenen Materialien.

Ein Fünf-Schritt-Verfahren zu Morphin-induzierte Hyperalgesie und Toleranz zu überwachen

Das Protokoll istüber einen Zeitraum von 15 Tagen 1 in fünf aufeinanderfolgenden Schritten (AE) unterteilt.

. 1 Mäuse Behandlung (Stufe A, D-7 bis D-5)

  1. Griff Mäusen und gewöhnen sie sich frei in den Restrainer eingeben. Diese Vorstufe reduziert Stress - und damit jede Verwechslung mit Stress-induzierte Analgesie zu minimieren - und lässt die Tiere, um die Ermittler gewöhnt werden, Handhabung und Manipulation in die Maus Rainer. Jede Maus wird sanft für 5 min jeden Tag behandelt.

. 2 Basal nozizeptive Reaktion (Schritt B, D-4 bis D-1)

  1. Messen Schwanzrückzugslatenzen mit dem Schwanz Tauchtest (TIT):
    1. Stellen Sie den Thermostat auf 48 ° C
    2. Die Maus vorsichtig einführen in die Restrainer. Tauchen Sie den hervorstehenden 03.02 Ende seines Schwanzes in das Wasserbad und starten Sie die Chronometer.
    3. Den Zeitmesser stoppen, sobald die Maus zieht seinen Schwanz aus dem heißen Wasser und notieren Sie die Latenzzeit (in Sekunden). In thE Fehlen einer nozizeptiven Reaktion wird ein 25 Sekunden cut-off verwendet, um Gewebeschäden zu verhindern.
    4. Ersetzen Sie die Maus in seinem Käfig und testen Sie die nächsten ein bis zum Ende der Serie.
    5. Wiederholen Sie die nozizeptiven Antwort-Messungen zwei weitere Male, die Messungen von den Tieren in der gleichen Reihenfolge. Das nozizeptive Reaktion Latenz (sek) für jede Maus wird als Mittelwert von drei aufeinanderfolgenden Bestimmungen bestimmt.
  2. Messen mechanischer Antworten mit der Heck Pressure Test (TPT)
    1. Sie vorsichtig die Maus in den Restrainer vorstellen und positionieren den Schwanz unter der Kegelspitze der analgesimeter.
    2. Drücken Sie den Fußschalter gleichmäßig zunehmenden Druck auf den proximalen Teil des Schwanzes bis zum ersten nozizeptiven Reaktion (kämpfen, Quietschen) tritt anzuwenden. Im Moment ist das Tier reagiert, notieren Sie die aktuelle Kraft (in Gramm), die die nozizeptiven Reaktion hervorruft. In der Abwesenheit einer Reaktion wird eine 600 g Grenzwert verwendet, um t zu vermeidenAusgabe Schäden.
    3. Wiederholen dieser Maßnahme auf die mittlere und distale Teile des Schwanzes der gleichen Maus. Ein Abstand von mindestens 30 Sekunden zwischen Maßnahmen auf einem bestimmten Maus, um die Anpassung oder Verzerrungen zu vermeiden Stress beobachtet. Ersetzen Sie die Maus in seinem Käfig und testen Sie das nächste Tier bis zum Ende der Serie (dh alle Mäuse getestet). Die nozizeptiven Wert (g) für jede Maus wird als Mittelwert von drei Messungen (dh proximalen, mittleren und distalen Teile des Schwanzes jedes Tieres) aufgenommen.
  3. Wiederholen nozizeptiven Prüfung (alle Verfahren unter Schritt 2 beschrieben) an den nachfolgenden Tagen, d-3 d-1.

. 3 Messung der Morphin Analgesie (Schritt C, d0)

  1. Definieren Sie die beste Kombination von Tieren, die die Auswahl der zwei Gruppen (n = 8 pro Gruppe) von Mäusen mit stabilen und vergleichbare durchschnittliche nozizeptiven Werte, je nachdem, welcher nozizeptiven Modalität (TIT oder TPT) betrachtet werden können. Dieser Wert wird als Grund entnommen werdennozizeptiven Reaktion der Referenz für zukünftige "Saline" und "Morphine"-Gruppen.
  2. Messung der Körpergewicht jedes Tieres.
  3. Vorbereitung einer Morphin-Lösung (0,5 mg Morphin pro ml) in einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) für die subkutane Verabreichung (5 mg Morphin pro kg Körpergewicht des Tieres).
  4. Messen Sie die nozizeptiven Latenz (als Zeitpunkt 0 genommen) für jede Maus sowohl von "Saline" und "Morphine" Gruppen in der TIT (alle Schritte unter 2.1 oben). Dann messen Schmerzempfindung in der TPT (alle Schritte unter 2.2 oben).
  5. Spritzen subkutan Morphin (in der Regel 0,25 ml einer 0,5 mg / ml Morphin-Lösung pro 25 g Maus Gewicht) und Kochsalzlösung (0,25 ml pro 25 g Maus Gewicht) auf die "Morphium" und "Kochsalzlösung"-Gruppe.
  6. Messen Sie nozizeptiven Werte auf der TIT und TPT (alle oben unter 2.1 beschriebenen Verfahren die Schritte bzw. 2.2) über einen Zeitverlauf (bei 30 min interval) zu beurteilen Morphin (5 mg / kg) induzierte Analgesie:
    1. Nach 30 min nach der Injektion, messen Sie die nozizeptiven Antwort (Einzelbestimmung) für jede Maus der "Saline" und "Morphine" Gruppen, mit der TIT dann die TPT.
    2. Dann bei allen Mäusen messen nozizeptiven Reaktion Werte (TIT und TPT) zu den Zeitpunkten (in Std.): 3,5 1-1.5-2-2.5-3 und Nacheinspritzung.

4 Chronische Behandlung mit Morphin - Morphin-induzierte Hyperalgesie. (Schritt D, D1 bis D6)

  1. Am Tag: d1
    1. Messen nozizeptiven Reaktion Werte auf der TIT und TPT, wie oben beschrieben (Schritte 2.1 und 2.2). Sorgfältig mit Anmerkungen versehen Rückzugslatenzen und Druckgrenzen für jedes Tier.
    2. Eine frische Morphin-Lösung, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
    3. Spritzen subkutan Morphin (5 mg / kg KG) auf die gesamte "Morphine"-Gruppe und physiologischer Kochsalzlösung (0,25 ml pro 25 g Maus Gewicht) auf die "Saline"-Gruppe. Lassen the Tiere ruhen, bis zum nächsten Tag.
  2. Am Tage: D2, D3, D4, D5 und D6, die unter Abschnitt 4.1 beschriebenen Vorgänge wiederholen

. 5 Beweise für Schmerztoleranz (Schritt E; d7)

  1. Bewerten Morphin-induzierte Analgesie nach dem bereits in Abschnitt 3 dargelegt Zeitverlauf Paradigma.

6. Datenerfassung und statistische Analysen

  1. Bewertung der Basal Nozizeptive Antwortwerte (Stufe B)
    1. Berechnen für jeden Tag (über den D-4 bis D-1 Periode) die Durchschnittswerte ± SEM (n = 8) für die basale nozizeptiven Reaktionen ab TIT und TPT in dem "Saline" und "Morphin-Gruppen ergab.
    2. Grundstück bedeuten basalen nozizeptiven Werte als Funktion der Zeit (Tag) für beide Gruppen Abbildung 2.
  2. Analyse von Morphin Analgesie Zeit-Gänge-Days d0 (Schritt C) und D7 (Schritt E)
    1. Berechnen Sie, zu jedem Zeitpunkt nach MorphinInjektion, die Durchschnittswerte ± SEM (n = 8) für nozizeptiven Reaktionen ab TIT (in sec) und in jeder Gruppe lieferte TPT (in g).
    2. Grundstück bedeuten nozizeptiven Reaktion Werte als Funktion der Zeit für die "Saline" und "Morphine" Gruppen am Tag 0 Abbildung 3 und Abbildung 5 7 Tage.
  3. Entwicklung von Morphin-induzierten Hyperalgesie (Schritt D)
    1. Berechnen für jeden Tag (im d0-d7 Behandlungsperiode) die Durchschnittswerte ± SEM (n = 8) für die basale nozizeptiven Reaktion Werte von TIT und TPT in dem "Saline-behandelten" und "Morphin behandelten Gruppen ergab.
    2. Grundstück bedeuten basalen nozizeptiven Reaktion Werte als Funktion der Zeit (Tag) für die "Saline-behandelten" und "Morphin behandelten Gruppen Abbildung 4.
  4. Beweise für Analgesic Tolerance (Schritte C und E)
    1. Bestimmen Sie aus dem Morphin Zeitverlauf experiment durchgeführt bei d0 Abbildung 3 der Zeitwert (oder Zeitbereich) für Morphin erforderlich, um eine maximale analgetische Reaktion zu induzieren.
    2. Nehmen Sie diesen Wert (in der Regel 30 min) als die Referenzzeit auf d7 Abbildung 5 schätzen die Schmerzempfindung Baseline-Wert (Kochsalzlösung behandelten Gruppe) und der tatsächlichen analgetische Reaktion (Morphin behandelten Gruppe), um akute Morphin.
    3. Nozizeptive Werte zum Zeitpunkt 30 min von Morphin Zeitverlauf Experimente an d0 und d7 für die Kochsalzlösung behandelten und Morphin behandelten Gruppen durchgeführt genommen, so dargestellt, als Histogramme Abbildung 6.
    4. Statistik: Analysieren von Daten mit Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen. Die Faktoren der Veränderung waren Behandlung (zwischen Subjekten) und Zeit (im Betreff). Um die Unterschiede in den einzelnen Gruppen separat zu prüfen, wurde ANOVA mit wiederholten Messungen durchgeführt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit ungepaarten t-Test oder gepaarten t-Test, wenn angemessen.
  5. Das Signifikanzniveau bei p <0,05 festgelegt. Alle Statistische Analysen werden mit Hilfe der StatView Software.

Representative Results

Bewertung der Basal Nozizeptive Werte von Naive Mäuse (Stufe B)

TIT und TPT wurden nacheinander auf die gesamte Gruppe von Mäusen (n = 16) aufgebracht, wodurch Durchschnittswerte nozizeptiven Reaktion. Beste Kombination von Tieren erlaubt eine nachträgliche Definition von zwei Gruppen (n = 8) von Mäusen, die als Saline und Morphine, die ähnliche und stabile Grund nozizeptiven Werte anzuzeigen Abbildung 2. Die Gleichwertigkeit der beiden Gruppen ist gültig unabhängig von der nozizeptiven Test ( TIT: 2A; TPT: Fig. 2B), die gewählt wurde.

Zeitkurs für Morphin Analgesie an Tag 0 (Stufe C)

Morphinanalgesie wurde nach einer einzelnen Injektion (sc), Morphin (5 mg / kg) in naive Mäuse mit sowohl TIT 3A und 3B TPT ausgewertet. In beiden Tests, statistische Analysen mit einer ANOVA mit wiederholten Messungen Reveal dass es eine signifikante Wechselwirkung zwischen Behandlung und Zeit für TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) und TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT und TPT Datenanalysen mittels ANOVA mit wiederholten Messungen zeigen, dass es keine Wirkung der Salzinjektion (F (7, 49) = 0,49, p> 0,05) und F (7, 49) = 1,85, p> 0,05 für jeweils TIT und TPT Tests), während Morphininjektion induziert eine starke Analgesie bei Mäusen (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) und F (7, 49) = 34,37, p <0,001 für jeweils TIT und TPT-Tests). Nach 30 min in TIT und nach 60 min in TPT im Vergleich zur Kochsalzlösung injiziert Kontrollgruppe (p <0,001, ungepaarten t-Test) wurde die maximale analgetische Wirkung von Morphin erreicht.

Wiederholte Morphine Verwaltungen induziert Hyperalgesie in Mäusen (Schritt D)

Basal nozizeptiven Werte wurden jeden Tag gemessenvor Kochsalzlösung oder Morphinverabreichung (siehe Protokoll). Wie in Fig. 4 gezeigt ist, einmal täglich Morphin Verabreichungen über 6-Tage-Behandlungsperiode induzierte eine signifikante und progressive Absenkung der Wärme (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, ANOVA mit wiederholten Messungen, Fig. 4A) und mechanischen (F ( 7,56) = 15,55, p <0,001, ANOVA mit wiederholten Messungen, Fig. 4B) nozizeptiven basalen Werte. Hyperalgesie entwickelt schnell wie es begonnen (p <0,01, ungepaarter t-Test, im Vergleich zu mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen) signifikant am Tag 1 in TIT und am Tag 2 in TPT (p <0,05, ungepaarter t-Test, verglichen mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen).

Zeitkurs für Morphin Analgesie an Tag 7 nach Chronische Behandlung mit Morphin (Schritt E)

Am Tag 7 wurden die Mäuse, die täglich Morphin oder Kochsalzlösung Injektionen über einen Zeitraum von 7 Tagen (d0 bis d6), die in T suchtIT Fig. 5A und 5B TPT ersten ihrer basalen nozizeptiven Werte und dann auf ihre analgetische Reaktion auf akute Morphin (5 mg / kg, sc.). In Übereinstimmung mit der Entwicklung der Hyperalgesie in Fig. 4 gezeigt, war die basale nozizeptiven Wert (Zeitpunkt 0) von Mäusen, die chronisch mit Morphin behandelt wurden, signifikant niedriger als die von Kochsalzlösung injiziert Kontrollmäusen (p <0,001, ungepaarter t-Test). Nach einer akuten Morphin, die nozizeptive Reaktion des chronischen Morphin behandelten Gruppe signifikant erhöht, aber die basale nozizeptiven Wert mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollmäusen gemessen bei 30 min in TIT und TPT (p <0,01 bzw. p <0,05, ungepaarter t nur geringfügig überschritten Test bezeichnet) und bei 60 min in TIT (p <0,05; ungepaarten t-Test). 2 h nach der Morphiumbehandlung bis zum Ende des Experiments auf niedrigere Werte zurück nozizeptiven Reaktionen als die Kontrollmäuse (p<0,001, ungepaarter t-Test).

Vergleich der maximalen analgetischen Antworten von Mäusen zu Morphin vor (Tag 0) und nach chronischer Morphinbehandlung (Tag 7).

Nozizeptiven in Fig. 6 dargestellt Schwellenwerte von TIT (A) und TPT (B) durchgeführt 30 min nach Kochsalzlösung oder Morphininjektion, wie in 3 (Tag 0) und 5 (Tag 7) dargestellt. Eine starke Abnahme der Morphinanalgesie wurde bei Mäusen nach chronischer Morphinbehandlung für 7 Tage im Vergleich mit ihrer anfänglichen Schmerzantwort am Tag 0 in beiden nozizeptiven Tests (p <0,001 gepaarter t-Test) beobachtet. Diese Daten zeigen, dass Toleranz hat in Schmerz überempfindlich Tiere entwickeln.

Figur 1
Abbildung 1. Ein Fünf-Stufen-Pro-Prozedur zu Morphin-induzierte Hyperalgesie und Toleranz zu überwachen. Das Protokoll wird über eine Gesamtdauer von 15 Tagen in fünf aufeinanderfolgenden Schritten (AE) unterteilt.

Figur 2
. Abbildung 2 Definition der basalen nozizeptiven Antwortwerte (Schritt B, d-4-d-1). Schwanz Immersion (TIT) (A) und Schwanz Druck (TPT) (B)-Tests werden auf der ganzen Reihe von Tieren angewendet um ihre basalen nozizeptiven Werte zu beurteilen. Danach wurden zwei Gruppen von Mäusen (n = 8), bezeichnet als "Saline" und "Morphin-Gruppen, sind so definiert, dass sie stabil und weisen vergleichbare durchschnittliche nozizeptiven Werte, was die nozizeptiven Modalität, die betrachtet wird.

Fig. 3 Abbildung 3. Zeitkurs für Morphinanalgesie am Tag 0 (Schritt C) in TIT (A) und TPT (B). Die basale nozizeptiven Antwortwert von Mäusen wurde alle 30 Minuten nach einmaliger Morphin (5 mg / kg, sc bestimmt. ) oder Kochsalzinjektionen. Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, ungepaarter t-Test im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Fig. 4
. Abbildung 4 Entwicklung der Hyperalgesie nach wiederholter Verabreichung Morphin (Schritt D, D1 bis D6). Die basale nozizeptiven Wert von Mäusen wurde durch TIT bestimmt (A) und TPT (B) einmal täglich vor Morphin (5 mg / kg,sc.) oder Kochsalzlösung Verwaltung. Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwerte ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. * P <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001 von ungepaarten t-Test, verglichen mit der Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppe.

Figur 5
5. Zeitverlauf für Morphinanalgesie in chronisch-Morphin behandelten Mäusen am Tag 7 (Schritt E) in TIT (A) und TPT (B). Mäuse, die chronisch mit Morphin (schwarze Punkte) oder Kochsalzlösung (weiße Dreiecke) behandelt wurden von Tag 0 bis Tag 6, erhielt am Tag 7 eine einzige Injektion von Morphin (5 mg / kg, sc). oder Kochsalzlösung auf. Die nozizeptiven Reaktion von Mäusen wurde alle 30 min nach Morphin oder Kochsalzinjektion bestimmt. Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. * P <0,05, ** P & #60; 0,01 ungepaarten t-Test, verglichen mit der Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppe. Fehlerbalken, die Symbole Größe nicht überschreiten, werden ausgeblendet.

Fig. 6
6. Vergleich der maximalen analgetischen Reaktionen von Mäusen, Morphin (5 mg / kg, sc). Vor (Tag 0) und nach chronischer Behandlung mit Morphin (Tag 7). Werte hier berichteten von Experimenten in 3 und 5 gezeigt. Nozizeptive Werte wurden mit TIT (A) und TPT (B) 30 Minuten nach der Injektion Morphium oder Kochsalzlösung gemessen. Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. *** P <0,001 von gepaarten t-Test.

Discussion

Kritische Schritte

Wahl des Tiermodells für Nozizeption Messungen

Variabilität in nozizeptiven und analgetische Sensibilität der Mausstämme wurde (Bewertungen 14-16) Bewertungen mit verschiedenen Schmerzmodellen, die sich in ihrer Genese untersucht (nozizeptiven, entzündlichen, neuropathischen), Modalität (thermische, chemische, mechanische), Dauer (akut, Tonic, chronisch) und Ort der Verabreichung (kutane, subkutane, viszerale). Im Vergleich zu anderen Stämmen C57BL/6J ("J" für Jackson Laboratory) Mäusen wurde ein beliebtes Tiermodell für die Schmerzstudien, da sie eine hohe Grundempfindlichkeit nozizeptiven 17,18 und eine moderate analgetische Reaktion auf Opiate 14,19 ausstellen. Nach chronischer Morphinbehandlung, sie entwickeln auch signifikante analgetische Toleranz 20,21, 21,22 Hyperalgesie und Abhängigkeit 20,23.

nt "> Hier wurden Experimente an Mäusen durchgeführt C57BL/6N Tac (" N "für National Institute of Health und" Tac "für Taconics Bauernhof), die mit einem separaten Zweig der Linie B6 gehören. Obwohl C57BL / 6 Mäuse wurden lange als austauschbar betrachtet Neuere Studien weisen signifikante Unterschiede im Verhalten zwischen C57BL/6J und C57BL/6N Stämme 24. Insbesondere die geringere Empfindlichkeit der drei C57BL/6N Subkulturen (einschließlich eines Tac), um thermische akuten Schmerzen können als eine angesehen werden, Vorteil für die Prüfung dieser Phänotyp.

Männliche Mäuse wurden als die überwiegende Mehrheit der Schmerzstudien ausgewählt, mit Mäusen als Tiermodell, sind auf jugendliche Männer 25 durchgeführt. In unseren Händen, sofern sie robuste und reproduzierbare Daten, wenn von den Schmerzmitteln oder Hyperalgesie Punkten untersucht. Gelegentlich, bemerkten wir eine Tendenz für C57BL/6N Weibchen variabler Antworten sowohl in den TIT und TPT Tests liefern. Obwohl diese Beobachtungreflektieren natürliche Schwankungen an den Hormonstatus der Frauen verbunden, Gesamt Mechanismen, die Geschlechtsunterschiede in Schmerz und Analgesie nach wie vor umstritten. Einige Aspekte dieser heiße Debatte wird kurz in den nächsten "Einschränkungen der Technik" Abschnitt vorgestellt werden.

Tier Gewöhnung

Die Mäuse wurden zunächst erlaubt während einer Woche daran gewöhnt, die Tierhaltung zu bekommen. Ähnlich wie bei jedem anderen Verhaltensstudie, Test wurde nach einer 3-tägigen Eingewöhnungszeit-(Abbildung 1, Schritt A) durchgeführt. Wie nozizeptiven Tests sind empfindlich auf Stress, kann zunächst Maßnahmen mehr Latenzen als die folgenden zu geben, vor allem in nicht-Mäusen gewöhnt 26,27. Die Gewöhnung Schritt ermöglicht auch die Gewinnung von stabiler nozizeptiven Reaktion Werte innerhalb des gleichen Tages und zwischen den Tagen 2 und 4. Um zirkadiane Effekte auf nozizeptiven und analgetische reduzieren28,29 Empfindlichkeit wurden alle Prüfungen von 10.00 Uhr bis 04.00 Uhr durchgeführt.

Auswahl des nozizeptiven Tests

Nozizeptive Tests verwenden entweder thermische, mechanische, chemische oder elektrische Reize (26,27,30 Kritik. Ihre Wahl ist entscheidend, da verschiedene nozizeptiven Modalitäten kann durch verschiedene Nozizeptoren und Fasern 18,31,32 verarbeitet werden.

Wir haben uns für den Schwanz Tauchprüfung (TIT) 33, eine modifizierte Version des klassischen Tail-flick-Test von D'amour und Smith 34 entwickelt und den Schwanz Druckprüfung (TPT), von Randall und Selitto 35 angepasst, als Beispiele für thermische und mechanische Modalitäten zu Morphin-induzierte Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen untersucht. Beide Tests wurden häufig bei Ratten verwendet. Eine Sperrzeit systematisch definiert, zu vermeiden oder zu begrenzen das Risiko von Gewebeschäden.

Morphin-Induktioned Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz

Morphine, die prototypische mu-Opiat-Agonist, wurde hier sowohl bei Menschen und Mäusen 1,2,36 ausgewählt, da es ein starkes Schmerzmittel und OIH-Induktor. Morphine analgetische Potenz ist bekannt, dass mit Mausstämme, Verabreichungswege und nozizeptiven Modalitäten variieren. In C57BL / 6 Mäusen wird eine zuverlässige Analgesie in der Regel nach der subkutanen Injektion von Morphin in der 1-20 mg / kg Dosisbereich 14,21 erhalten. Dementsprechend haben wir uns zu einer akuten Analgesie studieren nach einer einzelnen Anwendung (sc) von Morphin bei 5 mg / kg, in der Nähe seiner ED 50-Wert (7-20 mg / kg) aus der thermischen Nozizeption 19,21 bewertet.

Morphinverabreichung wiederholt wird oft mit analgetischen Toleranz und Hyperalgesie (eine verschlimmert Empfindlichkeit auf schmerzhafte stimul (entweder von einer Rechtsverschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve oder einer Abnahme analgetische Reaktion Amplitude oder Dauer belegt) begleiteti belegt von einer Abnahme der basalen nozizeptiven Wert). Beide unerwünschte Erscheinungen hängen von Nagerarten, der Art des Opiat-Verbindung, die ausgewählt wird, und die Dosierung auf die Behandlungsdauer und nozizeptiven Modalitäten 21. Beispielsweise experimentellen Paradigmen Toleranz und Hyperalgesie studieren bestehen tägliche Verabreichung von hohen und konstanten (20 bis 40 mg / kg pro Tag) 22 oder eskalierenden (bis zu 50 oder sogar 200 mg / kg) 20,21 Morphindosen. Dementsprechend gefördert wir die Entwicklung von Hyperalgesie und Toleranz in C57BL / 6 Mäusen durch tägliche Verabreichung Morphin (5 mg / kg; sc) über eine 8-Tage-Frist. Diese moderate Dosis Morphin wurde über höhere, besser zu imitieren Klinikeinsatz bevorzugt.

Aus TIT Betriebs Fenster Set

Eine mögliche Fallstrick in TIT vielleicht die Rolle der Schwanz in der Thermoregulation von Nagetieren 26,37 bezogen werden. Als Umgebungstemperatur ist ein wichtiger Faktor in nociceptive Reaktion Variationen sollte konstant über Experimente 38 gehalten werden (hier 21 ° C). Intensität der Wärme wird in der Regel bis zu einer nozizeptiven Reaktion innerhalb von 5 bis 10 Sek. 27 erkennen gesetzt. Tatsächlich kann das Risiko größer Latenzzeiten für die Überwachung Tierbewegungen nicht mit dem nozizeptiven Reiz zu erhöhen, wohingegen kürzere kann die Differenzleistung des Tests zu reduzieren. Wir führten TIT Messungen bei einer festen Temperatur von 48 ° C. Schwanzrückzugslatenzen waren knapp 9 Sek. (basal nozizeptiven Wert) und variierte von 4 Sek. (Hyperalgesie), um 25 Sekunden (maximal Analgesie; abgeschnitten). Neben praktischen Gründen Messungen nozizeptiver Ansprechwerte bei einer festen Temperatur kann von vornherein um das gleiche Repertoire von Nozizeptoren und Schaltungen, wodurch die Interpretation der Daten zu erleichtern.

Mögliche Änderungen

Optimierung der TIT Betriebsfenster für Analgesie und OIH MeasureMents

Konzentriert man sich auf eine analgetische Reaktion können niedrige Ausgangswerte (höhere Wärmeintensität) den Nachweis einer Verzögerung in der Reaktion begünstigen. Im Gegenzug, um die Folge einer schmerzhaften Reiz oder die Entwicklung von OIH, höhere Ausgangswerte (untere Wärmeintensität, hier 48 ° C) berücksichtigt aber die Detektion von schneller Antworten zu erleichtern Abbildung 4.

Obwohl wir gefunden Morphin bei 5 mg / kg eine günstige Dosis, um eine robuste analgetische Reaktion Abbildung 3 zu induzieren und zu fördern (nach wiederholter Verabreichung) erhebliche Hyperalgesie Abbildung 4 kann die Dosierung angepasst wie zuvor (Critical Schritt genannt werden: Morphin-induzierte Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz). Zum Beispiel können niedrigere Dosen verwendet werden, um Analgesie Amplitude (und damit die Vermeidung von Cut-off-Grenzen) zu reduzieren, während höhere Dosen gewählt, um Hyperalgesie Beginn beschleunigen und ihre Amplitude werden kann.

OveRall, Optimierung der "nozizeptiven Fenster" sollte auf den genetischen Hintergrund von Mäusen untersuchten angepasst werden und berücksichtigen die Möglichkeit der Beteiligung der unterschiedlichen Anordnungen von Nozizeptoren und Schaltungen.

Alternative Opiat-Agonisten (Fentanyl, Remifentanil)

Obwohl die meisten klinisch verwendeten Opiate Ziel der mu-Opioid-Rezeptor als Agonisten, unterscheiden sie sich deutlich in Bezug auf ihre pharmakologischen Eigenschaften in vitro und in vivo. Zum Beispiel, Remifentanil und Fentanyl, ganz im Gegensatz zu Morphin, so verhalten, als volle Agonisten und zu fördern Internalisierung der mu-Opioid-Rezeptoren 39. Opiat-Analgetika wie Morphin und Fentanyl haben Halbwertszeiten im Bereich von 40 Stunden, während Remifentanyl hat ein ultra-kurzen Halbwertszeit von mehreren Minuten 41. Beim Menschen ist beste Beweis für OIH von Patienten, die während der Operation Opiate erhalten, darunter kurzwirksamen compounds wie Remifentanil 2,42. So kann Fentanyl und Remifentanil wertvolle Werkzeuge zu sein, die Entwicklung von Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen unter TIT und TPT Paradigmen zu studieren.

Alternative Formen der Induktion von OIH (chronische vs akute Verabreichung)

OIH wird bei Menschen und Tiermodellen als Folge der Opiat-Verwaltung zu sehen, ob bei sehr niedrigen oder extrem hohen Dosierungen 1,2. Wir berichten hier über OIH Entwicklung nach chronischer Behandlung von Mäusen mit moderaten Dosen von Morphin. Mehrere Tage der Behandlung von C57BL/6N Mäuse waren notwendig, eine klare und reproduzierbare hyperalgetische Zustand Abbildung 4 Tagesmorphiumspritzen adäquat mit implantierten Morphin Pellets ersetzt werden Beweis:. Bei ihrer Entfernung, sowohl thermische Hyperalgesie und mechanischer Allodynie wurden bereits in Mäusen berichtet 43. Infusion von Opiaten durch eine osmotische Mikropumpe ist eine weitere Möglichkeit, 44. Bei Nagetieren langlebige Hyperalgesie ist auch erreichbar nach akuter Verabreichung von Fentanyl unter Verwendung eines Protokolls imitiert die Verwendung dieser mu-Opioid-Agonisten in der Humanchirurgie 36,45,46.

Grenzen der Technik

Tierarten und Modelle für Schmerzen

Vergleichende Untersuchungen von zahlreichen Mausstämme legte Beweise für große Schwankungen in nozizeptiven Reaktionen auf schmerzhafte Reize 17,31,47 und in OIH Spiegel nach 4 Tagen Behandlung mit Morphin-22. Ob Mechanismen in Tiermodellen (Mäuse und Ratten) zugrunde liegenden Schmerzverarbeitung und Modulation sind für Patienten mit chronischen Schmerzen relevant bleibt ein grundlegendes und öffnete Frage. So sollte viel Vorsicht in der Interpretation der Tierdaten und ihre prognostische Validität für den Menschen 16 bezahlt werden.

Geschlechtsunterschiede in Schmerz und Analgesie

ntent "> Die präklinischen Studien an Tiermodellen für Schmerzen haben, auf die männliche Nagetiere 16,25,48 durchgeführt worden. Trotz dieser Selektionsbias, war der Blick auf die aufstrebenden Männer als besser Responder zu Opiatanalgetika 49,50, weniger anfällig betrachten, um Opioid entwickeln Hyperalgesie 51,52 und toleranter gegen Morphinanalgesie 53 als ihre weiblichen Kollegen (Review 54). jedoch Geschlechtsunterschiede im Hinblick auf die Schmerzwahrnehmung und Schmerzmitteln Wirksamkeit nicht so wieder 'eine one size fits all "-Paradigma. Tat eine Fülle von Daten nun an, dass zahlreiche Variablen kann die Größe und Richtung des Geschlechts Unterschiede wie Opioid Wirksamkeit und Selektivität, nozizeptiven Assay genetischen Hintergrund, Alter, Gonado-hormonelle Status oder soziale Interaktion 48,54 beeinflussen. Beim Menschen, der klinischen Schmerz ist bei Frauen häufiger, aber ob diese Tatsache spiegelt tatsächlichen Geschlechtsunterschiede bleibt umstritten 48,55,56. For Beispiel globale Analyse von fünfzig klinischen Studien zeigte keine signifikanten Unterschiede in der analgetischen Eigenschaften zwischen den Geschlechtern in der Erwägung, Meta-Analysen auf die Patienten-kontrollierten Probanden zeigte auf eine deutlich größere Opioid Wirksamkeit bei Frauen 57. Letztere Beobachtung, die deutlich kontrastiert mit dem, was war bei Nagetieren gefunden, stellt sich erneut mehrere Fragen über den Ursprung für solche Abweichungen 16,48,55,57. Insgesamt Geschlechtsunterschiede in Analgesie existieren und Verdienst weiter konzentrieren sich auf zugrunde liegende Mechanismen und klinische Implikationen.

Über nozizeptiven Tests

Die Schwanzrückzugstest ist eine Wirbelsäulenreflex aber es kann unter supraspinalen Einflüsse 58 sein. TIT ist relativ leicht, an Ratten durchzuführen, erfordert aber mehr Erfahrung bei Mäusen. Eine mögliche Schwierigkeit ist es, die Maus in eine richtige Körperhaltung ohne eine unerwünschte Belastung zu erhalten. Das vorgeschlagene Protokoll kann entsprechend eingestellt werden,Kohortengröße. 16 Tiere (8 Kontrolle und 8 behandelt) werden leicht so weit wie Messung ihrer basalen nozizeptiven Reaktion Werte (mit TIT, dann TPT für die gesamte Serie von Mäusen) unter Sorge verwaltet. Überwachung Analgesie Zeitkurse erfordert die Einrichtung einer genauen Zeitplan und die Auswertung der maximalen Anzahl der Tiere, die getestet werden können (TIT, dann TPT) im verliehene Zeitintervall (hier 30 min). Die ganze Gruppe von Tieren kann somit in Untergruppen unterteilt werden, damit die Versuchs kinetische Einschränkungen zu beachten.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehender / Alternativmethoden

OIH bei Ratten im Vergleich zu Maus

Die Ratten wurden intensiv genutzt, um Opioid-Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz zu studieren, nach akuter oder chronischer Opiat-Verwaltung 46,59-61. In der Tat, für einige praktische Gründe, können sie überlegen betrachtet werdenMäuse als Tiermodell für die Schmerzexperimente 16,61. Bis vor kurzem die Erzeugung von gentechnisch veränderten Ratten war jedoch kein einfaches Verfahren. Wie zahlreiche gentechnisch veränderte Mausstämme sind bereits verfügbar, bietet unser Modell die Möglichkeit, den Beitrag der einzelnen Gene in zahlreichen OIH und Toleranzentwicklung in Mäusen untersucht.

TIT und TPT im Vergleich zu anderen nozizeptiven Tests

TIT ist eine Variante der Tail-flick-Test, der offensichtlichste Unterschied ist die Stimulationsbereich. Im Gegensatz zu Strahlungswärme, Eintauchen des Schwanzes in heißes Wasser führt zu einer schnellen und gleichmäßigen Erhöhung seiner Temperatur. Im Vergleich zu anderen Formen der thermischen Nozizeption Tests (Hot-Platte oder Hargreaves-Tests), bietet TIT ziemlich reproduzierbare Ergebnisse zwischen und innerhalb der Themen.

TPT ist ein sehr beliebter Test für die Untersuchung der mechanischen Schmerzempfindung 26,27,35, die wahrscheinlich beinhaltetdeutliche nozizeptiven Fasern und Molekularwandler dann TIT 32. Es bietet schnelle und verlässliche Messungen 59, sondern erfordert einige Erfahrung aus der Experimentator-und Großtier Kohorten. Als Alternative zu der analgesimeter in der vorliegenden Studie, andere Verfahren oder eine Vorrichtung verwendet, die sich auf Dehnungsmessstreifen nicht vorhanden sind (Überprüfung 27). TPT ist am besten geeignet für die Untersuchung mechanischer Hyperalgesie wohingegen von Frey Filamente werden in der Regel übernommen, um mechanische Allodynie (27 Bewertungen) zu bewerten.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach Beherrschung dieser Technik

Die experimentelle OIH / Toleranz Modell wir hier kann ähnlich genetisch veränderte Mäuse, um die Rolle einzelner Gene in der Modulation von Schmerz bewerten angepasst werden. Es bietet auch eine Modellsystem, um die Wirksamkeit von potentiellen therapeutischen Mitteln zu untersuchen, um chronische Schmerzen zu lindern.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir danken Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankreich) für seine Unterstützung.

Diese Arbeit wurde von der CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley und durch Zuschüsse aus Conectus, Agence Nationale de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) unterstützt Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Stadtgemeinschaft Straßburg (Pharmadol) ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6N Tac mice Taconic, Ry, Denmark C57BL/6N Tac B6-M Male mice (25-30 g)
Morphine hydrochloride Francopia, Paris, France CAS no. 52-26-6 Delivered with special authorization
Syringes (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050000 Polypropylene, sterile, volume: 1 ml
Needles (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050101 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1)
Mouse restrainer Home-made Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples
Thermostated water bath GR150 Grant Instruments, Cambridge, UK GP 0540003
Analgesimeter Panlab, Barcelona, Spain LE 7306
Kaleidagraph software Synergy software, Reading, PA, USA Kaleidagraph 4.03  Scientific graphing
STATview software Free download, statistics

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Neuroscience Ausgabe 89 Mäuse Nozizeption Schwanz Tauchprüfung Druckprüfung Schwanz Morphin Analgesie Opioid-induzierte Hyperalgesie Toleranz
Bewertung von Morphin-induzierte Hyperalgesie und Schmerztoleranz in Mäuse mit Thermal-und Maschinen Nozizeptive Modalitäten
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Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., … More

Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., Simonin, F. Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities. J. Vis. Exp. (89), e51264, doi:10.3791/51264 (2014).

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