Summary
Descriviamo un protocollo di esaminare lo sviluppo di iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza nei topi. Sulla base della misurazione di risposte nocicettive termica e meccanica di capre e morfina-trattata, consente di quantificare l'aumento della sensibilità al dolore (iperalgesia) e diminuire in analgesia (tolleranza) associati alla somministrazione cronica di oppiacei.
Abstract
Iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza impatto gravemente l'efficacia clinica di oppiacei come antidolorifici negli animali e nell'uomo. I meccanismi molecolari alla base di entrambi i fenomeni non sono ben compresi e la loro spiegazione dovrebbero beneficiare dallo studio di modelli animali e per l'elaborazione di adeguati protocolli sperimentali.
Descriviamo qui un approccio metodologico per l'induzione, la registrazione e la quantificazione iperalgesia indotta dalla morfina, così come per mettere in evidenza la tolleranza analgesica, utilizzando i test di pressione coda immersione e di coda in topi wild-type. Come mostrato nel video, il protocollo è diviso in cinque fasi sequenziali. Fasi di movimentazione e assuefazione permettono una sicura determinazione della risposta nocicettiva basale degli animali. Somministrazione cronica di morfina induce significativa iperalgesia come dimostrato da un aumento sia della sensibilità termica e meccanica, mentre il confronto di analgesia temporali corsi dopo acuta o reptrattamento con morfina eated indica chiaramente lo sviluppo di tolleranza si manifesta con un calo di ampiezza risposta analgesica. Questo protocollo può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazione della nocicezione e morfina analgesia. Esso fornisce anche un sistema modello per studiare l'efficacia di potenziali agenti terapeutici per migliorare l'efficacia analgesica oppiacei.
Introduction
Indotta da oppioidi iperalgesia (OIH) e la tolleranza analgesico limitano l'efficacia clinica di oppiacei negli animali e nell'uomo 1-3. Il coinvolgimento delle pro-infiammatori 4,5 o di pro-nocicettivi (anti-oppioidi) 6,7 sistemi sono attualmente esplorate ipotesi. La delucidazione dei meccanismi alla base OIH e tolleranza richiede una combinazione di in vivo e in vitro approcci, utilizzando modelli animali appropriati, protocolli sperimentali e strumenti molecolari.
Farmacologia comportamentale è il paradigma dominante per monitorare e quantificare gli stati analgesici e iperalgesiche negli animali da laboratorio (ratti, topi). L'applicazione di uno stimolo nocivo (chimico termici, meccanici o) ad una parte del corpo comoda (zampa posteriore, coda) dell'animale porta ad un ritiro nocifensive che può essere facilmente ottenuto.
Proponiamo qui un approccio metodologico per l'induzione, la registrazione e la quantificazione OIH etolleranza in topi wild-type, utilizzando i test di pressione coda immersione e di coda. La procedura consente una determinazione semplice, sensibile e riproducibile dei valori di risposta nocicettiva termica e meccanica nei topi. Come dimostrato nel protocollo video, C57BL / 6 topi significativa esperienza iperalgesia dopo somministrazione cronica di morfina e mantenere questo per diversi giorni. Entrambi i valori nocicettivi termiche e meccaniche sono significativamente ridotti, rispetto a misurazioni di base sugli animali naïve. Inoltre, il set-up sperimentale permette di monitorare, in aggiunta allo sviluppo di OIH, il declino della risposta analgesica di morfina (tolleranza). Dati presentati supportano l'opinione che iperalgesia e la tolleranza possono comportare meccanismi cellulari e molecolari comuni 8,9, anche se questo è pacifico nella letteratura 1,10-12. Infine, questo protocollo può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazionezione del dolore. Esso fornisce anche un sistema modello per valutare l'efficacia dei potenziali agenti terapeutici per migliorare effetti analgesici oppiacei.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida europee per la cura degli animali da laboratorio (Direttiva 86/609/ECC Comunità europee del Consiglio) e le linee guida etiche per le indagini del dolore sperimentale in animali coscienti 13. Maschio C57BL6 / N Tac topi (10 settimane, 25 - 30 g) sono stati alloggiati in una struttura animale istituzionale con uno staff cura incaricato di guidare la struttura in conformità alle norme ambientali. Gli animali sono stati alloggiati in gruppi (massimo cinque topi per gabbia) sotto un 12 h / 12 h luce / buio ciclo a temperatura costante (21 ± 1 ° C), con libero accesso a cibo e acqua. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nello stesso periodo della giornata (10:00-16:00) utilizzando una coorte di 16 topi. Materiali e attrezzature specifici sono indicati nella tabella materiali.
Una procedura in cinque fasi per monitorare morfina indotta iperalgesia e tolleranza
Il protocollo èsuddiviso in cinque fasi sequenziali (AE) per una durata di 15 giorni di Figura 1.
. 1 Mice Handling (Fase A, d-7 al d-5)
- Maneggiare topi e abituarsi a entrare liberamente nel dispositivo di immobilizzazione. Questa fase preliminare riduce lo stress - minimizzando così qualsiasi confusione con analgesia indotta da stress - e permette agli animali di essere abituati al ricercatore, movimentazione e manipolazione nella immobilizzazione del mouse. Ogni mouse viene delicatamente trattati per 5 minuti ogni giorno.
. 2 basale nocicettivo Response (Fase B; d-4 a d-1)
- Misurare latenze ritiro coda utilizzando il test di immersione coda (TIT):
- Impostare il termostato a 48 ° C.
- Introdurre delicatamente il mouse nella immobilizzazione. Immergere il sporgente 2/3 fine della sua coda in bagno d'acqua e avviare il cronometro.
- Arrestare il cronometro non appena il mouse ritira la coda dall'acqua calda e registrare il tempo di latenza (in sec). In the assenza di reazioni nocicettivo, 25 sec cut-off è usato per prevenire danni ai tessuti.
- Sostituire il mouse nella sua gabbia e testare il successivo fino alla fine della serie.
- Ripetere le misure di risposta nocicettiva altre due volte, prendendo le misure dagli animali nello stesso ordine. La latenza di risposta nocicettiva (sec) per ciascun topo è determinata come valore medio di tre determinazioni successive.
- Misurare risposte meccaniche utilizzando il test Tail pressione (TPT)
- Introdurre delicatamente il mouse nella immobilizzazione e posizionare la coda sotto la punta conica della analgesimeter.
- Premere il pedale per applicare uniformemente crescente pressione sulla parte prossimale della coda fino alla prima reazione nocicettiva (lottando, cigolii) si verifica. Al momento l'animale reagisce, registrare la forza corrente (in grammi) che provoca la risposta nocicettiva. In assenza di qualsiasi reazione, un valore di cut-off 600 g viene utilizzato per evitare temettere danni.
- Ripetere questa misura sulle parti mediane e distali della coda del mouse stesso. Un intervallo di almeno 30 secondi si osserva tra le misure su un dato del mouse per evitare di adattamento o pregiudizi stress. Sostituire il mouse nella sua gabbia e testare l'animale successivo fino alla fine della serie (cioè tutti i topi sono testati). Il valore nocicettivo (grammi) per ogni mouse viene considerata come valore medio di tre misurazioni (cioè prossimali, mediana e parti distali della coda di ciascun animale).
- Ripetere il test nocicettivo (tutte le procedure descritte dalla fase 2) nei giorni successivi, d-3 d-1.
. 3 Misura della morfina Analgesia (Fase C; d0)
- Definire la migliore combinazione di animali che permette la selezione di due gruppi (n = 8 per gruppo) di topi con valori nocicettivi medi stabili e comparabili, a seconda di quale modalità nocicettivo (TIT o TPT) è considerato. Questo valore verrà preso come basalerisposta nocicettiva di riferimento per i gruppi 'Saline' e 'morfina' future.
- Misurare il peso corporeo di ciascun animale.
- Preparare una soluzione di morfina (0,5 mg di morfina per ml) in soluzione salina fisiologica sterile (NaCl 0,9%) per somministrazione sottocutanea (5 mg di morfina per kg di peso corporeo dell'animale).
- Misurare la latenza di risposta nocicettiva (preso come punto di tempo 0) per ogni mouse sia 'Saline' e gruppi di morfina 'del TIT (tutti i passaggi sotto i 2.1 di cui sopra). Quindi misurare nocicezione in TPT (tutte le misure di cui al precedente 2.2).
- Iniettare la morfina per via sottocutanea (tipicamente 0,25 ml di una / ml soluzione di morfina 0,5 mg per 25 g di peso del mouse) e soluzione salina (0,25 ml per 25 g di peso del mouse) per la 'morfina' e gruppi saline ", rispettivamente.
- Misurare i valori nocicettivi sul TIT e TPT (tutte le procedure sopra descritte sotto i punti 2.1 e 2.2, rispettivamente) nel corso di un time-course (a 30 min intervanalgesia al) per valutare morfina (5 mg / kg) indotta:
- Dopo 30 minuti dopo l'iniezione, misurare la risposta nocicettiva (singola determinazione) per ogni mouse del 'Saline' e gruppi di morfina ', utilizzando il TIT poi il TPT.
- Quindi misurare valori di risposta nocicettiva (TIT e TPT) in tutti i topi a intervalli di tempo (in ore): 1-1.5-2-2.5-3 e 3.5 post-iniezione.
4 Morphine trattamento cronico - Morphine indotta iperalgesia. (Step D; d1 a d6)
- Il giorno: d1
- Misurare valori di risposta nocicettiva sul TIT e TPT come descritto sopra (punti 2.1 e 2.2). Annotare accuratamente latenze di prelievo ei limiti di pressione per ogni animale.
- Preparare una soluzione di morfina fresca come descritto al punto 3.2.
- Iniettare la morfina per via sottocutanea (5 mg / kg di peso corporeo) per tutto il gruppo 'morfina' e soluzione fisiologica (0,25 ml per 25 g di peso del mouse) per il gruppo 'Saline'. Lasciate the gli animali riposare fino al giorno successivo.
- Su Days: d2, d3, d4, d5 e d6 ripetere le operazioni descritte al paragrafo 4.1
. 5 Prove di tolleranza analgesica (Step E; d7)
- Valutare analgesia morfina indotta secondo il paradigma time-course già specificato nella Sezione 3.
6. Acquisizione dati e analisi statistiche
- Valutazione della basale nocicettive valori di risposta (Fase B)
- Calcolare per ogni giorno (il d-4-d 1 punto) la media ± valori SEM (n = 8) per le risposte nocicettive basali come accordata dal TIT e TPT all'interno del 'Saline' e gruppi Morphine '.
- Plot valori medi nocicettivi basali in funzione del tempo (giorni) per entrambi i gruppi Figura 2.
- Analisi dei Morphine Analgesia tempo portate presso Days d0 (punto C) e D7 (punto E)
- Calcolare, ad ogni punto dopo morfinainiezione, la media ± SEM valori (n = 8) per le risposte nocicettive come accordata dal TIT (in sec) e TPT (in g) in ciascun gruppo.
- Plot valori medi di risposta nocicettiva in funzione del tempo per il 'Saline' e gruppi morfina 'al giorno 0 Figura 3 e Figura 7 giorni 5.
- Sviluppo di morfina-indotta iperalgesia (Fase D)
- Calcolare per ogni giorno (per tutto il periodo di trattamento d0-d7) la media ± valori SEM (n = 8) per basali valori di risposta nocicettiva, come offerto dal TIT e TPT all'interno del 'Saline trattato' e gruppi di morfina trattati.
- Trama significa basale valori di risposta nocicettiva in funzione del tempo (giorno) per il 'Saline trattato' e gruppi di morfina trattati "Figura 4.
- Prove per analgesica Tolleranza (Procedura C ed E)
- Determinare dalla morfina time-course eXperiment effettuata ad d0 figura 3 il valore di tempo (o intervallo di tempo) richiesto per morfina per indurre una risposta analgesica massima.
- Prendete questo valore (di solito 30 min) come tempo di riferimento per stimare in d7 Figura 5 il valore nocicezione basale (gruppo soluzione salina-trattato) e la risposta analgesica attuale (gruppo morfina-trattato) alla morfina acuta.
- I valori nocicettivo prese al punto di 30 minuti da morfina esperimenti volta portate eseguiti a d0 e D7 per i gruppi trattati con soluzione fisiologica e la morfina-trattati, sono presentati come istogrammi Figura 6.
- Statistiche: Analizzare i dati utilizzando una via per misure ripetute ANOVA. I fattori di variazione sono stati trattamento (tra i soggetti) e l'ora (nel raggio di soggetto). Per controllare le differenze separatamente in ciascun gruppo, misure ripetute ANOVA è stata eseguita. I confronti tra due gruppi sono state eseguite utilizzando il t-test per dati non appaiati o paired t-test quando appropriato.
- Il livello di significatività è fissato a P <0,05. Tutte le analisi statistiche sono effettuate utilizzando il Software Statview.
Representative Results
Valutazione della basale nocicettive Valori di Mice Naïve (Fase B)
TIT e TPT sono stati applicati in sequenza a tutta la coorte di topi (n = 16), fornendo valori di risposta nocicettivi medi. Migliore combinazione di animali ha permesso una definizione a posteriori dei due gruppi (n = 8) dei topi, denominato Saline e morfina, che mostrano valori basali nocicettivi simili e stabili Figura 2. L'equivalenza di entrambi i gruppi è valida qualunque sia il test nocicettivo ( TIT: Figura 2A; TPT: Figura 2B) selezionato.
Time-corso per Morphine Analgesia in occasione della Giornata 0 (Fase C)
Morfina analgesia è stata valutata dopo una singola iniezione (sc) di morfina (5 mg / kg) nei topi naive utilizzando sia TIT Figura 3A e TPT Figura 3B. In entrambe le prove, analisi statistiche con un modo misure ripetute ANOVA reveal che vi è una significativa interazione tra il trattamento e il tempo per TIT (F (7, 98) = 72, p <0.001) e TPT (F (7, 98) = 31, p <0.001). TIT e dati TPT analisi mediante misure ripetute ANOVA indica che non vi è alcun effetto di soluzione fisiologica iniettabile (F (7, 49) = 0.49, p> 0.05) e F (7, 49) = 1.85, p> 0.05, rispettivamente, per TIT e TPT test), mentre le iniezioni morfina induce una forte analgesia nei topi (F (7, 49) = 92.46, p <0.001) e F (7, 49) = 34.37, p <0.001 rispettivamente per TIT e prove TPT). L'effetto analgesico della morfina massima è stata raggiunta dopo 30 min in TIT e dopo 60 min in TPT rispetto ai controlli con soluzione salina iniettata (p <0,001, t-test per dati non appaiati).
Ripetute Amministrazioni morfina Induce iperalgesia nei topi (fase D)
Valori basali nocicettivi sono stati misurati ogni giornoprima salina o morfina amministrazione (vedi protocollo). Come mostrato in Figura 4, le amministrazioni morfina volta al giorno per un periodo di trattamento di 6 giorni indotto un significativo e progressivo abbassamento termico (F (7, 56) = 11,6, p <0.001, misure ripetute ANOVA; la figura 4A) e meccanica (F ( 7,56) = 15,55, p <0.001, misure ripetute ANOVA; la figura 4B) nocicettivi valori basali. Iperalgesia sviluppato rapidamente come cominciò ad essere significativo al giorno 1 in TIT (p <0,01, t-test per dati non appaiati, rispetto ai controlli con soluzione salina iniettata) e al giorno 2 in TPT (p <0,05, t-test per dati non appaiati, rispetto alla soluzione salina controlli-iniettata).
Time-corso per Morphine Analgesia al 7 ° giorno, dopo il trattamento cronico Morphine (Fase E)
Il giorno 7, i topi che hanno ricevuto iniezioni di morfina o salini giornaliere per un periodo di 7 giorni (d0 a d6) sono stati esaminati in TIT Figura 5A e TPT Figura 5B prima per i valori basali nocicettivi e quindi per la loro risposta analgesica di morfina acuta (5 mg / kg, sc.). In accordo con lo sviluppo di iperalgesia mostrato in Figura 4, il valore nocicettivo basale (tempo 0) di topi che sono stati trattati cronicamente con morfina era significativamente inferiore a quella di una soluzione salina iniettata topi di controllo (p <0,001, t-test per dati non appaiati). Seguendo morfina acuta, la risposta nocicettiva del gruppo trattato con morfina cronica significativamente aumentata, ma solo leggermente superiore al valore basale nocicettivo di topi di controllo soluzione salina iniettata misurata a 30 min in TIT e TPT (p <0,01 e p <0,05, t spaiato -test, rispettivamente) e in 60 min in TIT (p <0.05; t-test per dati non appaiati). Da 2 ore dopo il trattamento morfina fino alla fine dell'esperimento, risposte nocicettive restituiti a valori inferiori a quelli dei topi di controllo (p<0,001, spaiato t-test).
Confronto delle risposte massime analgesico della morfina topi per prima (giorno 0) e dopo Morphine trattamento cronico (Giorno 7).
Valori soglia nocicettiva presentati in Figura 6 sono da TIT (A) e TPT (B) effettuati 30 min dopo l'iniezione salina o morfina come illustrato nelle figure 3 (giorno 0) e 5 (giorno 7). Una forte diminuzione della morfina analgesia è stata osservata in topi dopo un trattamento cronico morfina per 7 giorni in confronto con la loro risposta iniziale analgesia al giorno 0 in entrambi i test nocicettivi (p <0,001 paired t-test). Questi dati dimostrano che la tolleranza si è sviluppata nel dolore degli animali ipersensibili.
Figura 1. Un professionista in cinque fasiprocedura per monitorare morfina-indotto iperalgesia e tolleranza. Il protocollo è suddiviso in cinque fasi sequenziali (AE) per una durata totale di 15 giorni.
. Figura 2 Definizione dei valori basali di risposta nocicettiva (Fase B, D-4 per d-1). L'immersione coda (TIT) (A) e la pressione di coda (TPT) (B) le prove vengono applicati a tutta la serie di animali al fine di valutare i loro valori basali nocicettivi. Successivamente, due gruppi di topi (n = 8), denominato 'Saline' e gruppi di 'Morfina', sono definite in modo tale da presentare valori nocicettivi medi stabili e comparabili, qualunque sia la modalità nocicettivo che è considerato.
Figura 3. Tempo portate per analgesia morfina al giorno 0 (Fase C) in TIT (A) e TPT (B). Il valore di risposta nocicettiva basale di topi è stata determinata ogni 30 min dopo singola morfina (5 mg / kg, sc. ) o iniezioni di soluzione salina. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 8 topi per gruppo. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0,001, t-test per dati non appaiati rispetto al gruppo di controllo.
. Figura 4 sviluppo di iperalgesia dopo somministrazione ripetuta di morfina (Fase D; D1 a D6). Nocicettivo Il valore basale di topi è stata determinata mediante TIT (A) e TPT (B) una volta al giorno prima morfina (5 mg / kg,sc.) o la somministrazione di soluzione salina. I dati sono espressi come valori medi ± SEM, n = 8 topi per gruppo. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 da t-test per dati non appaiati rispetto al gruppo di controllo trattato con soluzione salina.
Figura 5. Tempo portate per morfina analgesia in cronico-morfina topi trattati al giorno 7 (fase e) in TIT (A) e TPT (B). I topi che sono stati trattati cronicamente con morfina (punti neri) o salina (triangoli bianchi) dal giorno 0 al giorno 6, ricevuta il giorno 7 una singola iniezione di morfina (5 mg / kg, sc.) o soluzione salina, rispettivamente. La risposta nocicettiva di topi è stata determinata ogni 30 min dopo morfina o iniezione salina. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 8 topi per gruppo. * P <0.05, ** P & #60; 0.01 da t-test per dati non appaiati rispetto al gruppo di controllo trattato con soluzione salina. Le barre di errore che non superano le dimensioni simboli sono nascosti.
Figura 6. Confronto delle risposte massime analgesici della morfina a topi (5 mg / kg, sc.) Prima (giorno 0) e dopo il trattamento morfina cronica (giorno 7). I valori riportati sono da esperimenti mostrati in Figura 3 e Figura 5. nocicettivi valori sono stati misurati utilizzando TIT (A) e TPT (B) 30 min dopo morfina o iniezione salina. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 8 topi per gruppo. *** P <0.001 per paired t-test.
Discussion
Fasi critiche
Scelta del modello animale per misure nocicezione
La variabilità nella sensibilità nocicettiva e analgesico tra topi ceppi è stato esaminato (14-16) recensioni recensioni utilizzando diversi modelli di dolore differenti nella loro eziologia (nocicettivi, infiammatorio, neuropatico), modalità (termica, chimica, meccanica), la durata (acuta, tonico, cronica) e del sito di somministrazione (cutanea, sottocutanea, viscerale). Rispetto ad altri ceppi, C57BL/6J ("J" per Jackson Laboratory) topo è diventato un modello animale popolare per studi sul dolore in quanto presentano un elevato basale sensibilità nocicettiva 17,18 e una risposta analgesica moderata a oppiacei 14,19. Dopo il trattamento morfina cronico, ma anche sviluppare significativa tolleranza analgesica 20,21, iperalgesia 21,22 e dipendenza 20,23.
nt "> Qui, gli esperimenti sono stati condotti su topi C57BL/6N Tac (" N "per il National Institute of Health e" Tac 'per Taconics azienda) che appartengono a un ramo separato del lignaggio B6. Sebbene C57BL / 6 topi sono stati a lungo considerati intercambiabili, studi recenti hanno indicato significative differenze di comportamento dei C57BL/6J e C57BL/6N ceppi 24. In particolare, la minore sensibilità dei tre substrains C57BL/6N (compresa la Tac uno) per acuto dolore termico può essere considerato come un vantaggio per testare questo fenotipo.Topi maschi sono stati selezionati come la stragrande maggioranza degli studi di dolore, utilizzando topi come modello animale, eseguite sui maschi minorenni 25. Nelle nostre mani, hanno fornito dati affidabile e riproducibile, se esaminato da un analgesico o iperalgesia punti di vista. Occasionalmente, abbiamo notato una tendenza per le femmine C57BL/6N di fornire risposte più variabile, sia nel TIT e prove TPT. Anche se questa osservazione puòriflettere le variazioni naturali legati allo status ormonale delle femmine, meccanismi globali sottostanti differenze di sesso nel dolore e analgesia rimangono ancora oggetto di controversia. Alcuni aspetti di questo dibattito caldo saranno brevemente presentati nei prossimi "Limiti della tecnica 'sezione.
Assuefazione degli animali
I topi sono stati autorizzati prima di abituarsi alla struttura animale durante una settimana. Simile a qualsiasi altro studio comportamentale, misurazione è stata eseguita dopo un periodo di 3 giorni acclimatazione (Figura 1, fase A). Come test nocicettivi sono sensibili allo stress, primi provvedimenti possono dare latenze più lunghe di quelle successive, soprattutto nel topo non abituati 26,27. Il passo assuefazione consente anche l'ottenimento di valori di risposta nocicettivi più stabili nello stesso giorno e tra giorni Figure 2 e 4. Per ridurre gli effetti circadiani sulla nocicettivo e analgesicosensibilità 28,29, tutti i collaudi sono state condotte 10:00-04:00.
Selezione di test nocicettivi
Test nocicettivo utilizzano sia termica, meccanica, chimica o stimoli elettrici (revisione 26,27,30. La loro scelta è fondamentale in quanto diverse modalità nocicettivi possono essere trattati attraverso diversi nocicettori e fibre 18,31,32.
Abbiamo scelto la prova di coda di immersione (TIT) 33, una versione modificata del test coda flick classico sviluppato da D'amour e Smith 34, e la prova di pressione coda (TPT), adattato da Randall e Selitto 35, come esempi di termica e modalità di meccanici per studiare analgesia morfina-indotto, iperalgesia e la tolleranza nei topi. Entrambi i test sono stati ampiamente utilizzati nei ratti. Una volta tagliato è stato sistematicamente definito per evitare o limitare il rischio di danni ai tessuti.
Morphine-induzioneed analgesia, iperalgesia e tolleranza
La morfina, il prototipo mu-oppiaceo agonista, è stato scelto qui perché è un analgesico potente e OIH-induttore, sia negli esseri umani e nei topi 1,2,36. La morfina analgesico potenza è noto a variare con ceppi di topi, vie di somministrazione e modalità nocicettivi. In C57BL / 6 topi, analgesia affidabile è solitamente ottenuta dopo iniezioni sottocutanee di morfina nell'intervallo 1-20 dosaggio mg / kg 14,21. Di conseguenza, abbiamo scelto di studiare analgesia acuta a seguito di una singola somministrazione (sc) di morfina a 5 mg / kg, vicino al suo valore ED 50 (7-20 mg / kg), valutato da nocicezione termica 19,21.
Somministrazione di morfina ripetuta è spesso accompagnata con una tolleranza analgesica (attestata da uno spostamento verso destra della curva dose-risposta o da una diminuzione dell'ampiezza della risposta analgesica o durata) e iperalgesia (una sensibilità esacerbata a dolorose StimulHo evidenziato da una diminuzione del valore basale nocicettivo). Entrambi i fenomeni negativi dipendono ceppi di ratti, dalla natura del composto oppiacei che viene selezionato e il suo dosaggio, sulla durata del trattamento e sulle modalità nocicettivi 21. Ad esempio, paradigmi sperimentali per studiare la tolleranza e iperalgesia consistono nella somministrazione giornaliera di elevata e costante (da 20 a 40 mg / kg al giorno) 22 o di crescenti (fino a 50 o anche 200 mg / kg) 20,21 dosi di morfina. Di conseguenza, abbiamo promosso lo sviluppo di iperalgesia e tolleranza in topi C57BL / 6 tramite somministrazione di morfina al giorno (5 mg / kg; sc) per un periodo di 8 giorni. Questa dose di morfina moderata è stato preferito rispetto a quelli più elevati per un migliore utilizzo clinica mimica.
Imposta di finestra operativa TIT
Una possibile trappola in TIT potrebbe essere correlato al ruolo della coda nella termoregolazione di roditori 26,37. Quando la temperatura ambiente è un fattore chiave per nociceptive variazioni di risposta, essa deve essere mantenuta costante (qui a 21 ° C) durante esperimenti 38. Intensità di calore in genere costituito da rilevare una risposta nocicettiva entro 5 a 10 sec 27. Infatti, maggiori latenze possono aumentare il rischio per il controllo dei movimenti di animali non correlati allo stimolo nocicettivo, mentre quelle più corte possono ridurre la potenza differenziale del test. Abbiamo effettuato le misurazioni TIT ad una temperatura fissa di 48 ° C. Latenze ritiro Tail erano vicini a 9 sec (valore basale nocicettivo) e varia da 4 sec (iperalgesia) per 25 sec (analgesia massima, tagliare). Oltre a ragioni pratiche, misurazioni di valori di risposta nocicettivi ad una temperatura fissa possono a priori coinvolgere lo stesso repertorio di nocicettori e circuiti, facilitando così l'interpretazione dei dati.
Possibili modifiche
Ottimizzazione della finestra operativa TIT per l'analgesia e OIH MeasureMenti
Quando concentrandosi su una risposta analgesica, valori basali bassi (maggiore intensità di calore) possono favorire l'individuazione di un ritardo nella risposta. A sua volta, per affrontare la conseguenza di uno stimolo doloroso o lo sviluppo di OIH, elevati valori basali (intensità di calore più bassa; qui 48 ° C) può facilitare l'individuazione di risposte veloci Figura 4.
Anche se abbiamo trovato morfina a 5 mg / kg una dose conveniente per indurre una risposta analgesica robusta figura 3 e di promuovere (somministrazione ripetuta) iperalgesia significativa Figura 4, il suo dosaggio può essere adattato come accennato prima (fase critica: analgesia morfina, iperalgesia e tolleranza). Ad esempio, dosi inferiori possono essere utilizzati per ridurre analgesia ampiezza (evitando limitazioni cut-off) che dosi più elevate possono essere scelti per accelerare iperalgesia insorgenza e aumentare la sua ampiezza.
OveRall, ottimizzazione della 'finestra nocicettivo' deve essere adattata alla background genetico dei topi in fase di studio e prendere in considerazione la possibilità per il coinvolgimento di matrici distinte di nocicettori e circuiti.
Agonisti oppiacei alternativi (fentanil, remifentanyl)
Sebbene oppiacei utilizzati clinicamente più bersaglio il recettore mu-oppioide come agonisti, differiscono notevolmente per quanto riguarda le loro proprietà farmacologiche sia in vitro che in vivo. Ad esempio, remifentanyl e fentanyl, in netto contrasto con la morfina, si comportano come agonisti completi e promuovere internalizzazione dei mu-oppioidi recettori 39. Analgesici oppiacei come la morfina e fentanil hanno emivita nel range di 40 ore, mentre remifentanyl ha un ultra-breve emivita di diversi minuti 41. Negli esseri umani, miglior prova per OIH è da pazienti che hanno ricevuto oppiacei durante l'intervento, tra cui breve durata d'azione compounds come remifentanyl 2,42. Così, fentanil e remifentanyl possono essere preziosi strumenti troppo per studiare lo sviluppo di iperalgesia e della tolleranza nei topi, sotto TIT e paradigmi TPT.
Modi alternativi di induzione di OIH (cronica vs somministrazione acuta)
OIH è visto negli esseri umani e modelli animali a seguito di somministrazione di oppiacei, anche a livelli molto bassi o estremamente alti dosaggi 1,2. Riportiamo qui sullo sviluppo OIH dopo il trattamento cronico di topi con dosi moderate di morfina. Diversi giorni di trattamento dei topi C57BL/6N erano necessari per evidenziare una chiara e riproducibile iperalgesico Figura Stato iniezioni di morfina 4 giornaliere potrebbero essere adeguatamente sostituiti con pellet morfina impiantati:. Alla loro rimozione, sia iperalgesia termica e allodinia meccanica sono stati già segnalati nei topi 43. L'infusione di oppiacei attraverso una micro-pompa osmotica è un'altra possibilità 44. Nei roditori, iperalgesia duraturo è realizzabile anche dopo somministrazione acuta di fentanil usando un protocollo mimando l'uso di questo agonista mu-oppioide in chirurgia umana 36,45,46.
Limitazioni della Tecnica
Specie animali e modelli per il dolore
Studi comparativi di numerosi ceppi di topi fornito prove per grandi variazioni nelle risposte nocicettive a stimoli dolorosi 17,31,47 e nei livelli Oih a seguito di trattamento di 4 giorni morfina 22. Se i meccanismi alla base di elaborazione del dolore e modulazione in modelli animali (topi e ratti) sono rilevanti per i pazienti con dolore cronico rimane una domanda fondamentale e aperto. Quindi, molta cautela deve essere prestata l'interpretazione dei dati animali e alla loro validità predittiva per gli esseri umani 16.
Differenze di genere nel dolore e analgesia
S copi "> sono stati condotti maggior parte degli studi preclinici su modelli animali di dolore su roditori maschi 16,25,48. Nonostante questo bias di selezione, la vista emergente è stato quello di considerare i maschi come responder migliori ai analgesici oppiacei 49,50, meno incline a sviluppare oppioidi iperalgesia 51,52 e più tollerante alla morfina analgesia 53 rispetto alle loro controparti femminili (revisione 54)-indotta. Tuttavia, le differenze di sesso in materia di nocicezione ed efficacia farmaci analgesici non riprendono in tale 'un one size fits all' paradigma. Infatti, una ricchezza di dati indica ora che numerose variabili possono influenzare la grandezza e la direzione delle differenze di sesso, quali l'efficacia degli oppioidi droga e selettività, test nocicettivo, background genetico, l'età, lo stato gonado-ormonale o di interazione sociale 48,54. Negli esseri umani, il dolore clinico è più frequente nelle donne, ma se questo fatto rispecchia le reali differenze di sesso rimane una questione di dibattito 48,55,56. For esempio, l'analisi globale di cinquanta studi clinici ha indicato differenze significative nelle proprietà analgesiche tra i generi che meta-analisi eseguita su argomenti pazienti-controllati evidenziato una significativa maggiore efficacia degli oppioidi nelle donne 57. Quest'ultima osservazione, che contrasta nettamente con quello che è stato trovato in roditori, solleva di nuovo diverse domande riguardanti l'origine di tale divergenze 16,48,55,57. Complessivamente, esistono differenze di sesso in analgesia e merito ulteriormente concentrarsi sui meccanismi sottostanti e implicazioni cliniche.A proposito di test nocicettivo
Il test ritiro coda è un riflesso spinale, ma può essere soggetto a influenze sovraspinali 58. TIT è relativamente facile da eseguire su ratti ma richiede più competenze nei topi. Un potenziale difficoltà è di mantenere il mouse in una postura corretta senza indurre sollecitazioni indesiderate. Il protocollo proposto può essere regolata a secondadimensioni coorte. 16 animali (8 controllo e 8 trattati) sono facilmente gestibili per quanto riguarda la misurazione dei valori di risposta nocicettiva basali (utilizzando TIT prima, poi TPT per tutta la serie di topi) è sotto preoccupazione. Monitoraggio corsi a tempo analgesia richiede l'istituzione di un calendario preciso e la valutazione del numero massimo di animali che possono essere testati (TIT, poi TPT) entro l'intervallo di tempo impartita (qui 30 min). L'intero gruppo di animali può quindi essere diviso in sottogruppi per consentire lo sperimentatore di rispettare limitazioni cinetiche.
Importanza della Tecnica rispetto al / metodi alternativi esistenti
OIH nei ratti contro topo
I ratti sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'analgesia con oppioidi, iperalgesia e tolleranza, a seguito acuta o cronica somministrazione di oppiacei 46,59-61. Infatti, per diversi motivi pratici, essi possono essere considerati miglioritopi come modello animale per esperimenti di dolore 16,61. Tuttavia, fino a poco tempo, la generazione di topi geneticamente modificati non è una procedura semplice. Come numerosi ceppi di topi geneticamente modificati sono già disponibili, il nostro modello offre l'opportunità di studiare il contributo di numerosi geni singoli OIH e sviluppo della tolleranza nei topi.
TIT e TPT contro altri test nocicettivi
TIT è una variante del test tail flick, la differenza più evidente è l'area di stimolazione. In contrasto con calore radiante, immersione della coda in acqua calda porta ad un aumento rapido e uniforme della sua temperatura. Rispetto ad altre forme di test nocicezione termica (test di hot-piastra o Hargreaves), TIT fornisce risultati abbastanza riproducibili sia attraverso e all'interno di soggetti.
TPT è un test molto popolare per lo studio della nocicezione meccanica 26,27,35 che coinvolge probabilmentefibre nocicettive distinti e trasduttori molecolari poi TIT 32. Esso fornisce misure veloci e affidabili 59, ma richiede una certa perizia da sperimentatore e grandi coorti di animali. In alternativa alla analgesimeter utilizzato nel presente studio, altre procedure o apparecchi basandosi su estensimetri esistono (rassegna 27). TPT è più adatto per studiare l'iperalgesia meccanica che filamenti di von Frey sono di solito prese per valutare allodinia meccanica (revisione 27).
Le applicazioni future o arrivarci Dopo aver imparato questa tecnica
Il modello sperimentale OIH / tolleranza presentiamo qui può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazione del dolore. Fornisce inoltre un sistema modello per studiare l'efficacia di potenziali agenti terapeutici per alleviare il dolore cronico.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Francia) per il suo sostegno.
Questo lavoro è stato sostenuto dal CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley e da sovvenzioni dal Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30 g) |
| Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS no. 52-26-6 | Delivered with special authorization |
| Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene, sterile, volume: 1 ml |
| Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
| Mouse restrainer | Home-made | Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples | |
| Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
| Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
| Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
| STATview software | Free download, statistics |
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