Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oprichting van een Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Abstract

De bloed-hersenbarrière (BBB) ​​regelt specifiek de moleculaire en cellulaire flux tussen het bloed en het zenuwweefsel. Ons doel was het ontwikkelen en karakteriseren zeer reproduceerbare syngeen rat in vitro model van de BBB met co-culturen van primaire endotheelcellen van rattenhersenen (RBEC) en astrocyten receptoren betrokken transcytose in de endotheelcellen monolaag bestuderen. Astrocyten werden geïsoleerd door mechanische dissectie volgende trypsinedigestie en voor later co-cultuur zijn bevroren. RBEC werden geïsoleerd uit 5 weken oude cortex rat. De hersenen werden ontdaan van hersenvliezen en witte stof, en mechanisch gescheiden na enzymatische afbraak. Daarna werd het weefselhomogenaat in runderserumalbumine gecentrifugeerd verblijf fragmenten scheiden van zenuwweefsel. De fragmenten schip onderging een tweede enzymatische digestie vrij endotheelcellen uit hun extracellulaire matrix. De resterende contaminerende cellen zoals pericyten werden fERDERE geëlimineerd door plating de microvessel fragmenten in-puromycine bevattend medium. Ze werden vervolgens gepasseerd op filters voor co-cultuur met astrocyten geteeld op de bodem van de putjes. RBEC uitgedrukt hoge niveaus van tight junction (TJ) eiwitten zoals occludin, claudin-5 en ZO-1 met een typische lokalisatie in de cel grenzen. De transendotheliale elektrische weerstand (TEER) van de hersenen endotheliale monolagen, met vermelding van de dichtheid van TJs bereikt 300 ohm · cm 2 gemiddeld. De endotheliale permeabiliteit coëfficiënten (Pe) voor lucifer geel (LY) was zeer reproduceerbaar met een gemiddelde van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotheelcellen georganiseerd monolagen sprak de efflux transporter P-glycoproteïne (P-gp), toonde een gepolariseerd transport van rhodamine 123, een ligand voor P-gp, en toonde specifieke transport van transferrine-Cy3 en DiILDL in de endotheelcellen monolaag. Tot slot bieden we een protocol voor het opzetten van een in vitroBBB model dat zeer reproduceerbaar door de kwaliteitsborgingsmethoden en die geschikt is voor onderzoek naar BBB transporters en receptoren.

Introduction

Veel geneesmiddelen ontwikkeld centraal zenuwstelsel (CNS) te behandelen aandoeningen zijn niet in staat om de hersenen parenchym in therapeutisch relevante concentraties bereiken. De BBB beschermt hersenen zenuwweefsel van de fluctuatie van plasma samenstelling van ziekteverwekkers en onderhoudt homeostase van het hersenparenchym door uitsluitend niet-specifieke flux van ionen, peptiden, eiwitten en zelfs cellen in en uit de hersenen 1.

BBB kenmerken worden opgewekt en gehandhaafd door intieme nabijheid en overspraak tussen de gespecialiseerde klasse hersenen microvasculaire endotheelcellen en naburige elementen van de neuro-vasculaire glia-eenheid (NGVU) zoals neuronen, gliacellen (nauwkeuriger astrocyten eind voet), en pericyten gevat in de basale membraan dat in hoofdzaak bestaat uit collageen type IV, fibronectine, laminine en proteoglycanen 2,3. Pericytes dekken ongeveer 22-32% van het endotheel op het capillair niveau en spelen een belangrijkerol in de regulatie van endotheel proliferatie, angiogenese en ontstekingsprocessen. Endotheelcellen vormen een continu vel die het binnenoppervlak van de haarvaten. Zij zijn onderling verbonden door TJS die een bandvormige structuur te vormen in het apicale gebied en die bijdragen tot polarisatie cel. Astrocytes reguleren BBB eigenschappen en zijn bronnen van belangrijke regulerende factoren zoals TGF-β, GDNF, bFGF en IL-6. Astrocyten tekort aan GFAP met onvolledige functionaliteit zijn niet in staat om BBB-eigenschappen 4 reguleren. Neuronen zijn niet direct structureel betrokken bij de vorming van de BBB, maar reguleren ook belangrijke aspecten van eiwitexpressie en BBB functies 5.

Om verdere studie van de structuur, fysiologie en pathologie van de BBB, in vitro modellen van BBB werd ontwikkeld als research tools. Brain endotheelcellen zijn gewonnen uit verschillende soorten uit te voeren in vitro BBB-modellen op basisop lage passage primaire kweken van runderen 6,7, varkens 8,9, 10,11,12 rat, muis 13 en ook de menselijke 14,15. Deze modellen zijn bekend bootsen de in vivo BBB, vooral wanneer co-gekweekt met gliale cellen van rat of muis en / of pericyten 16,12 en / of neurale voorlopercellen cel afkomstige astrocyten 17 en / of neuronen 18. De "in lab" modellen vaak uit knaagdieren omdat zij kunnen in vitro / in vivo experimenten en vergelijkingen en / of het onderzoek van de hersenen endotheelcellen uit transgene modellen 19.

Nieuw ontwikkelde in vitro BBB-modellen zijn ook ontworpen om te helpen de hersenen opname van potentiële CNS kandidaat-geneesmiddelen voorafgaand aan in vivo testen 15,20,21,3,6,22,11,23 voorspellen. In vitro BBB-modellen worden meestal gebruikt om te vergelijken het vervoer van drugs met: i) bekend penetratie in het CZS of met low permeabiliteit over de BBB en geen centrale effecten, en ii) de schijnbare Pe van dezelfde geneesmiddelen gemeten in diermodellen van dezelfde soort. De geneesmiddelen die gemakkelijk over de BBB meestal lipofiele en steek de hersenen endotheliale celmembranen door lipide gemedieerde gratis verspreiding (cafeïne, carbamazepine, enz.). De negatief vervoerde geneesmiddelen zoals digoxine, verapamil of cyclosporine A actief geëxtrudeerd door hersenen endotheliale transporters zoals P-gp. Echter, veel van de nieuw ontwikkelde therapeutische moleculen biofarmaceutica, zoals recombinante eiwitten, siRNA of monoklonale antilichamen. De meeste van hen de BBB niet oversteken door i) het ontbreken van specifieke vervoerders, en ii) de dicht opeengepakte laag van endotheelcellen, die voorkomen dat hoge gewicht moleculen gevormd worden van het ondergaan paracellulaire passage. Met deze grenzen, "Trojaans paard" strategieën zijn geïmplementeerd met behulp van vectoren (antilichamen, peptiden) tegen bekende receptoren op de BBB, betrokken zijn in receptor gemedieerd transport of transcytose (RMT), zoals transferrine (Tf) receptor (TfR), de insulinereceptor (IR), of leden van de LDL receptor (LDLR)-gerelateerde receptoren (LDLR, LRP1). Dergelijke receptoren zijn gevonden op geïsoleerde hersenen haarvaten en de BBB in vivo 24,25. Transcriptionele profielen van deze receptoren, met name die van de familie LDLR, werden geanalyseerd en vergeleken tussen de hersenen endotheelcellen en hersenen endotheelcellen samen gekweekt met astrocyten of hersenen haarvaten direct na extractie uit de hersenen 26. Pardridge 24 opende het veld met de OX-26 antilichaam tegen de transferrinereceptor (TfR), gevolgd door antilichamen tegen de insulinereceptor en insuline-groeifactor receptor 27,28. Met deze antilichamen gebaseerde vectoren, heeft ArmaGen Technologies een BBB moleculair Trojaans paard platform technologie ontwikkeld om drugs te leveren, waaronder eiwitten, over de BBB 29. Deliteratuur is rijk aan gegevens waaruit blijkt LRP1 expressie in de hersenen endotheelcellen en haar rol als een krachtige endocytisch / scavenger receptor. Western blot analyse suggereerde dat LRP1 wordt uitgedrukt in fracties, aangerijkt met hersenen haarvaten en in de hersenen van de rat capillaire endotheelcellen 30. Bedrijven zoals Angiochem doel LRP1 met peptide vectoren afgeleid van aprotinine dat efficiënte drug instroom te bevorderen over de BBB 31. Echter, is LRP1 ook betrokken bij actief transport van AB en haar efflux / ontruiming van de hersenen parenchym om bloed 32. Deze gegevens omvatten LRP1 in een bidirectionele transport over de BBB afhankelijk van de liganden. biOasis ontwikkelt Transcend technologie met een eiwit melanotransferrine voor het transport van biologische zoals lysosomale enzymen en antilichamen over de BBB 33 terwijl VECT-HORUS ontwikkelt peptide vectoren die de LDLR 34 richten. Er worden gegevens suggereren dat de LRP en LDLR kunnen worden gebruikt diff vervoerenErent moleculen zoals lysosomale enzymen 35,36 of nanodeeltjes complexen over de BBB 37.

Ons aandachtsgebied is drug delivery aan de CNS behulp vectormoleculen en vectorized drug-kandidaten voor de behandeling van het centrale zenuwstelsel. Vooral geneesmiddelafgifte over de BBB is in het kader van ontstekingsprocessen in een proces dat kan variëren in de mate van belang, maar dat waarschijnlijk voor alle hersenletsels en ziekten, waaronder encefalitis, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer enz. ontstekingsprocessen wordt geassocieerd met BBB-ontsteking en mogelijk veranderingen in BBB fysiologie en permeabiliteit gezien het feit dat paracellulaire en transcellulaire vervoer kan worden versterkt in pathologische omstandigheden 38,39,40,41,42,43. Bijvoorbeeld, TNF-α, TWEAK, en andere cytokinen moduleren ontsteking en experimenten met in vitro BBB modellen hebben aangetoond dat zij de paracellulaire eigenschappen van e kan veranderene endotheelcellen monolaag 38,39,40 en TNF-α leidt ook tot een toename van transcellulair transport van LDL 41, holotransferrin 42 en 43 lactoferrine.

Ons doel was het ontwikkelen en karakteriseren van een geoptimaliseerde en zeer reproduceerbaar rat syngeen BBB-model met behulp van co-culturen van primaire hersentumoren endotheelcellen en astrocyten. We gebruikten 5 week oud en neonatale Wistarratten voor hersenen endotheelcellen productie en astrocyten productie respectievelijk. Een uitdaging was om een ​​protocol waarmee de productie van "wekelijkse reproduceerbare" BBB-modellen vast te stellen. Om deze doelstelling te bereiken, elke stap van het productieproces protocol werd uitgevoerd op vaste dagen van de week, vanaf hersenen microvessel productie op woensdag van de eerste week. Dissecties werden bijna elke week uitgevoerd tijdens de laatste 3 jaar. Verdere verbetering van de reproduceerbaarheid van de culturen, werd een systeem voor kwaliteitsborging. Alle Reagents en chemicaliën werden verwezen in een databank (datum van binnenkomst, voorraad, vervaltermijn, enz.).

Het model werd gekarakteriseerd na een aantal criteria, zoals endotheelcellen organisatie en zuiverheid, TEER, LY permeabiliteit, respons op pro-inflammatoire middelen, kwalitatieve en kwantitatieve expressie van eiwitten TJ functionaliteit van transporters zoals P-gp en receptoren betrokken transcytose in de endotheelcellen monolaag zoals TfR of LDLR.

Protocol

1. Productie van Rat Astrocytes

Voor elk preparaat gebruiken 10 neonatale Wistarratten van beide geslachten.

  1. Offer de ratten door snijkoppen met een schaar en zet ze onmiddellijk in een droge petrischaal onder een laminaire stroming kap. Verwijder de hersenen uit de schedel zonder cerebellum en overbrengen onmiddellijk in een petrischaal met koude dissectie buffer: HBSS aangevuld met 1% runderserumalbumine (lage endotoxine BSA), 100 eenheden penicilline / ml en streptomycine 100 ug / ml.
  2. Snijd de hersenen in de helft, om de 2 hersenhelften gescheiden en breng ze in een schone petrischaal met dissectie buffer op ijs. Snijd de oogzenuw en verwijder de hersenvliezen onder een stereomicroscoop.
  3. Was de corticale stukken uitgebreid in 50 ml koud dissectie buffer.
  4. Plaats de corticale stukken van 3 hersenen in een 15 ml Falcon buis en distantiëren door en neer te pipetteren een staatsgreeple malen met 10 ml wegwerp pipet met een blauwe tip in 6 ml 0,05% trypsine - EDTA 0,02% gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
  5. Voeg 24 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en de volgende antibiotica, penicilline 100 eenheden / ml streptomycine en 100 ug / ml, media genaamd glia celmedium (GCM) en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. FBS batches werden geselecteerd en gevalideerd voor de groei en overleving van astrocyten cutures.
  6. Resuspendeer de pellet met de gedissocieerde cellen in 10 ml GCM en plaat in een 75 cm 2 T-kolf (T75). Verander het medium de volgende dag om de celresten te verwijderen en DNA. Vervang het kweekmedium tweemaal per week.
  7. Na 1 week van proliferatie, schud de gliacellen met een orbitale schudder bij 60 rpm gedurende 24 uur bij 37 ° C in GCM. Als de T75 niet in een incubator worden gebracht met 5% CO 2/95% lucht bij 37 ° C bevochtigde atmosfeer, vullen de media 5 mM HEPES. Was de cellen tweemaal aan rchrap de niet-hechtende microgliale cellen.
  8. Drie weken na het zaaien, was de cellen tweemaal met DPBS zonder calcium en magnesium. Voeg 3 ml warm trypsine-EDTA 0,05% 0,02%, incubeer bij 37 ° C en wacht tot de cellaag wordt verspreid (meestal 5 min). Remmen trypsine activiteit door toevoeging van 10 ml GCM, breng de celsuspensie in een 15 ml Falcon buis en centrifugeer bij 120 xg gedurende 8 minuten.
  9. Resuspendeer de pellet in astrocyte 90% FBS - 10% DMSO, overbrengen naar cryovials (2 x 10 6 cellen per cryoflesje) en bewaar in vloeibare stikstof.

2. Isolatie van Rat Brain microvessels

Onze experimentele procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Faculteit van Marseille en voldoen aan de nationale en Europese regelgeving (EU-richtlijn nr. 86/609). Alle inspanningen werden geleverd om dierenleed te minimaliseren en vermindering van het aantal gebruikte dieren.

  1. Voor elk preparaat en voor een experimenter, gebruiken 3 vijf weken oude Wistarratten.
  2. Maandag van de eerste week, 2 T75 kolven bereid door het coaten met type IV collageen en fibronectine, zowel 1 ug / cm 2 in steriele kweek water (10 ml per T75). Laat hechten bij 37 ° C tot microvaatje zaaien.
  3. Woensdag ochtend van de eerste week, euthanaseren de ratten onder een toenemende flux CO 2 slaperigheid induceren, verlies van houding en ademhaling onderbreking, gevolgd door cervicale dislocatie. Spuit de koppen met 70% ethanol. Snijd de koppen met een schaar en overbrengen onder een laminaire stroming kap in een droge petrischaal.
  4. Verwijder de hersenen uit de schedel zonder cerebellum en de optische zenuwen, dan overbrengen naar een petrischaal gekoeld op ijs en gevuld met koud dissectie buffer (HBSS aangevuld met 1% BSA, 100 eenheden penicilline / ml en streptomycine 100 ug / ml) .
  5. Snijd de hersenen in de helft van de 2 hersenhelften en aparte middenhersenen scheiden van voorebrain. Breng de voorhersenen in een schone petrischaal op ijs met dissectie buffer.
  6. Neem een ​​paar halve bollen in een nieuwe petrischaal met koud dissectie buffer om de hersenvliezen verwijder voorzichtig uit de voorhersenen onder een stereomicroscoop met N ° 5 gebogen pincet. Dan, het reinigen van de binnenkant van de hersenen om het dekbed van myeline verwijderen en het verkrijgen van een schil van cortex. Deze stappen moeten meer dan 2 uur voor weefsel behoud en overleving van de cel niet nemen.
  7. Distantiëren de cortex van 3 hersenen in 6 ml koud dissectie buffer in dounce homogeniseerapparaat een 7 ml met 10 opwaartse als neerwaartse slag met elk van 2 stampers van verschillende afstanden, 71 um gevolgd door 20 micrometer.
  8. Verdeel de suspensie tot het equivalent van 1 cortex in 1 ml van een 50 ml Falcon buis en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen. Verwijder het supernatant.
  9. Digest de suspensie van 1 cortex met 1 ml van een enzymatische oplossing die een mengsel van collagenase / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase type I (35 ug / ml - 20 K eenheden / ml) en gentamicine (50 ug / ml) in een schudder gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  10. Meng 1 ml verteren van 1 cortex met 10 ml 25% BSA / 1X HBSS en gescheiden door densiteitafhankelijke centrifugeren bij 3600 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng zorgvuldig de bovenste schijf (myeline en de hersenen parenchym) en de bovenstaande vloeistof in een schone 50 ml Falcon buis en herhaal het centrifugeren. Houd de resulterende pellet die de hersenen microvaatjes bij 4 ° C.
  11. Gooi de bovenste schijf en het supernatant voorzichtig. Resuspendeer beide resulterende pellets die de hersenen microvaatjes met 1 ml koude HBSS 1X en over in een schone 50 ml Falcon buis.
  12. Was de microvaatjes door toevoeging van 20 ml koude HBSS 1X en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
  13. Verder verteren de microvaatjes van 1 cortex met 1 ml van dezelfde enzymatische oplossing zoals beschreven in stap 2.9 gedurende 1 uur bij 37 ° C in een shAker.
  14. Vervolgens meng de gedigereerde microvaatjes uit elk van de 3 cortex in een buis en verder gescheiden in twee 50 ml Falcon buizen bloedvaten uit het equivalent van anderhalf (1,5) cortex per slangetje. Voeg 30 ml koud dissectie buffer en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Resuspendeer de pellet in 10 microvaatje ml DMEM/F12 aangevuld met 20% bovien bloedplaatjes arm plasma afgeleid serum, basische fibroblastgroeifactor (bFGF, 2 ng / ml) heparine (100 ug / ml), gentamicine (50 ug / ml) en HEPES (2.5 mM), genaamd endotheelcellen media (ECM) aangevuld met puromycine bij 4 ug / ml.
  16. Neem de 2 gecoate T75 kolven uit de incubator, zuig het overtollige van de coating en de plaat de haarvaten van elke buis in een T75 fles (microvessels onttrokken 1.5 cortex per T75 fles).

3. Zuivering en verspreiding van RBEC Primocultures

  1. Zuivering: woensdag tot en met vrijdag, voeg puromycin bij 4 ug / ml aan het kweekmedium. Verander het medium op donderdag. Op vrijdag was de cellen en voeg puromycine op 2 ug / ml tot en met maandag.
  2. Proliferatie: op maandag van de tweede week, was de cellen en voeg insuline, transferrine en natriumseleniet supplement aan het kweekmedium tot de culturen oplopen tot 90% samenvloeiing op woensdag van de tweede week.

. 4 Differentiatie: Het opzetten van de In Vitro BBB Model

  1. Maandag van de tweede week, filters (polyethyleen, 12 wells, poriegrootte 1,0 um) bereid door bekleding met een combinatie van collageen type IV, fibronectine en zowel 0.5μg/cm 2 kweek in steriel water (500 ui mengsel in het bovenste compartiment en 1,5 ml steriel cultuur water in het onderste compartiment). Laat hechten bij 37 ° C tot RBEC zaaien.
  2. Maandag van de tweede week, vijf dagen vóór de oprichting van de co-cultuur, ontdooien de astrocyten uit cryovials bij 37 ° C en de overdrachtin een 15 ml Falcon met 10 ml GCM. Centrifugeer de suspensie bij 120 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Resuspendeer de pellet in astrocyten GCM en plaat bij een dichtheid van 30 x 10 3 cellen per cm2 in 12-well platen.
  4. Woensdag van de tweede week, net voor dissociatie van RBEC met trypsine, was tweemaal de pre-coated filter met DMEM/F12-medium. Pre-vul de kamers met ECM: 1,5 ml in het onderste compartiment en 0,5 ml in het bovenste compartiment.
  5. Woensdag van de tweede week, was tweemaal de RBEC met DPBS zonder calcium en magnesium. Voeg 4 ml warm trypsine 0,05% - 0,02% EDTA-oplossing bij 37 ° C per T75 fles gedurende 30 seconden precies. Verwijder vervolgens 3,5 ml trypsine oplossing en nemen onder de microscoop. Wanneer de cellaag begint los te maken van de matrix, te helpen bij de rand van de T75 kolf te tikken totdat alle cellen zweven.
  6. Voeg 9 ml van ECM per T75 fles en over in een 15 ml Falcon buis. Heel voorzichtig distantiëren de celschorsing door en neer te pipetteren 4 keer met een pipet 10 ml voorzien van een gele tip (vermijd de productie van bellen in de oplossing). Tel de cellen in de suspensie (ca. 3 x 10 6 cells/T75) en direct plaat van vooraf gecoat en voorgevulde filters met hoge dichtheid (160 x 10 3 cellen / filter dus ongeveer 18 filters/T75) (Figuur 8 ). De volgende dag (donderdag), veranderen twee keer het medium van het bovenste compartiment naar cel vuil te verwijderen.
  7. Donderdag van de tweede week, de dag vóór de oprichting van de co-cultuur, vervang de astrocyten cultuur media met 1,5 ml van differentiatie media (ECM met hydrocortison bij 500 nM) die kan worden aangevuld met 1/3 geconditioneerde medium van de basale compartiment van een eerdere co-cultuur (3 dagen van contact tussen endotheelcellen en astrocyten).
  8. Vrijdag van de tweede week wordt gedefinieerd als dag 0 van differentiatie; Vervang het kweekmedium van de filters containing de RBEC met differentiatie media. Breng de RBEC filters in de putjes die de astrocyten. Onder deze omstandigheden in vitro modellen differentiëren en expressie-junction verwante eiwitten binnen 3 dagen.
  9. De modellen houden hun optimale differentiatie gedurende 3 dagen, tussen maandag en woensdag van de derde week.

Representative Results

Productie Protocol
Het protocol kan worden verdeeld in 3 fasen overeenstemmen met belangrijke veranderingen in kweekmedia samenstelling: (a) zuivering van endotheelcellen uit de microvaatjes, (b) proliferatie, en (c) differentiatie filters (12-well platen polyethyleen poriëngrootte 1 urn) in co-cultuur met astrocyten. De verschillende stappen van de productieprotocol werden toegewezen aan bepaalde dagen van de week, om de reproduceerbaarheid van de primaire celkweken (figuur 1) te verhogen. Op woensdag van de eerste week, dus 9 dagen vóór de oprichting van de co-cultuur systeem, de bloedvaten werden geïsoleerd (Figuur 2A). Om endotheelcellen te zuiveren, werden de kweken in aanwezigheid van afnemende concentraties van puromycine gedurende 5 dagen gehouden. Meest vervuilende cellen (voornamelijk pericytes) werden geëlimineerd en de groei van endotheelcellen was trager zonder wijziging van hun fenotype. Spindel-shaped cellen groeien uit de capillaire fragmenten geïsoleerd uit rattenhersenen grijze stof (Figuur 2B). Op maandag van de tweede week werden astrocyten rat uitgeplaat op de onderkant van 12-well platen. Woensdag RBEC toegevoegd aan het luminale compartiment van de filters. Hoge dichtheid zaaien op 160 x 10 3 cellen / cm 2 (figuur 2C) helpt openingen aan de omtrek van het filter (figuur 2D) te vermijden en genereert een homogene differentiatie van endotheelcellen monolaag. De cellen vertonen de typische langgerekte spoelvormige morfologie, uitlijnen lengterichting, en vormen een uniform monolaag. Donderdag, astrocyten kweekmedium werd veranderd voor de differentiatie medium geconditioneerd met de vorige co-cultuur media (figuur 2E). Vrijdag, RBEC op filters werden gekweekt in kweekmedium dat 500 nM hydrocortison en de filters werden overgebracht naar 12-well platen met de astrocyten. Op de derde week experimenten were uitgevoerd tussen maandag en woensdag.

RBEC Karakterisering en bepalende elementen van de monolaag Permeability
De RBEC werden gekenmerkt door immunokleuring van endotheliale en BBB markers en door metingen van TEER, permeabiliteit van LY en functionaliteit van transporters zoals P-gp.

RBEC verkregen door de puromycine zuiveringswerkwijze (Figuur 1 en 2) groeiden in niet-overlappende continue monolagen die groeiremming tentoongesteld in samenloop en weergegeven strak apposed, spoelvormig en spoelvormige morfologie. RBEC culturen uitgedrukt typische merkers van endotheliale cellen: ze toonden positieve immunostaining voor bloedplaatjes endotheliale cel adhesie molecuul (figuur 3A; CD31/PECAM) en expressie van von Willebrand factor (Figuur 3B). Zonder puromycine behandeling worden RBECs snel binnengevallen door pericytes gedetecteerd door desmin immunoshandhaven (figuur 3C). Gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) door astrocyten (Figuur 3D) uitgedrukt is een belangrijke differentiatie marker van astrocyten. Met een hoge passage nummer, astrocyten verliezen hun vermogen om differentiatie van endotheelcellen induceren. Daarom werden astrocyten gestandaardiseerd voor het tijdstip van cultuur en slechts onderging een passage.

Kweken RBEC met medium aangevuld met hydrocortison, gevolgd door co-cultuur met astrocyten en geconditioneerd medium uit de onderste compartiment van eerdere co-kweken tot sterke inductie van interendotheliale TJs in vergelijking met alleen gekweekt RBEC. De cellen brachten claudin-5, ZO-1 en occludin eiwitten die zijn gelokaliseerd in de cel-cel contacten, zoals getoond door immunofluorescentie (Figuur 4B-D) en onthuld door Western blot analyse voor ZO-1 en occludin eiwitten (Figuur 4E ). De morfologische distributie op cell-cel contacten een rits-achtige configuratie geeft (a) de dichtheid van de monolaag, (b) het cerebrale oorsprong van capillaire endotheelcellen, en (c) is kenmerkend zeer gedifferentieerde cerebrale endotheelcellen. Paracellulaire permeabiliteit van de endotheliale laag werd gevolgd door meting van de TEER en de snelheid van instroom van LY (457 Da) vanaf het bovenste naar het onderste compartiment van de filters. TEER werd gemeten met behulp van een ENDOHM-12 voor 12 mm cultuur kopjes aangesloten op een EVOM voltohmmeter. De TEER van hersenen endotheliale monolagen, met vermelding van de dichtheid van TJs bereikt 300 ohm · cm 2 gemiddeld (filters van 12 well platen, gegevens niet getoond). De Pe voor LY (Pe (LY), gebruikt als een integriteit controle van de barrière en co-geïncubeerd met geteste verbindingen) bereikte een gemiddelde van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (Figuur 4F) gedurende 1 jaar.

Om ontsteking van RBEC induceren gebruikten we de pro-inflammatoir cytokine TNF-α in 5 ng / ml gedurende 24 uur en vervolgens de ontstekingsreactie door het meten CCL2 (MCP-1) afscheiding van RBEC in het bovenste compartiment van het kweeksysteem die verdubbeld van 120 ng / ml (niet- behandelde controle) tot 250 ng / ml (Figuur 5A). TNF-α behandeling bij 5 ng / ml of 50 ng / ml gedurende 24 uur opende ook de BBB zoals blijkt uit Pe (LY) gemeten (figuur 5B).

P-gp is in gedifferentieerde RBEC gevisualiseerd door immunocytochemie (figuur 6A). P-gp lokalisatie bekend is sterk gepolariseerd zijn en in wezen langs de apicale membraan van endotheelcellen 44 terwijl de glutamaat-transporter 1 (GLT-1) wordt voornamelijk in de basolaterale fractie 45. Voorzover polarisatierichting van onze gekweekte RBEC beoordelen, werden apicale en basolaterale eiwitten gescheiden plasmamembraan preparaten middels sucrose dichtheidsgradiënten 46. Western blot analyse werduitgevoerd om expressie van P-gp en GLT-1 in plasma, apicale en basale membraan preparaten te beoordelen. Microvaatjes vers gewonnen uit rattenhersenen werden gebruikt als positieve controles dichtst bij de in vivo distributie van deze eiwitten (Figuur 6B). Zowel microvaatjes en gedifferentieerde RBEC membraanpreparaten, werd P-gp uitgedrukt als een band van 170 kDa, hoofdzakelijk gelokaliseerd in het apicale membraan fractie F1 (figuur 6B, C). GLT-1 expressie werd inderdaad uitgedrukt in de F3 basale membraan fractie van kleine bloedvaten als een band van 65-70 kDa, maar was niet in de gekweekte RBEC gedetecteerd.

Parallel experimenten, de functionele activiteit van P-gp in de endotheelcellen monolaag werd getest met rhodamine 123 (R123) als ligand. De abluminale om intraluminaal (B naar A) efflux van R123 was 1,7 keer hoger dan in de tegengestelde richting (figuur 6D). P-gp betrokkenheid te bewijzen, we gebruikten specifieke P-gp remmers, verapamil (25 uM, 30 min preïncubatie) en cyclosporine A (1 M, 30 min. preïncubatie). Met verapamil en cyclosporine behandeling werd R123 accumulatie in RBEC steeg met 1,6 maal en 2 maal respectievelijk in vergelijking met onbehandelde controle (figuur 6E).

Receptoren betrokken bij receptor-gemedieerde transcytose (RMT) Mechanismen
Het model werd verder gekarakteriseerd voor expressie van verschillende receptoren mogelijk betrokken bij transcytose mechanismen op BBB, zoals LRP1, LDLR of TfR (figuur 7A).

Functioneel transport studies werden uitgevoerd met de liganden voor TfR en LDLR. Leven RBEC werden geïncubeerd met ratten transferrine gelabeld met CY3 (Tf-Cy3) gedurende 180 min bij 37 ° C (Figuur 7B, C). Kwantificering van Tf-Cy3 opname en transport in de rat in vitro BBB model bleek dat de helling van de curven licht af dan 2400 picomols (figuur 7B), wat suggereert dat de binding / opname was verzadigbaar. Bovendien, de verzadiging van de binding / opname werd gecorreleerd met de accumulatie van Tf in het onderste compartiment. Om deze waarneming te bevestigen, werd Tf-Cy3 geïncubeerd bij 1200 picomol (stijgend deel van de curve) met een overmaat van niet-fluorescerende Tf 4.800 picomol (plateau / verzadiging) (Figuur 7C). Deze experimenten toonden een daling van Tf-Cy3 ophoping in het onderste compartiment en bevestigde een verzadigbaar mechanisme typisch van ligand-receptor interacties in onze in vitro BBB-model.

Evenzo werd LDLR functionaliteit aangetoond door de opname en het transport van de ligand DiILDL in de endotheelcellen monolaag (figuur 7D, E). Levende RBEC werden geïncubeerd met DiILDL gedurende 30 minuten bij 37 ° C. De binding / opname was niet gecorreleerd met de accumulatie van DiILDL in het onderste compartiment (figuur 7D). Kwantificering van diilDL transport bleek dat de helling van de curven af ​​na 2 ug, suggereert dat transport was verzadigbaar en receptor-gerelateerde in ons model. Natriumazide werd toegevoegd bij 0,05%, 15 min voor DiILDL incubatie (Figuur 7E). De afwezigheid van toxiciteit natriumazide incubatie bij 0,05% werd beoordeeld door Pe (LY) gemeten (data niet getoond). Deze experimenten toonden verminderde DiILDL accumulatie in het onderste compartiment. Over het algemeen, onze resultaten suggereren RMT voor DiILDL in onze in vitro BBB-model.

Andere In Vitro BBB modellen gebaseerd op endotheelcellen van Rat ruggenmerg of de hersenen van muizen
Enzymatische digestie met een mengsel van collagenase / dispase is een van de belangrijkste parameters te controleren inzake levensvatbaarheid cel en productieopbrengst van cerebrale microvaten. De enzymconcentratie belangrijker de verhouding tussen de hoeveelheid enzym ten opzichte van weefsel, nEEDS nauwkeurig gekalibreerd te worden tussen de hersenen van de rat, rat ruggenmerg en muizen hersenen. Microvaatjes zaaien dichtheid en het aantal endotheelcellen tot 90% confluentie (9 dagen na zaaien microvaatje) bereikt werden gekoppeld en zijn belangrijke parameters celgroei verbeteren, beperken het aantal populatie verdubbeling en de kwaliteit van de modellen. Rat ruggenmerg microvaatjes werden geproduceerd met hetzelfde protocol als die hierin zijn beschreven voor rattenhersenen microvaatjes (qua hoeveelheid weefsel, 2 ruggenmerg die ongeveer 1 hersenen) dezelfde hoeveelheid cellen per T75 fles vinden binnen hetzelfde tijdsbestek . Hersenvliezen van 5 weken oude C57Bl6 muizen hersenen waren moeilijk te elimineren, omdat ze vasthouden aan de cortex. Een korte behandeling van de hersenen met Dispase lijkt verwijdering van de hersenvliezen vergemakkelijken. De belangrijkste parameters die bijdragen aan de productie van reproduceerbare endotheel monolagen van rattenhersenen, ratten ruggenmerg en muizenhersenen worden gemarkeerd en samengevat inFiguur 8.

Figuur 1
Figuur 1. Stroomdiagram waarin de belangrijkste stappen van de in vitro BBB modelvoorbereiding. De verschillende stappen van de productieprotocol werden toegewezen aan bepaalde dagen van de week, om de reproduceerbaarheid van de primaire endotheliale celculturen verhogen. Het protocol start op woensdag van de eerste week, met microvessel productie van 5 weken oude Wistarratten.

Figuur 2
Figuur 2. Fase contrast microfoto van RBEC, astrocyten en de co-cultuur systeem. (A) 5 weken oude Wistar ratten microvaatje fragmenten op het moment van uitplaten.(B) Drie dagen oude RBEC culturen behandeld werden gedurende 2 dagen met de P-gp substraat puromycine op 4 ug / ml. (C) Pure samenvloeiing endotheliale monolagen op dag 1 na laag op het Millipore filters van een 12 wells plaat bekleed met collageen type IV en fibronectine. (D) Homogeniteit van de cel monolaag aan de omtrek van het inzetstuk filter. (E) astrocyten confluente cultuur op de dag van vestiging van de co-kweek geeft kenmerk honingraat morfologie. (V) Schema die de co-cultuur systeem lokalisatie van de microfoto in C, D en E.

Figuur 3
Figuur 3. Karakterisering van RBEC culturen door immunofluorescentie microscopie. (A) Brain endotheelcellen uiten bloedplaatjes endotheelcellenadhesiemolecuul PECAM/CD31 aan de celrand, (B) von Willebrand factor (VWF) vertoont een relatief gestippelde kleuring, helderder en geaggregeerde in sommige cellen dan andere, en geconcentreerd in het perinucleaire gebied. (C) zonder puromycine behandeling van RBEC culturen worden pericytes gedetecteerd met een positieve immunostaining voor desmine (in het groen) en hebben karakteristieke kleine ronde kernen. (D) Astrocytes uiten gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Immunocytochemische karakterisatie van de rat in vitro BBB model en de paracellulaire permeabiliteit vanLY over de endotheliale monolaag. De cel monolaag werd immunologisch gekleurd met (A) vimentin een confluente hersenen endotheelcellen monolaag met niet-overlappende morfologie en typische spoelvormige cellen met endotheliale morfologie en expressie van tight junction eiwitten tonen (B) claudin-5 , (C) ZO-1 en (D) occludin, ook gedetecteerd door Western blot van ZO-1 en occludin eiwitten (E). (F) Eenlaags beklemming op de 12-well BBB model werd beoordeeld door het meten van het transport van lucifer geel (LY-CH, dilithiumzout), een klein hydrofiel molecuul (MW 457 Da) bekend te worden bewaard door de BBB. Kort LY werd geïncubeerd in het bovenste compartiment van het kweeksysteem in contact met cerebrale endotheelcellen gedurende 60 min bij 37 ° C. Na deze tijd werd het medium van het onderste compartiment verzameld en fluorescentie werd gekwantificeerd door fluorimetrische analyse met een spectrofluorimeter met excitatie bij 430 nm en emissie bij 535 nm. De resultaten worden uitgedrukt in permeabiliteit en Pe in 10 -3 cm / min. De barrière wordt beschouwd doorlaatbaar of open toen de Pe van LY is boven 0.6x10 -3 cm / min. Tijdens elke 1 uur experiment werd de gemiddelde ontruimd volume versus tijd en de helling geschat door lineaire regressieanalyse uitgezet. De helling van de curve voor goedkeuring control filters met collageen type IV-fibronectine coating werd aangeduid PSF en de helling van de curve goedkeuring filters met hersenen endotheelcel monolagen werd aangeduid PSt. De PS waarde voor de endotheliale monolaag (PSE) werd berekend uit: Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Vergelijking 1

De PSE waarden werden gedeeld door het oppervlak van het pous membraan (1,1 cm 2 voor Millipore filters van 12-well platen) en het resultaat was de permeabiliteit coëfficiënt (Pe) met een gemiddelde van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. De resultaten worden gepresenteerd met een verticale scatterplot vertegenwoordiging voor n = 90 assays (gemiddelde van n = 3 naar n = 6 monolagen per test).

Figuur 5
Figuur 5. In vitro BBB model respons op behandeling met de pro-ontstekingsmiddel TNF-α. Het kweekmedium uit het kweeksysteem werd vervangen net voor TNF-α behandeling bij 5 ng / ml in het bovenste compartiment 6 uur, 12 uur en 24 uur. CCL2 afgifte door RBEC werd gekwantificeerd in het bovenste compartiment in ELISA in vergelijking met niet-behandelde controle. Merk op dat MCP-1 te verhogen licht als functie van de tijdZelfs in de niet-behandelde putjes. Integriteit van de endotheelcellen barrière gemeten endotheliale Pe voor LY Pe (LY) onthulde een toename monolaag permeabiliteit door 24 uur behandeling met TNF-α in 5 ng / ml of 50 ng / ml in het bereik van 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min en 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min respectievelijk in vergelijking met controle op 0,33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (Student's t-test, p <0,05).

Figuur 6
Figuur 6. Functionaliteit van het P-gp effluxtransporter en RBEC polarisatie. Expressie van de efflux transporter P-gp in de hersenen endotheelcellen samen gekweekt met astrocyten door immunocytochemie (A) en western blot (B & C). Celmembraaneiwitten werden geëxtraheerd met een cellulair eiwit fractioneringtie kit. Plasma membranen werden verkregen door hypotone lysis en differentieel centrifugeren om organellen en kernen te elimineren. Scheiding van apicale en basolaterale eiwitten uit plasma membranen werden verkregen door sucrose dichtheid. P-gp is hoofdzakelijk gelokaliseerd in het apicale fractie (F1), terwijl glutamaat transporter-1 (GLT-1) voornamelijk werd gelokaliseerd in de basolaterale fractie (F3). Gezuiverd microvaatjes vóór plateren werden gebruikt als controle voor de in vivo lokalisatie van deze eiwitten. De activiteit van P-gp werd bepaald door het transport polariteit van R123, een P-gp ligand. De flux van 1 uM R123 gemeten gedurende 1 uur bij 37 ° C in de luminale naar abluminale (A naar B) en in de tegenovergestelde abluminale naar luminale (B naar A) richtingen. Hetzelfde experiment werd uitgevoerd zonder RBEC passieve diffusie over de inzetfilter beoordelen en de gegevens werden genormaliseerd ten opzichte van deze waarde Pe (R123) berekening (zie figuur 5 (R123) (A naar B). Verapamil (25 uM, 30 min voorincubatie) en cyclosporine A (1 uM, 30 min voorincubatie) werden als referentie P-gp remmers. R123 accumulatie in RBEC werd gemeten na 2 uur met of zonder pre-incubatie met de P-gp remmers (Student's t-test, p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. Karakterisering van receptoren die deze receptor bemiddelde Transcytosis (RMT). (A) Het gedifferentieerde RBEC monolaag werd immunologisch gekleurd met antilichamen tegen de lage dichtheid lipoproteine ​​receptor gerelateerd 1 (LRP1) en de LDL receptor (LDLR). Confocale beeld van RBEC gesondeerd voor opname van DiILDL, een fluorescerend ligand van de LDLR en voor de opname van de rat transferrine-Cy3, een fluorescerend ligand van de TfR tonen puntvormige kleuring op het celoppervlak, met enkele clustering in de perinucleaire regio. (B) rat Tf-Cy3 werd toegevoegd aan het bovenste compartiment bevattende de gesplitste RBEC monolaag bij 75, 150, 300, 600, 1.200, 2.400 en 4.800 picomol / inzetstuk voor 180 minuten bij 37 ° C (200 pi in het bovenste compartiment en 1.200 uL in het onderste compartiment). Hierna werd Cy3 fluorescentie in het cellysaat (200 pi PBS 0,1% Triton X100) en in het onderste compartiment gekwantificeerd met fluorimetrische analyse met een spectrofluorimeter met excitatie bij 550 nm en emissie bij 570 nm. Fluorescentie-eenheden werden getransformeerd in picomol middels een lineair werkbereik. (C) voor verzadigingsexperimenten werd rat Tf-Cy3 toegevoegd aan het bovenste compartiment bevattende de gesplitste RBEC monolaag op 1200 picomol / inzetstuk voor 180 minuten bij 37 ° C met of zonder 15 min pre-incubatie met 4800 picomol / insert van niet-fluorescerende Tf. Het transport in het onderste compartiment werd gekwantificeerd zoals in (B) (Student's t-test, p <0,05). (D) DiILDL werd toegevoegd aan het bovenste compartiment bevattende de gesplitste RBEC monolaag op 1, 2, 4 en 8 ug / insert filters gedurende 30 min bij 37 ° C (200 ul in het bovenste compartiment en 1200 pl in het onderste compartiment). Hierna werd Dil-fluorescentie in het cellysaat (200 pi PBS 0,1% Triton X100) en in het onderste compartiment gekwantificeerd met fluorimetrische analyse met een spectrofluorimeter met excitatie bij 554 nm en emissie bij 571 nm. TLcentie eenheden werden getransformeerd in ug middels een lineair werkbereik. (E) Voor transport blokkerende experimenten werd natriumazide toegevoegd 0,05% 15 min vóór de incubatie van DiILDL bij 2 ug / plaats gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Het transport in het onderste compartiment werd gekwantificeerd zoals in (D) (Student's t-test, p <0,05). De afwezigheid van toxiciteit van natrium azide incubatie bij 0,05% werd vastgesteld door Pe (LY) meting (gegevens niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8. In vitro BBB-modellen uit de rat ruggenmerg endotheelcellen of uit de hersenen van muizen. Tabel hooglichten belangrijke parameters voor microvat extractie uit rattenhersenen, rat ruggenmerg en de hersenen van muizen. Microfoto tonen immunostaining voor ZO1 en occludin in endotheliale celmonolagen bereid uit hersenen van de rat, rat ruggenmerg en de hersenen van muizen.

Discussion

We beschrijven de implementatie van een wekelijkse reproduceerbare protocol voor de isolatie en beplating van de hersenen haarvaten, na zuivering en de cultuur van RBEC en verder opzetten van co-cultuur met primaire astrocyten rat aan een in vitro BBB model met karakteristieke BBB eigenschappen genereren.

Succesvol vaststellen van gestandaardiseerde in vitro kweken BBB vereist optimale omstandigheden in de verschillende opeenvolgende stappen van het proces. Het model werd (a) geoptimaliseerd voor de laagste paracellulaire permeabiliteit, die de "heilige graal" van in vitro BBB-modellen blijft, en (b) gevalideerd voor efflux en RMT mechanismen te verkrijgen.

Productie, zuivering en verspreiding van RBEC

De grootste uitdaging bij het kweken RBEC is om reproduceerbaarheid tussen verschillende culturen te bereiken. Standaardisatie van het protocol vereist hoogwaardige gereedschappen voor dissectie, hoge kwaliteit reagentia en respect van reagens vervaldata. De experimentator moet worden bedreven in micro-dissectie onder stereomicroscoop voor snelle verwijdering van hersenvliezen en grote schepen uit de cortex oppervlak. Zodra de hersenen geïsoleerd en mechanisch gedissocieerd een van de belangrijkste uitdagingen is de optimale enzymatische vertering van de vers geïsoleerde hersenen microvaatjes. Het type en de kwaliteit van de gebruikte enzymen kritisch. Een mix van collagenase type I en II en dispase in hoge concentratie met lage variabiliteit tussen batches gebruikt. Ook van belang zijn de duur van de enzymatische digestie en de verhouding tussen enzymconcentratie / weefsel gewicht / volume van de spijsvertering. De beste opbrengst van hersenen microvaatje productie werd verkregen met het equivalent van 1 cortex van de hersenen in 1 ml collagenase / dispase mengsel bij 60 ug / ml in beide ontsluitingen, respectievelijk 30 min en 1 uur.

Ook kritisch is de eliminatie van contaminerende cellens (astrocyten en vooral pericyten). Deze cellen vermenigvuldigen bij een hogere snelheid dan endotheelcellen en geen krappe kruispunten niet vast te stellen met de laatste, waardoor het voorkomen van de opbouw van een homogene cel monolaag met goede paracellulaire restrictiviteit. Aangezien hersenen endotheelcellen tot expressie veel hogere efflux pomp, vooral P-gp, vergeleken met de andere celtypes in microvaatjes zij beter tolereren anders toxische concentraties van P-gp ligand drugs, terwijl niet-endotheelcellen worden geëlimineerd. Puromycine behandeling bij 4 ug / ml voor de eerste twee dagen werd gevolgd door twee dagen bij 2 ug / ml endotheelcel goede zuiverheid te verkrijgen. Deze selectie kan ook voorstander van capillaire endotheelcellen versus die van venulen, precapillaire arteriolen of grotere bloedvaten, en leiden tot strengere monolagen. Bovendien, het gebruik van slechte plasma afgeleide runderserum een noodzakelijk om zuivere kweken van endotheelcellen 47,48 verkrijgen. De plasma-derived serum mist bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF), dat mitogeen voor fibroblasten voor gladde spiercellen en derhalve pericyten.

We vonden dat behandeling van kunststof en filters met een combinatie van collageen type IV van muizen en humaan fibronectine levert een belangrijk voordeel, met een 2-voudige toename van de proliferatie opbrengst in vergelijking met de traditioneel aanbevolen collageen type I uit rattenstaart. Belangrijke aanwijzingen voor celproliferatie werden door de extracellulaire matrix zoals integrine en groeifactor (bFGF) activering 49. Buffer concentratie en pH van het kweekmedium zijn beschreven positief effect hebben op paracellulaire dichtheid 50 en observeerden we een betere reproduceerbaarheid tussen culturen aangevuld met HEPES buffer bij 5 mM.

Differentiatie van RBEC: Co-cultuur Vestiging op Filters Insert

Zodra hersenen endotheliale cellen bEEN gezuiverd en hebben zich verspreid voor 6 dagen, kunnen ze worden uitgeplaat op filters. Cel plating bij hoge dichtheid is van cruciaal belang om een ​​perfecte monolaag verkrijgen. Een zaaien dichtheid van 160x10 3 cellen per 12 wells plaat filters noodzakelijk en voldoende was om een confluente monolaag 24 uur na het uitzaaien verkrijgen. Echter, isolatie van primaire hersentumoren capillaire endotheelcellen uit hun omgeving is paradoxaal in de bouw van een BBB in vitro model zoals bekend is dat primaire cellen, met name de hersenen capillaire endotheelcellen, sterk gereguleerd door de omgeving en inductieve factoren door de verschillende omringende celtypen. Brain capillaire endotheelcellen alleen gekweekt snel de-differentiëren en verliest wat specifieke hersengebieden endotheliale markers. Daarom moet primaire endotheelcellen worden bij lage doorgang (P1) en opnieuw aangesloten, althans gedeeltelijk, met de omgeving door co-cultuur met astrocyten of medium geconditioneerd door astrocyten 47,51. Dit geldtgeldt voor astrocyten differentiatie hersenen endotheelcellen en astrocyten zijn betrokken bij twee-weg inductie. Kweken RBEC met astrocyten geleid tot een sterke inductie van interendotheliale TJ 52,23. De moleculaire mechanismen van herinductietherapie blijven grotendeels onbekend en onderzoek gaande in verschillende laboratoria specifieke modulerende factoren afgescheiden door astrocyten, zodat optimale endotheelcel differentiatie 53,54 kunnen bevorderen identificeren. Factoren uitgescheiden door de hersenen endotheelcellen waaronder leukemie inhiberende factor (LIF) is aangetoond astrocytaire 55,56 differentiatie induceren. Voordat co-cultuur vestiging, werden astrocyten blootgesteld aan differentiatie medium dat de glucocorticoïdereceptoragonist hydrocortison, en co-cultuur geconditioneerd medium. Hydrocortison is bekend dat de dichtheid van hersenen endotheelcellen verbeteren en wordt gebruikt BBB modellen bijzonder van 57 ratten en muizen 58,59 endotheelcellen. De geconditioneerde medium wordt na 3 dagen verzameld uit de onderste compartiment van de endotheelcellen / astrocyten co-cultuur systeem en voor later gebruik bevroren. Het gebruik van co-cultuur geconditioneerd medium verminderde de tijd van endotheliale celdifferentiatie tot 3 dagen met een optimale paracellulaire permeabiliteit voor 2 dagen en ook verbeterd reproduceerbaarheid tussen culturen.

Kortom, het protocol beschrijven we levert een reproduceerbare TEER dan 300 ohm-cm 2 en een gemiddelde paracellulaire permeabiliteit coëfficiënt Pe (LY) van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, vergelijkbaar met de beste primaire celgebaseerde BBB modellen 22, 12. Het protocol beschrijven we in dit manuscript met de voorgestelde modulatie van microvaatje enzymatische digestie kunnen worden uitgebreid aan endotheelcellen van de ratten ruggenmerg 60 en hersenen van muizen.

Moleculaire en functionele karakterisering

BovendienTJ inductie, astrocyten ook bijdragen aan de expressie van transporters zoals P-gp in de hersenen endotheelcellen 61. We zien inderdaad expressie van de efflux transporter P-gp in de BBB model en we tonen de polariteit van het P-gp efflux pomp localisatie middels biochemische benaderingen en P-gp activiteit met behulp van een functionele test. GLT-1 expressie werd gedetecteerd in de basale membraan fractie van microvaatjes, maar was niet in gekweekte RBEC gedetecteerd. Onze hypothese is dat GLT-1 down is geregeld in onze RBEC cultuur in vergelijking met de in vivo omstandigheden en dus niet gedetecteerd door western blot analyse. Overmaat glutamaat neurotoxisch en in vivo, GLT-1 is verantwoordelijk voor glutamaat efflux van het basale compartiment (parenchym) aan het apicale compartiment (bloedcirculatie). In astrocyten blijft GLT-1-expressie zeer laag en wordt geïnduceerd door de toevoeging van glutamaat in het medium 62,63.

We hebben ook confIRM de uitdrukking van instroom transporters op de apicale membraan zoals LRP1, LDLR en TfR. Functionaliteit van TfR en LDLR werd gedemonstreerd met binding en transport experimenten van Tf-Cy3 en DiLDL van de luminale naar de abluminale kant van de monolaag zoals eerder getoond met een rund in vitro BBB model 64. Interessant is aangetoond dat lipide behoefte van astrocyten verhoogt de expressie van LDLR op de hersenen capillaire endotheelcellen 65,66 verdere bevestiging van de fysiologische overspraak tussen astrocyten en de hersenen endotheelcellen, zoals in vitro. Wij hebben besloten om vervoer illustreren met fluorescerende kleurstoffen zoals als Cy3 en Dil gezien het feit dat spectrofluorimetrische analyse is beschikbaar in de meeste laboratoria, en kan nuttig zijn om te valideren in vitro BBB-modellen. Echter, kwantificering van fluorescentie is veel minder gevoelig dan radioactiviteit en vereist een toename van het aantal experimenten significante gegevens te verkrijgen.Idealiter Tf en LDL zijn gewoonlijk radioactief gemerkt (jodium 125) voor een dergelijke binding / opname en transport experimenten.

We tonen ook dat de gedifferentieerde endotheelcellen monolaag verkregen met de voorgestelde protocol aan ontsteking geïnduceerd door TNF-α, zoals blijkt uit CCL2 afgifte en BBB opening. CCL2 (MCP-1) en zijn receptor CCR2 betrokken bij CZS aandoeningen zoals multiple sclerose, experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) 67, CNS trauma 68 en staan ​​bekend als mediatoren van migratie van leukocyten in het CZS onder neuro-inflammatoire condities 69,70. Met de geteste protocol, kunnen we niet concluderen op een gepolariseerde secretie van CCL2 omdat BBB opening kan de CCL2 concentratie in evenwicht tussen beide bovenste (apicale) en lagere (basale) compartimenten. Daarom hebben we duidelijk onderschatten de hoeveelheid CCL2 door de RBEC in het apicale compartiment van 24 uur (Figuur 5A).

Algemeen Overzicht en Beperkingen van BBB in vitro modellen: I n Vivo versus In Vitro en knaagdieren versus Human Vergelijkingen

Veelbelovende CNS geneesmiddelen die effectief BBB passage in vitro bleek niet in klinische onderzoeken door een gebrek aan voorspelbaarheid van in vitro modellen BBB vaak gebaseerd op cellen geïsoleerd uit andere soorten dan menselijke. Aan het beste van onze kennis, de in vitro BBB modellen zijn waarschijnlijk meer voorspellend als het gaat om het bestuderen van mechanistische aspecten van eiwitnetwerken, signaaltransductie, transporters en receptoren. Elk mechanisme, pad of doel te worden bestudeerd in vitro te worden gekarakteriseerd voor de regulering van complementaire omgevingsfactoren (andere celtypes, chemicaliën, eiwitten) en gecombineerd om in situ studies met dezelfde diersoort, En indien mogelijk, met bloedvaten en endotheelcellen geïsoleerd van de mens, met de beperkingen en voorzichtigheid opgeroepen hieronder.

In vitro BBB-modellen moeten worden gezien als autonome systemen, geïsoleerd uit het lichaam van regelgeving, maar toch begiftigd met grote in vivo eigenschappen en een potentieel voor regulering door omgevingsfactoren. Nee "ideaal" in vitro BBB model wordt nog voorgesteld 71,72,73 omdat de endotheelcel monolagen missen een aantal belangrijke onderdelen van de neuro-vasculaire glia eenheid (NGVU) en worden geïsoleerd uit bloed en lichaamsvloeistoffen regelgeving. Het ontbreken van pericyten 74,16 17,18 neuronen of de verschillende bestanddelen van de extracellulaire matrix voor kunststofbekleding of het kweekmedium en serum voor celgroei in de meest voorkomende en "gemakkelijkst gemaakt" in vitro BBB modellen gebaseerd op endotheliale gedifferentieerde cellen met astrocyten kan eiwitexpressie i modulerenn vergelijking met de in vivo situatie 75. Deze modellen kunnen veel transporters in vivo uit te drukken, maar niet allemaal. In sommige gevallen werden transportparameters eerst gecontroleerd in geïsoleerde bloedvaten (het dichtst bij de in vivo situatie), en vervolgens onderzocht in celkweek systemen 76,61.

Moleculair biologisch onderzoek heeft geleid tot de karakterisering van gen-en eiwitexpressie in geïsoleerde bloedvaten en lage passage endotheliale celculturen van dezelfde soort, en tussen verschillende soorten, meestal van kleine dieren zoals knaagdieren (muizen en ratten) of van koe en varken in vergelijking mens 77,78,75,15. Transcriptoom vergelijking van in vivo en in vitro hersenen microvasculaire endotheelcellen liet talrijke gen transcripten die differentieel tot expressie werden gebracht en meestal aanzienlijk downregulated in vitro. Transcripten coderend instroom vervoerders zoals TfR en proteins betrokken bij blaasje mensenhandel worden voornamelijk downregulated in gekweekte hersenen endotheelcellen, hetgeen duidt op een algemene daling van de endocytose en vesiculair transport in dergelijke cellen. Cultuur manipulatie in termen van zuiverheid (puromycine behandeling) en behandeling met hydrocortison kan helpen om een meer "in vivo-achtige" genexpressieprofiel 77 herstellen. Transcriptomic studies bleek ook belangrijke verschillen tussen soorten die voorspellingen over drugs-opname verder te compliceren bij de mens op basis van knaagdieren in vitro BBB-modellen 75. In vitro BBB-modellen met co-cultuur van humane endotheelcellen en astrocyten zijn beschreven 15. Weliswaar relevant, deze modellen zijn moeilijker uit te voeren op regelmatige basis als ze dat gereglementeerde toegang tot post-mortem menselijk weefsel en er is heterogeniteit in de kwaliteit / eigenschappen van de menselijke hersenen endotheelcellen afhankelijk van de leeftijd, ziekten, en mogelijk medische treatment van donoren. Inspanningen worden gedaan om nieuwe in vitro modellen die beter reproduceren fysiologische, anatomische en functionele kenmerken van de in vivo BBB ontwikkelen. Co-culturen waarbij drie-celtypen zijn zeer restrictief en lijken moeilijk te routinematig uitvoeren. Tot op heden de meest complexe in vitro BBB-modellen zijn de dynamische in vitro modellen (DIV-BBB) die vatachtige organisatie met astrocyten omvatten en beschikken over een stroom van medium dat de bloedstroom 75,79,80,81,82 nabootst, 83,84,85. Wanneer cerebrale endotheelcellen worden blootgesteld aan een stroom, de gegenereerde schuifspanning activeert mechanotransducers op het celoppervlak, die de expressie van verschillende genen betrokken bij endotheliale celfysiologie zoals celdeling, differentiatie, migratie en apoptose 80 moduleren. In vivo schuifspanning gegenereerd door de bloedstroom is verantwoordelijk voor mitotische arrestatie in de cel contact, dat de oprichting van een toelaatendotheelcellen monolaag in bloedvat 80. Genomics en proteomics analyse van normaal menselijk brein microvasculaire endotheelcellen toonde het effect van shear stress in BBB-endotheel fysiologie 84. Schuifspanning is verantwoordelijk voor celoverleving, een hogere endotheelcel adhesie, efflux pomp inductie en betere polarisatie van transporteurs 75, regulering van glucosemetabolisme 75,86, oxidatie gemedieerd door CYP450-enzymen 75 en de regulering van paracellulaire permeabiliteit door het verhogen van de expressie van genen die coderen voor intercellulaire junctionele elementen zoals occludin en ZO-1 87,75,80 en bijgevolg hoge TEER rond 1500 - 2000 ohm · cm 2, het dichtst bij bekende in vivo parameters 79,80

In de biotechnologie en farmaceutische industrie, routinematige screening van drugs of zelfs high throughput screening (HTS) en inspanningen om dierproeven te verminderen, leiddede ontwikkeling van verschillende cellijnen worden gebruikt ter vervanging van de primaire kweek van cerebrale endotheelcellen die moeilijker op te zetten routinematig blijven. In de meeste gevallen, werden primaire kweken van cerebrale endotheelcellen getransduceerd met een onsterfelijk makend gen (SV40 of polyomavirus groot T-antigeen of adenovirus E1A), door transfectie van plasmide DNA of door infectie met retrovirale vectoren 88,89,75. Verschillende endotheliale cellijnen van cerebrale oorsprong zijn ontwikkeld, zoals de RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs of rBCEC4 rat cellijnen 88,75, de b.End3 muis cellijn 90,75, de PBMEC/C1 - 2 varkens cellijn 87,75, en de hCMEC/D3 humane cellijn 89,75. Andere modellen gebaseerd op cellen van niet-cerebrale oorsprong zoals Madin-Darby hondennier (MDCK) of Caco2 cellijnen 12,75. Van de verschillende humane cerebrale endotheliale cellijnen is de hCMEC/D3 wijd aubd en verbeterd als een model van BBB sinds haar oprichting in 2005 91,92. Net als primaire culturen, cellijnen aanwezig voordelen en beperkingen. Ze zijn gemakkelijker te hanteren dan de primaire culturen, hebben een langere levensduur, zijn goed gekarakteriseerd en laat reproduceerbaarheid tussen grootschalige experimenten. Echter, cellijnen weefsel-specifieke functies verliest, verlies milieuregelgeving en het verwerven van een moleculaire fenotype heel anders uit cellen in vivo 75, 89. In het bijzonder, monolagen gegenereerd uit cellijnen huidige verlaagde dichtheid, lage TEER-en show transporter profiel variatie 75,89. Zo dierproeven of studies in primaire cellen zijn vaak de voorkeur, ondanks hun toegevoegde complexiteit.

Acknowledgments

Financiële steun aan VECT-HORUS wordt erkend van het Fonds Unique Interministeriel (FUI / MEDUL project) en vect-Horus en de UMR7259 laboratorium van het Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC en PREVENTAD samenwerkingsprojecten) . De UMR7259 laboratorium erkent ook financiële steun van het CNRS en van Aix-Marseille Universite.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22 (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34 (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85 (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316 (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8 (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119 (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42 (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259 (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53 (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110 (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56 (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324 (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283 (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206 (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55 (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10 (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6 (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10 (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74 (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22 (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73 (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311 (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73 (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224 (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12 (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6 (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13 (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21 (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200 (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97 (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018 (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19 (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37 (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15 (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126 (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138 (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15 (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5 (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6 (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40 (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17 (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8 (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14 (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339 (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8 (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12 (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. , (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49 (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 312-328 (2008).

Tags

Geneeskunde rattenhersenen endotheelcellen (RBEC) muis ruggenmerg tight junction (TJ) receptor-gemedieerde transport (RMT) low density lipoproteïne (LDL) LDLR transferrine TfR P-glycoproteïne (P -gp) transendotheliale elektrische weerstand (TEER),
Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molino, Y., Jabès, F.,… More

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter