Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ayarlama-up bir Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Abstract

Kan-beyin bariyeri (BBB), özellikle kan ve sinir dokusu arasında moleküler ve hücresel akışı düzenler. Amacımız, endotelyal hücre tek tabaka arasında transsitoz dahil reseptörleri incelemek için primer fare beyin endotel hücreleri (RBEC) eş-kültür ve astrositler üzerindeki BBB in vitro modelinin yüksek ölçüde tekrarlanabilir singeneik fare geliştirmek ve karakterize etmek olmuştur. Astrositler tripsin sindirim aşağıdaki mekanik disseksiyon yolu ile izole edildi ve daha sonra eş-kültür için dondurulmuştur. RBEC 5 haftalık sıçan korteks izole edilmiştir. Beyin Meninks ve beyaz maddeden temizlenmiş ve mekanik enzimatik sindirimi aşağıdaki ayrışmış edildi. Bundan sonra, doku homojenatı sinir dokusu damar parçalarını ayırmak için bovin serum albümin içinde santrifüjlenmiştir. Kap parçaları kendi hücre dışı matris olmadan endotel hücreleri için ikinci bir enzimatik sindirim uygulandı. Böyle perisitlerden gibi kalan kirlenmesine neden olan hücreleri f edildiurther puromisin içeren ortam içinde mikro damar kaplama parçalarını elimine edilir. Daha sonra kuyular altındaki yetiştirilen astrositler ile ko-kültür için filtreler üzerine geçirilmiştir. RBEC sıkı birleşme yüksek seviyelerini ifade okludin gibi (TJ) proteinleri, hücre sınırları tipik bir lokalizasyonu ile Claudin-5 ve ZO-1. TJs sıkılığını gösteren beyin endotelyal monotabakaların transendotelyal elektriksel direnci (TEER), 300 Ohm · ortalama cm 2 ulaştı. (LY) Lucifer sarı için endotel geçiş katsayıları (Pe) / dk 0.26 ± 0.11 x 10 cm -3 bir ortalama ile yüksek oranda tekrar oldu. Mono tabakaları düzenlenen beyin endotel hücreleri, akış taşıyıcı P-glikoprotein (P-gp) olarak ifade edilmiştir rodamin 123, P-gp için bir ligandın bir polarize taşıma gösterdi ve endotelyal hücre tek tabaka arasında transferrin-Cy3 ve DiILDL özel taşıma gösterdi. Sonuç olarak, bir in vitro kurmak için bir protokol sağlarNedeniyle kalite güvence yöntemleri son derece tekrarlanabilir olduğunu ve BBB nakliyecilere ve reseptörler üzerinde araştırma için uygun olan BBB modeli.

Introduction

Santral Sinir Sistemi (MSS) tedavisi için geliştirilen birçok ilaç bozuklukları tedavi ilgili konsantrasyonlarda beyin parankimi ulaşmak mümkün değildir. BBB patojenik ajanlar, plazma bileşimin dalgalanmadan beyin sinir dokuları korur, ve beyin 1 ve dışarı iyonları, peptidler, proteinler ve hatta hücre spesifik olmayan akı kısıtlayarak, beyin parankimasının homeostazı tutar.

BBB özellikleri nöronlar gibi özel bir sınıf mikrovasküler beyin endotel hücreleri ve nöro-glia-damar biriminin komşu elemanlar (NGVU) arasında iyi bir yakınlık ve çapraz konuşma ile indüklenen ve korunur, glial hücreleri (daha kesin astrosit sonuna m), perisitler ve kolajen tip IV, fibronektin, laminin ve proteoglikanlardan oluşan 2,3 esas bazal membran içinde ensheathed. Kılcal düzeyde endotel% 32 ve önemli bir oynar - perisitler yaklaşık 22 kapakendotel çoğalma, anjiyojenez ve enflamatuar süreçlerin düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Endotel hücreler, kılcal damarların iç yüzeyini kaplayan sürekli bir tabaka oluşturur. Bunlar, apikal bölgede bir kayış benzeri bir yapı oluşturmak ve bu kutuplaşma hücre katkı TJs, birbirine bağlanır. Astrositler BBB özelliklerini düzenlemek ve bu tür TGF-β, GDNF, bFGF ve IL-6 gibi önemli bir düzenleyici faktör kaynaklarıdır. Eksik işlevselliği ile GFAP'ye defıcient Astrositler BBB özelliklerini 4 düzenlemek mümkün değildir. Nöronlar doğrudan BBB oluşumuna yapısal olarak dahil değil, aynı zamanda protein ekspresyonu ve BBB fonksiyonları 5 yönlerini düzenleyen önemli değildir.

Ayrıca BBB yapısı, fizyolojisi ve patolojisi incelemek amacıyla, BBB in vitro modelleri araştırma aracı olarak da geliştirilmiştir. Beyin endotel hücreleri göre BBB vitro modellerde uygulamak için çeşitli türlerden ekstre edilmiştirsığır, 6,7 ikinci düşük geçiş primer kültürleri, 8,9 domuz, sıçan 10,11,12, 13 fare ve insan 14,15 on. Bu model in vivo BBB, taklit bilinmektedir özellikle sıçan veya fare ve / veya perisitlerin 16,12 ikinci glial hücreler ve / veya nöral projenitör hücre türetilmiş astrosit 17 ve / veya 18 nöronlar ile birlikte kültürlenmiştir. Bu in vitro / in vivo deneyler ve karşılaştırma ve / veya transgenik model 19 üretilen beyin endotel hücrelerinin çalışmaya izin verir, çünkü "laboratuar" modelleri genellikle kemirgenler üretilmektedir.

Yeni vitro BBB modellerde geliştirilen de önce in vivo test 15,20,21,3,6,22,11,23 potansiyel MSS ilaç adaylarının beyin alımını tahmin yardımcı olmak için tasarlanmıştır. In vitro BBB modeller genellikle karşılaştırmak için kullanılır CNS'ye i) bilinen ya da nüfuz l ile: ile ilaçların nakilBBB ve merkezi etkileri karşısında ow geçirgenliği, ve ii) aynı türün hayvan modellerinde ölçülen aynı ilaçların belirgin Pe. Kolayca BBB geçmek ilaçlar çoğunlukla lipofiliktir ve lipid-aracılı serbest difüzyon (kafein, karbamazepin, vb) tarafından beyin endotel hücre zarlarını. Böyle digoksin, verapamil veya siklosporin A gibi olumsuz taşınan ilaçlar aktif P-gp olarak beyin endotel efflux taşımacıları tarafından uzatılır. Bununla birlikte, yeni geliştirilmiş terapötik moleküllerin gibi pek çok bir araya getiren proteinler, siRNA'lar ya da monoklonal antikorlar gibi Biopharmaceuticals vardır. Belirli bir nakil i) yokluğunda ve paraselüler geçit geçiren, yüksek molekül ağırlıklı moleküllerin önlemek endotel hücreleri, ii) sıkıca paketlenmiş tabakasının: Çoğu nedeniyle BBB çapraz yoktur. Bu sınırlar ile, "Truva atı" stratejiler i, BBB bilinen reseptörlerine karşı vektörleri (antikorlar, peptidler) içeriyordu kullanılarak hayata geçirilmiştirn reseptörünün transferin (Tf) reseptörü (TfR), insülin reseptör (IR), veya LDL reseptör (LDLR) bağlantılı reseptör ailesi (LDLR, LRP1) üyeleri olarak ya da taşıma transsitoz (RMT), aracılık etmektedir. Bu reseptörler vivo 24,25 izole beyin kılcal ve BBB bulunmuştur. Bu reseptörler için transkripsiyonel profilleri, özellikle LDLR ailesinin olanlar, analiz ve co-kültürlenmiştir doğrudan beynin 26 kendi çekimi sonrası astrositler ile veya beyin kılcal beyin endotel hücreleri ve endotel hücrelerinin beyin arasında karşılaştırıldı. Pardridge 24 insülin alıcısının ve insülin büyüme faktörü reseptörü 27,28 karşı antikor, ardından transferrin reseptörü (TfR) karşı OX-26 antikoru ile alan açıldı. Bu antikor bazlı vektörlerle, ArmaGen Teknolojileri BBB 29 karşısında, proteinler de dahil olmak üzere, uyuşturucu sunmak için bir BBB moleküler Truva atı platformu teknolojisi geliştirdi.Literatür LRP1 beyin endotel hücreleri içinde ekspresyonu ve bir güçlü endositik / çöpçü reseptör olarak rolünü gösteren verileri açısından zengindir. Western blot analizi LRP1 beyin kılcal zenginleştirilmiş fraksiyon ve fare beyin kılcal endotel hücreleri 30 olarak ifade edilir olduğunu ileri sürdü. Böyle BBB 31 karşısında etkili ilaç akını teşvik aprotinine türetilmiş peptid vektörleri ile Angiochem hedef LRP1 gibi şirketler. Ancak, LRP1 ayrıca aktif Aβ taşınması ve beyin parankiminde kan 32 onun effluks / boşluk yer almaktadır. Bu veriler ligandlarına bağlı olarak BBB arasında çift yönlü bir taşıma LRP1 içerir. biOasis Vect-HORUS LDLR 34 hedef peptid vektörleri geliştirir iken böyle BBB 33 genelinde lizozomal enzimler ve antikorlar gibi biyolojik maddelerin taşınması için bir protein melanotransferrin kullanarak Transcend teknolojisini geliştirir. Veriler LRP ve LDLR diff taşımak için kullanılabileceğini düşündüren varBu tür BBB 37 arasında lizozomal enzimlerin 35,36 veya nanopartikül kompleksleri gibi erent moleküller.

Ilgi alanımız vektörü moleküllerini ve merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisi için vectorized ilaç adayları kullanılarak merkezi sinir sistemine ilaç teslim edilir. Özellikle, BBB boyunca ilaç verme nöroenflamasyonun, kendi ölçüde değişebilir bir süreç bağlamında dikkate alınması gereken, ancak bu ensefalit, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı vs dahil olmak üzere, nöroenflamasyon, muhtemelen tüm merkezi sinir sistemi hastalıkları ve lezyonlar yaygındır paraselüler ve hücre üzerinden taşıma patolojik koşullarda 38,39,40,41,42,43 amplifiye edilebilir dikkate BBB fizyoloji ve geçirgenliği değişikliklerle BBB enflamasyon ile ve potansiyel olarak ilişkilidir. Örneğin, TNF-α, TWEAK ve diğer sitokinler inflamasyon modüle eden ve in vitro modellerle BBB deneyler bu th paraselüler özelliklerini değiştirmek göstermiştire endotelyal hücre tek tabaka 38,39,40 ve TNF-α de LDL 41 transsellüler taşınmasında bir artışa yol açar, 42 ve 43 laktoferrin holotransferrin.

Amacımız geliştirmek ve karakterize etmek için optimize edilmiş olan bir ve yüksek oranda çoğaltılabilir sinjeneik fare modeli BBB primer beyin endotel hücreleri ve astrositler ko-kültürler kullanılmıştır. Biz ise beyin endotelyal hücre üretimi ve astrocyte üretim için 5 haftalık ve yenidoğan Wistar sıçanlar kullanıldı. Bir meydan okuma "haftalık tekrarlanabilir" BBB modellerinin üretimini sağlayan bir protokol kurmak oldu. Bu amaca ulaşmak için, üretim protokolün her adım ilk hafta Çarşamba günü beyin mikrovasküler üretimden başlayarak, haftanın belirli günlerindeki yapıldı. Diseksiyonlar son 3 yıl boyunca neredeyse her hafta yapıldı. Ayrıca kültürlerin tekrarlanabilirliğinin geliştirmek için, bir kalite güvence sistemi kuruldu. Tüm Reagents ve kimyasal bir veritabanı (giriş tarihi, stok, son terim, vb) başvurulan edildi.

Bu model, bu gibi endotelyal hücre organizasyonu ve saflık gibi bir dizi kriter, aşağıdaki karakterize edildi, TEER, LY geçirgenlik, pro-enflamatuar maddeler, TJ proteinlerin nitel ve nicel ifade, P-gp olarak akış taşıyıcıları işlevselliği ve reseptörlerine müdahale gibi TfR veya LDLR gibi endotel hücre tekli katmanı üzerinde transsitoz katılan.

Protocol

Sıçan Astrositler 1. Üretimi

Her hazırlık iki cinsiyetten 10 yenidoğan Wistar sıçanları kullanın.

  1. Bir makas ile kesme kafası ve bir laminer akış kaputu altında kuru bir Petri kabındaki hemen onları aktarmak tarafından fareleri kurban. Beyincik olmayan kafatası beyin çıkarın ve soğuk diseksiyon tampon içeren bir Petri kutusu içine hemen transfer: HBSS% 1 Sığır Serum Albümini (BSA endotoksin düşük seviyesi), 100 ug / ml penisilin 100 birim / mL ve streptomisin ile takviye edilmiştir.
  2. 2 hemisferdeki ayrı ve buz üzerinde diseksiyon tamponu ile temiz bir petri içine aktarmak için, onları yarısında beyinleri kesin. Optik sinir kesmek ve bir stereo mikroskop altında meninks çıkarın.
  3. Soğuk diseksiyon tamponu, 50 ml yaygın kortikal parçaları yıkayın.
  4. 15 ml Falcon tüp içine 3 beyinlerinden kortikal parçaları yerleştirin ve yukarı pipetleme ve bir darbe aşağı ayırmakEDTA, 5 dakika için% 0.02 'den 37 ° C - le,% 0.05 tripsin 6 ml mavi bir ucu ile donatılmış 10 ml'lik bir pipet ile birkaç kez
  5. 24,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM ilave edildi ve aşağıdaki antibiyotikler, penisilin 100 birim / mL ve streptomisin 100 ug / ml, glial hücre ortamı (GCM) adlı bir ortam, ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ekleyin. FBS toplu astrosit cutures büyümesi ve hayatta kalma için seçilmiş ve doğrulanmıştır.
  6. , 75 cm 2 T-şişeye (T75) içine 10 mi GCM ve plaka içindeki ayrışmış hücreleri içeren pelet yeniden süspanse edin. Hücre artıkları ve DNA kaldırmak için aşağıdaki gün orta değiştirin. Bir haftada iki kez kültür ortamı değiştirin.
  7. Çoğalma 1 hafta sonra, yavaşça GCM 37 ° C'de 24 saat boyunca 60 rpm'de bir orbital çalkalayıcı ile glial hücreler sallayın. T75 37 ° C nemlendirilmiş atmosfer,% 5 CO 2/95% hava ile bir inkübatör içerisine yerleştirilir edilemiyorsa, 5 mM HEPES ile ortam takviyesi. R hücreler iki kez yıkayınyapışmayan mikroglial hücreleri birikimleri temizlenmelidir.
  8. Üç hafta sonra tohumlama, kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS hücreleri iki kez yıkayın. Sıcak,% 0.05 tripsin-EDTA% 0.02 3 ml ilave edilir, 37 ° C'de inkübe edilir ve hücre tabakası (genellikle 5 dakika) dağılana kadar bekleyin. , GCM 10 ml eklenmesiyle tripsin aktivitesi inhibe 8 dakika boyunca 120 x g 'de 15 ml Falcon tüpü ve santrifüje hücre süspansiyonu aktarın.
  9. % 90 FBS içinde astrosit pelletini -% 10 DMSO, sıvı nitrojen içinde (2 x 10 6 cryovial başına hücre) ve mağaza cryovials içine aktarın.

Rat Beyin mikrodamarlar 2. İzolasyonu

Bizim deneysel prosedürleri Marsilya Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal ve Avrupa yönetmeliklerine (AB direktifi No 86/609) uygun olan. Tüm hayvan çalışmaları acı en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için yapılmıştır.

  1. Her hazırlanması için, ve bir Experimente içinr, 3, beş haftalık Wistar fareleri kullanır.
  2. İlk hafta Pazartesi, her iki kültür steril su içinde 1 ug / cm 2 (T75 başına 10 mi), kollajen tip IV ve fibronektin ile kaplanarak 2 T75 şişeleri hazırlar. Mikrodamar tohumlama kadar 37 ° C'de uygun izin verin.
  3. Ilk hafta Çarşamba sabahı, uyuşukluk neden CO 2 artan akı altında fareleri euthanize, duruş ve nefes kesilmesi kaybı, daha sonra servikal dislokasyon ile izledi. % 70 etanol ile kafaları püskürtün. Bir makas ile başlarını kesip bir laminer akış kaputu altında kuru bir Petri kabı içine aktarabilirsiniz.
  4. , Buz üzerinde soğutuldu ve soğuk diseksiyon tamponu ile dolu bir Petri kabı içine transfer sonra, beyincik ve optik sinirler olmadan kafatası beyin çıkarın (HBSS,% 1 BSA, penisilin 100 birim / mL ve streptomisin 100 ug / ml ile takviye edilmiş) .
  5. Için gelen 2 hemisferdeki ve ayrı Ortabeyin ayırmak yarısında beyinleri Cutebrain. Diseksiyon tamponu ile buz üzerinde temiz bir Petri kabı içine forebrains aktarın.
  6. Dikkatli N ° 5 kavisli forseps ile stereomicroscope altında forebrains gelen meninksler kaldırmak için soğuk diseksiyon tamponu ile yeni bir Petri kabındaki yarıkürelerinin bir çift almak. Sonra, miyelin yorgan kaldırmak ve korteksin bir kabuk elde etmek için beynin içini temizleyin. Bu adımlar doku korunması ve hücrenin hayatta kalabilmesi için en fazla 2 saat almamalıdır.
  7. Farklı kleransların 2 havan elleri her 10 yukarı ve aşağı felç, 20 um ardından 71 mikron tarafından homojenleştiricisi dounce 7 ml soğuk diseksiyon tampon 6 ml içine 3 beyinlerinden korteks ayırmak.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de, 50 ml Falcon tüpü ve santrifüj 1 ml 1 korteks eşdeğerini elde etmek için süspansiyon bölün. Süpernatant atın.
  9. Kolajenazlar / dispaz karışımı (60 ug / ml ihtiva eden bir enzimatik R çözeltinin 1 ml'si ile 1 korteksinden süspansiyon Digest11; 0.3 U / ml), DNase tip I (35 ug / ml - 20 K birim / ml) ve 37 ° C'de 30 dakika süre ile bir çalkalama içinde gentamisin (50 ug / ml)
  10. 1 ml 10% 25 BSA / HBSS 1X üzerine ilave edildi ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3600 x g'de santrifüj ile yoğunluk bağlı ayrı 1 korteksinden sindirimi karıştırın. Dikkatli bir şekilde temiz bir 50 ml Falcon tüpü içine, üst disk (miyelin ve beyin parenkimi) ve süpernatant aktarmak ve santrifüj tekrarlayın. 4 ° C 'de beyin mikrodamarlar içeren elde edilen pelet Ol
  11. Dikkatle üst disk ve süpernatant atın. Soğuk HBSS 1X 1 ml beyin mikrodamarlar ihtiva eden hem de elde edilen pelet yeniden süspanse edin ve temiz bir 50 ml Falcon tüpü içine aktarın.
  12. 5 dakika boyunca 1000 x g'de 20 soğuk HBSS 1X ml ve santrifüj eklenmesiyle mikrodamarlar yıkayın. Süpernatant atın.
  13. Bundan başka, bir sh, 37 ° C'de, 1 saat boyunca aşama 2.9 'da tarif edildiği gibi aynı enzimatik çözeltinin 1 ml'si ile 1 korteksinden mikrodamarlar sindirimiaker.
  14. Daha sonra, bir tüp içine 3 korteks her birinden sindirilmiş mikrodamarlar karıştırmak ve bundan başka, tüp başına bir buçuk (1.5) korteks eşdeğer ekstre mikrodamarlar elde etmek için iki adet 50 ml Falcon tüpleri içine ayrı. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de soğuk diseksiyon tampon ve santrifüj 30 ml ilave edilir.
  15. % 20 sığır trombosit bakımından yoksul plazma türevi serum, bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 ug / ml), gentamisin (50 ug / ml) ile desteklenmiş DMEM/F12, 10 ml mikro damar pelletini HEPES ve endotel hücre ortamı (ECM) olarak adlandırılan (2.5 mM), 4 ug / ml 'de puromisin ile takviye edilmiştir.
  16. , Inkübatörden 2 kaplı T75 şişeleri al kaplamanın aşırı aspire ve bir T75 şişesi (T75 şişesi başına 1,5 korteksinden ekstre mikrodamar) her bir tüpten mikrodamarlar plaka.

RBEC Primocultures 3. Saflaştırılması ve Çoğalma

  1. Arıtma: Çarşamba-Cuma, purom eklemekİcin kültür ortamı için 4 ug / ml 'de. Perşembe günü orta değiştirin. Cuma günü, Pazartesi gününe kadar 2 mcg / ml hücreleri yıkayın ve puromycin ekleyin.
  2. Silahların Yayılmasını Önleme: ikinci haftanın Pazartesi günü, hücrelerin yıkayın ve kültürleri ikinci hafta Çarşamba günü% 90 izdiham ulaşana kadar kültür ortamına insülin, transferrin ve sodyum selenit ek ekleyin.

. 4. Farklılaşma: In Vitro BBB Model Kurma

  1. Ikinci hafta, Pazartesi (üst bölmesine karışımı 500 ul iki steril kültür su içinde 0.5μg/cm 2 kolajen tip IV ve fibronektinin bir karışımı ile kaplanması ile filtreler (polietilen, 12 kuyu, gözenek boyutu 1.0 um) hazırlanması ve alt bölme içinde steril kültür su 1.5 ml). RBEC tohumlama kadar 37 ° C'de uygun izin verin.
  2. Ikinci haftanın Pazartesi, beş gün ko-kültür kuruluşundan önce, 37 ° C ve transfer cryovials gelen astrositleri çözülme10 mi GCM olan bir 15 ml Falcon. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 120 x g'de santrifüje süspansiyon.
  3. 12-çukurlu levhalarda cm2 başına 30 x 10 3 hücre yoğunluğunda GCM ve plaka içindeki astrosit pelletini.
  4. Ikinci haftanın Çarşamba, sadece tripsin ile Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu ayrışmasından önce, DMEM/F12 ortamı ile iki kez önceden kaplanmış filtreyi yıkayın. Alt bölmeye 1.5 ml ile üst bölmesine 0.5 ml: ECM ile odaları ön doldurun.
  5. Ikinci haftanın Çarşamba, kalsiyum ve magnezyum olmadan DPBS ile iki kez RBEC yıkayın. Tam olarak 30 saniye boyunca T75 şişesi başına 37 ° C 'de% 0,02 EDTA çözeltisi - sıcak tripsin 4 ml% 0.05 ekleyin. Sonra tripsin solüsyonu 3.5 ml çıkarın ve mikroskop altında görüyoruz. Hücre tabakası, matriks ayırmak tüm hücreler yüzen kadar yavaşça T75 şişenin kenarına dokunarak onlara yardım etmek başlar.
  6. T75 şişesi başına ECM 9 ml ilave edilir ve bir 15 ml Falcon tüpü içine aktarın. Çok nazikçe hücreyi ayırmaksan bir ucu ile donatılmış bir 10 mL pipet ile aşağı yukarı 4 kez pipetleme ile süspansiyon (çözelti içinde kabarcıkların üretimi kaçının). Süspansiyon hücreleri (yaklaşık olarak 3 x 10 cells/T75 6) sayısı ve hemen bir yüksek yoğunluklu (160 x 10 3 hücre / filtre bu nedenle yaklaşık 18 filters/T75) (Şekil 8 ile önceden kaplanmış ve önceden doldurulmuş filtrelerinde plaka .) Ertesi gün (Perşembe), hücre tozu gidermek için, üst bölmenin iki orta değiştirin.
  7. Ikinci haftanın Perşembe, ko-kültür kuruluşundan önce bir gün, bazal bölmesinden 1/3 klimalı ortam ile takviye edilebilir farklılaşma medya 1.5 ml (500 nM hidrokortizon ile ECM) tarafından astrocyte kültür ortamı değiştirin bir (endotelyal hücreler ve astrositler arasındaki temas 3 gün) ko-kültür önceki of.
  8. Ikinci hafta Cuma farklılaşmasının gün 0 olarak tanımlanır; filtreleri conta gelen kültür ortamı değiştirinfarklılaşma medya ile Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu adencilik. Astrositler içeren kuyu içine RBEC filtreleri aktarın. Bu koşullar altında, in vitro modeller ayırt etmek ve 3 gün içinde bağlantı ile ilgili proteinleri ifade eder.
  9. Modeller üçüncü hafta Pazartesi ve Çarşamba arasında 3 gün daha, sırasında optimum farklılaşma tutmak.

Representative Results

Üretim Protokolü
Bir gözenekliliğe sahip kılcal endotel hücreleri, (a) saflaştırılması, (b) çoğalması ve filtrelerde (c) farklılaşma (12 oyuklu plakalar polietilen: Protokol kültür ortamı bileşim içinde büyük değişikliklere karşılık gelen 3 evreye ayrılabilir 1 astrositler ile ko-kültür um) tanımlanmaktadır. Üretim protokolünün farklı adımlar, birincil hücre kültürleri tekrarlanabilirliğini (Şekil 1) arttırmak amacıyla haftanın belirli gün tahsis edilmiştir. Ilk hafta Çarşamba günü dolayısıyla 9 gün ko-kültür sisteminin kurulmasından önce, mikrodamarlar (Şekil 2A) izole edildi. Endotel hücrelerinin saflaştırılması için, kültürler, 5 gün boyunca puromycin azalan konsantrasyonlarda mevcudiyetinde muhafaza edilmiştir. En çok bulaşıcı hücreler (özellikle perisitler) ortadan ve endotel hücrelerinin büyümesini kendi fenotipinin değişiklik olmadan daha düşük idi. Mil-shaped hücreler sıçan beyin gri madde (Şekil 2B) izole kılcal parçalarının dışında büyümek. Ikinci hafta, Pazartesi günü sıçan astrositler 12 oyuklu plakaların altına ekildi. Çarşamba, RBEC filtrelerin luminal bölmesine ilave edildi. Yüksek yoğunluklu tohumlama x 10 160 / cm 2 (Şekil 2C) 3 hücreleri, filtrenin (Şekil 2D) periferinde boşlukları önlemek için yardımcı olur ve endotelyal hücre tek tabaka, homojen bir farklılaşma oluşturur. Hücreler uzunlamasına hizalama, ve muntazam tek tabaka oluşturan, tipik ince uzun iğ şeklinde bir morfoloji gösterirler. Perşembe, astrosit kültür ortamı önceki ko-kültür ortamı (Şekil 2E) ile klimalı farklılaşma ortamı için değiştirildi. Cuma, RBEC filtrelerde 500 nM hidrokortizon içeren kültür ortamında yetiştirildi ve filtreler astrositler içeren 12-delikli plakalara transfer edilmiştir. Üçüncü haftasında, deneyler were Pazartesi ve Çarşamba tarihleri ​​arasında gerçekleştirildi.

RBEC Karakterizasyonu ve tabakalı Geçirgenliğine Belirlenmesi Unsurları
RBEC endotelyal ve BBB belirteçlerin imüno tarafından hem de TEER, LY geçirgenlik ve bu P-gp olarak akış taşıyıcıları işlevselliğinin ölçümleri ile karakterize edilmiştir.

RBEC puromisin saflaştırma yöntemi ile elde edilen (Şekil 1 ve 2) birleştiği noktada büyüme inhibisyonu sergilemiştir örtüşmeyen sürekli mono tabakaları büyüdü ve sıkı bir şekilde kapatılan, füze biçimli ve iğ şeklindeki morfoloji sergilemiştir. RBEC kültürleri endotel hücreleri tipik markörlerini ifade edilmiştir: bunlar platelet endotelyal hücre yapışma molekülü (Şekil 3A, CD31/PECAM) için pozitif immüno-lekeleme göstermiştir ve von Willebrand faktörü (Şekil 3B) sentezlenmesi. Puromycin tedavi olmadan, RBECs hızla desmin Bağışıklık lekelenmesi ile tespit perisitlerden tarafından işgalTaining (Şekil 3C). Astrositler (Şekil 3D) ile ifade Glial fibriller asidik protein (GFAP) astrosit önemli bir farklılaşma belirtecidir. Yüksek geçiş sayısı ile, astrositler endotel hücrelerin farklılaşmasını sağlayan yeteneğini kaybeder. Bu nedenle, astrosit kültürleri kültür kendi kez standart ve sadece bir geçit çekildi.

Astrositler ile ortak-kültür tarafından takip hidrokortizon ile takviye edilmiş ortam, ve daha önce ko-kültürler alt bölme kıvamlandırılmış ortam ile RBEC kültürlenmesi tek başına kültürlenmiş RBEC göre interendothelial TJs güçlü indüklenmesine yol açtı. Hücreler ifade Claudin-5, bağışıklık (Şekil 4B-D) ile gösterildiği gibi, hücre-hücre birleşme lokalize ve ZO-1 ve occludin protein (Şekil 4E için western blot analizi ile ortaya çıkmıştır ZO-1 ve occludin proteinler, .) C morfolojik dağılımıbir fermuar ve benzeri şekilde ell-hücre temas tek tabaka (a) sızdırmazlığı yansıtır, (b) serebral kapiler endotelyal hücrelerin orijini, ve (c) yüksek oranda farklılaşmış serebral endotelyal hücre özelliğidir. Endotel tabakasının paraselüler geçirgenliği filtrelerin alt bölmesine üst gelen Teer ve LY (457 Da) akını oranı ölçülerek izlenmiştir. TEER bir EVOM voltohmmeter bağlı 12 mm kültür kapları için bir ENDOHM-12 kullanılarak ölçülmüştür. TJs sızdırmazlığını gösteren beyin endotelyal mono tabakaları TEER, (12 kuyucuğu filtreler, veriler gösterilmemiştir) ortalama 300 ohm · cm 2 ulaşmıştır. (Bariyer ve test bileşikleri ile birlikte kuluçkaya bir bütünlük kontrol olarak kullanılmıştır Pe (LY)) LY için Pe, 1 yıllık bir süre içinde 0.26 ± 0.11 x 10 -3 cm / dk 'lık bir ortalama (Şekil 4F) ulaşmıştır.

Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu iltihabı teşvik etmek amacıyla biz pr el24 saat boyunca 5 ng / ml 'de o-inflamatuar sitokin, TNF-α, ve 120 ng / ml (non-iki katına, kültür sisteminin üst bölmesine Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu tarafından (MCP-1) salgılanması CCl2 ölçülerek enflamatuar cevabı takip 250 ng / ml (Şekil 5A) ile kontrol) ile muamele edildi. Pe (LY) ölçümü (Şekil 5B) ile ortaya çıktığı gibi ml 5 ng / veya 24 saat boyunca 50 ng / ml 'de TNF-α tedavisi de BBB açtı.

P-gp immunositokimya (Şekil 6A) göre farklılaştırılmış Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu olarak görüntülendi. P-gp localisation yüksek polarize olduğu bilinmektedir ve glutamat taşıyıcı-1 (GLT-1), esas olarak bazolateral fraksiyonu 45 bulunan ise endotel hücreleri 44 apikal esas ifade edilir. Bizim kültür Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu polarizasyon ölçüde değerlendirmek için, apikal ve bazolateral proteinler sakaroz yoğunluğu kullanılarak plazma zarı hazırlıkları ayrıldı 46 degradelerle. Western blot analizi olduapikal plazmada P-gp ve YHTC-1 ifade seviyeleri ve bazal zar müstahzarları değerlendirmek için gerçekleştirilmiştir. Taze fare beyninden ekstre Mikrodamarlar bu proteinlerin in vivo dağılımı (Şekil 6B) en yakın pozitif kontrol olarak kullanıldı. Kılcal ve farklı RBEC zar preparatlar her ikisinde de, P-gp esas olarak F1 apikal membran fraksiyonunun (Şekil 6B, C) ​​lokalize, 170 kDa'lık bir bant olarak ifade edilmiştir. GLT-1 ifade gerçekten 65-70 kDa'lık bir bant olarak, mikrokapların F3 bazal membran fraksiyonu olarak ifade edildi, ancak kültürlenmiş Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu bulgulanmamıştır.

Paralel deneylerde, endotel hücre mono tabakasında P-gp fonksiyonel aktivitesi, bir ligand olarak 123 rodamin (R123) kullanılarak test edilmiştir. R123 efflux of (A için B) lüminal abluminal ters yönde (Şekil 6D) göre 1.7 kat daha fazla idi. P-gp katılımını kanıtlamak için, biz verapami, spesifik P-gp inhibitörleri kullanılırl (25 uM, 30 dakika inkübasyon) ve siklosporin A (1 uM, 30 dakika inkübasyon). Verapamil ve siklosporin tedavi ile, Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu in R123 birikimi tedavi edilmemiş kontrol (Şekil 6E) ile karşılaştırıldığında, 1.6 kat, 2 kat artmıştır.

Reseptör Aracılı transsitoz (DDK) Mekanizmalar ilgilendim reseptörleri
Model, bundan başka, potansiyel olarak bu tür LRP1, LDLR veya TfR (Şekil 7A) halinde bbb transsitoz mekanizma, içinde yer alan farklı reseptörlerin ekspresyonu için karakterize edilmiştir.

Fonksiyonel çalışmalar taşıma TfR ve LDLR için ligandlar ile gerçekleştirilmiştir. Canlı RBEC 37 ° C'de (Şekil 7B, C) ​​de 180 dakika boyunca CY3 (Tf-Cy3) ile etiketli sıçan transferin ile inkübe edildi. BBB vitro modeldeki sıçanlarda Tf-Cy3 alımı ve taşıma miktarının Eğrilerin eğimi biraz 2400 pikomol ötesinde azalma gösterdis (Şekil 7B), bağlanma / alım doyurulabilir olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, bağlayıcı / alımını doygunluğu alt bölmesindeki Tf birikimi ile ilişkili olduğu saptandı. Bu gözlemi teyit etmek için, Tf-Cy3 4,800 pikomol (yayla / doygunluğu) (Şekil 7C) non-floresan Tf fazlası ile 1,200 pikomol (eğrinin yükselen kısmı) inkübe edildi. Bu deneyler, alt bölmeye Tf-Cy3 birikiminin bir azalma gösterdi ve in vitro BBB modelinde ligand-reseptör etkileşmesi için tipik doyabilen bir mekanizma doğruladı.

Benzer şekilde, LDLR işlevsellik endotelyal hücre tek tabaka (Şekil 7D, E) boyunca kendi ligand DiILDL alımının ve taşıma araçları ile gösterilmiştir. Canlı RBEC 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi DiILDL Bağlanma / alımı alt bölme (Şekil 7D) içinde DiILDL birikimi ile ilişkili değildi. Diil KantitasyonuDL taşıma Eğrilerin eğimi bu nakil doyurulabilir olduğunu ve modelinde reseptörü ile ilişkili işaret, 2 ug ötesinde azaldığını gösterdi. Sodyum azid 15 dakika önce kuluçkadan DiILDL (Şekil 7E) ile,% 0.05 ilave edildi. % 0.05 sodyum azid, kuluçkadan toksisite yokluğu Pe (LY) ölçülmesi, (veriler gösterilmemiştir) ile değerlendirildi. Bu deneyler, alt bölmeye DiILDL birikimi azalma gösterdi. Genel olarak, bizim sonuçlar bizim in vitro BBB modelinde DiILDL için RMT öneririz.

Rat Spinal Kord veya fare beyin Endotel Hücreleri dayalı diğer In Vitro BBB Modelleri
Kolajenazlar / dispaz karışımı ile enzimatik sindirim hücre canlılığı ve serebral mikrokapların üretim verimi yönünden kontrol etmek için en önemli parametrelerden biridir. Dokuya enzim miktarına nisbetle, n arasında enzim ve daha önemli bir oranı konsantrasyonusıçan beyninde, sıçan omurilik ve farenin beyin arasındaki hassas kalibre edilmesi EEDS. Mikrovasküler ekim yoğunluğu ve endotel hücrelerinin sayısı% 90 izdiham (9 gün sonrası mikrovasküler mibzer) ulaşmak için bağlı ve, hücre büyümesini artırmak nüfus iki katına çıkarılması ve modellerin kalitesi sayısını sınırlamak için önemli parametrelerdir edildi. Sıçan omurilik mikrodamar aynı zaman dilimi içinde T75 şişesi başına hücre aynı miktarda elde etmek üzere (doku miktarı, 1 beyne yaklaşık olarak karşılık gelen 2 omurilik açısından), sıçan beyin kılcal için burada tarif edilen ile aynı protokol ile üretildi . 5 haftalık C57BL6 fareler beyin zarları onlar kortekse sopa çünkü ortadan kaldırmak için zordu. Dispase ile beynin kısa bir tedavi menenjlerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için görüntülenir. Sıçan beyni, sıçan omurilik ve fare beyninden tekrarlanabilir endotel hücre mono tabakaları üretimine katkıda önemli parametreler boyanmış ve özetlenmiştirŞekil 8,.

Şekil 1
Şekil 1. In vitro modeli BBB hazırlama temel aşamalarını özetleyen akış şeması. Üretim protokol farklı adımlar, birincil endotel hücre kültürleri tekrarlanabilirliğini artırmak amacıyla haftanın belirli gün tahsis edilmiştir. Protokol 5 haftalık Wistar sıçanlarda mikrovasküler üretimi ile, birinci hafta Çarşamba günü başlıyor.

Şekil 2,
Şekil 2,. Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu, astrositler ve ko-kültür sisteminin faz kontrast fotomikrograflarıdır. Üzerinden kaplama sırasında (A) 5-haftalık Wistar sıçan mikrodamar fragmanları.(B) 4 ug / ml 'de P-gp substrat puromisin ile 2 gün boyunca tedavi üç günlük kültürlerin RBEC. Tipi kolajen ile kaplanmış bir 12 delikli plakanın Millipore filtreleri üzerinde kaplama sonrasında (C) günde 1 Saf birleşik endotel tek tabakaları ko-kültür temsil özelliği, petek yapılı morfoloji gösteren ortak-kültürünün oluşturulması günü uç filtrenin çevresinde hücre mono tabakasının IV ve fibronektin. (D) Homojenliği. (E) karışmış astrosit kültürü. (F) Şema C, D ve E'de fotomikrografların lokalizasyonu ile sistem

Şekil 3,
Immünofloresan mikroskopi ile RBEC kültürlerin Şekil 3.. Karakterizasyonu. (A) beyin endotel hücreleri, endotelyal hücre ifade platelethücre sınırında yapışma molekülü PECAM/CD31, (B), von Willebrand faktörü (vWF) nispeten noktalı boyanma, parlak ve daha diğerlerine göre biraz hücrelerde toplanmış ve perinükleer bölgede konsantre edildi gösterir. Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu arasında puromisin tedavi olmadan (C) kültürleri, perisitler (yeşil) desmin'i için pozitif immün ile tespit ve karakteristik küçük yuvarlak çekirdekleri vardır. (D) Astrositler glial fibriller asidik protein (GFAP) ifade edilmiştir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4,. Vitro BBB modelinde fare ve paraselüler geçirgenliğinin immünositokimyasal karakterizasyonuLY endotel tek tabaka karşısında. Endotelyal hücre tek-tabakalı morfoloji ve sıkı birleşme proteinlerinin ekspresyonu ile çakışmayan morfolojisi ve tipik iğ şekilli hücreleri ile konfluent beyin endotelyal hücre tek tabaka ortaya çıkarmak için (A) vimentin ile immüno-lekelendi (B)-5 Claudin , (C) ZO-1 ve (D) 12-çukurlu BBB modeli de ZO-1 ve occludin proteinleri (E) için western blot ile tespit occludin. (F) Tek tabakalı geçirmezlik Lucifer sarı nakliyesini ölçülerek değerlendirildi (LY-CH, dilityum tuzu), BBB tarafından muhafaza edilmesi için bilinen küçük bir molekül hidrofilik (MW 457 Da). Kısaca, LY 37 ° C de 60 dakika boyunca beyin endotel hücreleri ile temas halinde, kültür sisteminin üst bölme içinde kuluçkalanmıştır Bu süre sonunda, alt bölmenin orta toplandı ve floresan, bir spectrofluorimet ile florimetrik analizi ile nicelleştirilmiştir430 nm 'de bir eksitasyon ve 535 nm'de emisyon ile er. Sonuçlar, 10 -3 cm / dak geçirgenlik veya Pe olarak ifade edilmiştir. LY Pe -3 0.6x10 cm / dk 'nın üstünde olduğunda bariyer geçirgen ya da açık olarak kabul edilir. Her deney 1 saat boyunca ortalama temizlenir hacim zaman ve lineer regresyon analizi ile tahmin eğimi karşı grafik haline getirilmiştir. Kolajen tip IV-fibronektin kaplamalı kontrol filtreleri için açıklık eğrinin eğimi PSF ve beyin endotel hücre mono tabakaları filtrelerin açıklık eğrisinin eğimi PSt ifade edilmiştir ifade edildi. : Endotel tek tabaka (PSE) için PS değeri hesaplandı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Denklem 1

PSE değerleri por alanında ile ayrıldılı membran (12 oyuklu plakalar Millipore filtreleri için 1.1 cm 2) ve sonuç / dk 0.26 ± 0.11 x 10 -3 cm'lik bir ortalama geçirgenlik katsayısı (Pe) idi. Sonuçlar, n = 90 deneyleri için dikey bir saçılma grafiğidir gösterimi (deney başına n = 6 mono tabakaları için n = 3 ortalaması) ile sunulmaktadır.

Şekil 5,
Şekil 5,. In vitro pro-enflamatuar ajan, TNF-α ile tedaviye yanıt modeli BBB. Kültür sistemi için kültür ortamı 6 saat, 12 saat için, üst bölme 5 ng / ml 'de TNF-α, sadece tedavi öncesi değiştirildi ve 24 saat. Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu tarafından CCL2 salma-muamele edilmiş kontrol ile karşılaştırıldığında ELISA tahlili ile, üst bölmeye nicelleştirilmiştir. MCP-1 seviyeleri zamanın bir fonksiyonu olarak hafifçe artış unutmayın, Hatta olmayan muamele edilmiş kuyu. LY Pe (LY) için endotelyal Pe tarafından ölçülen endotelyal hücre engeli bütünlüğü ml 5 ng / veya 0.62 ± 0.02 x 10 aralığında 50 ng / ml 'de TNF-α ile 24 saat muamele ile tek tabaka geçirgenliğindeki bir artış ortaya - / dak 3 cm ve 0.7 ± 0.01 x 10 cm -3 / / dakika (Student t-testi, p <0.05), 0.33 ± 0.03 x 10 cm -3 kontrol ile karşılaştırıldığında, sırasıyla dakika.

Şekil 6,
P-gp akış taşıyıcı ve RBEC polarizasyon imünosito kimyasal olarak (A) ve western blot (B ve C) ile astrositler ile birlikte kültürlenmiş beyin endotelyal hücrelerinde akış taşıyıcı P-gp. Ifade Şekil 6.. İşlevsellik. Hücre membran proteinleri, hücresel protein fraksiyonu ile ekstre edildition kiti. Plazma membranlar organel ve çekirdekleri elimine etmek için hipotonik lizis ve diferansiyel santrifüj işlemi ile elde edilmiştir. Plazma zarlarından apikal ve bazolateral proteinlerin ayrılması sükroz yoğunluk gradyanı ile elde edilmiştir. Glutamat taşıyıcı-1 (GLT-1), esas olarak bazolateral fraksiyonu (F3) lokalize edilmiş P-gp esas olarak apikal kısmı (F1) olarak tespit edildi. Kaplama öncesi saflaştırılmış mikrodamar bu proteinlerin in vivo lokalizasyonu için kontrol olarak kullanıldı. P-gp aktivitesi R123, bir P-gp ligandının taşıma polarite ölçülerek belirlenmiştir. 1 uM R123 akı lümen-to-abluminal (B A) ve karşı abluminal-to-luminal (A B) yönde 37 ° C'de 1 saat boyunca ölçülmüştür. Aynı deney uç filtre boyunca pasif difüzyon değerlendirmek için Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu olmadan gerçekleşmiş ve veri Pe (R123) hesaplaması için bu değere göre normalize edildi (bkz. Şekil 5 (R123) dayalı olarak lümen-to-abluminal taşıma 100% (B A) olarak ifade edilmiştir. Verapamil (25 uM, 30 dakika inkübasyon) ve siklosporin A (1 uM, 30 dakika inkübasyon) referans P-gp inhibitörleri olarak kullanılmıştır. Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu olarak R123 birikimi P-gp inhibitörleri (Student t testi, p <0.05) ile preinkübasyonu ile veya olmadan 2 saat sonra ölçüldü. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 7
Reseptör Aracılı Tra katılan bir reseptörler Şekil 7. Karakterizasyonnscytosis (RMT). (A) farklı RBEC tek tabaka, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü, ilgili 1 (LRP1) ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (LDLR) karşı antikorlar ile immüno-lekelendi. Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu Konfokal görüntü perinükleer bölgede bir kümeleme ile, DiILDL alımından, LDLR bir floresan ligand ve fare Transferrin-Cy3, hücre yüzeyi üzerinde TfR göstermek noktalı boyanma bir floresan ligandının alımı için problanmıştır. (B) Rat Tf-Cy3 75 ° C'de ayrılır RBEC tek tabaka içeren, üst bölmeye eklendi, 150, 300, 600, 1,200, 2,400 ve 4,800 pikomol / üst bölmesine 37 ° C (200 uL de 180 dakika ve 1200 uL için eklemek alt bölüm). Bu süre sonunda, Cy3 floresan, 570 n, 550 nm ve emisyon eksitasyon bir spektroflorimetre kullanılarak florimetrik analizi ile hücre lizatı (PBS içinde 200 uL% 0.1 Triton X100) ve alt bölmesinde nicelleştirilmiştirm. Floresan tane doğrusal çalışma aralığı doyma deneyleri için. (C) kullanılarak pikomol olarak transforme edildi, sıçan Tf-Cy3 / 15 olan veya olmayan, 37 ° C'de 180 dakika boyunca 1,200 pikomol eklemek de farklı RBEC tek tabaka içeren, üst bölmeye eklendi dk olmayan floresan Tf 4.800 pikomol / insert ile-inkübasyon öncesi. Alt bölme içindeki nakil aracı (B) (Student t-testi, p <0.05) olarak nicelendirildi. (D) DiILDL 1, 2, 4 ve 8 ug / insert filtreler de farklı RBEC tek tabaka içeren, üst bölmeye eklendi 37 ° C (üst bölmeye 200 ul ve alt bölme 1.200 ul), 30 dakika karıştırıldı. Bu süre sonunda, DII floresan 571 nm 'de 554 nm ve emisyon eksitasyon bir spektroflorimetre kullanılarak florimetrik analizi ile hücre lizatı (PBS,% 0.1 Triton X100, 200 | il) ve alt bölmesinde ölçüldü. FluoresCence tane doğrusal bir çalışma aralığı kullanılarak ug olarak transforme edilmiştir. (E) deneyleri bloke taşıma, sodyum azid 2 ug / 37 ° C'de 30 dakika boyunca eklemek de DiILDL en inkübasyondan önce,% 0.05 'de 15 dakika ilave edildi Alt bölme içindeki nakil aracı (D) (Student t-testi, p <0.05) olarak belirlendi. % 0.05 sodyum azid kuluçkadan toksisite yokluğu Pe (LY) ölçüm (veri gösterilmemiştir) ile değerlendirildi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 8,
Şekil 8,. Olarak fare omurilik endotel hücrelerinden ya da fare beyninden BBB vitro model. Yüksek Tablodasıçan beyninde, sıçan omurilik ve fare beyin mikrovasküler çıkarılması için önemli parametreleri yanar. Fotomikrografları sıçan beyninde, sıçan omurilik ve fare beyninden hazırlanan endotel hücre mono tabakaları ZO1 ve occludin için bağışıklık boyamasım göstermektedir.

Discussion

Biz, Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu saflaştırılması ve kültür, aşağıdaki ve başka karakteristik özellikleri olan BBB bir in vitro BBB modeli oluşturmak için primer fare astrositler ile birlikte-kültürler kurma, beyin, mikrokapların izolasyonu ve kaplama için bir haftalık tekrarlanabilir protokol uygulanmasını tarif eder.

Başarıyla BBB vitro kültürlerinde standart kurma işleminin birden fazla sıralı aşamada bu şekilde uygun koşullar gerektirir. Modeli (a) in vitro BBB modellerin "Holy Grail" kalır, ve (b) efflux ve DDK mekanizmaları valide düşük paraselüler geçirgenliğini, elde etmek için optimize edilmiştir.

Üretim, Arıtma ve Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu Yayılmasının

RBEC yetiştirilmesi büyük sorun, farklı kültürler arasında yeniden elde etmektir. Protokol Standardizasyon dis için yüksek kaliteli araçlar gerektirirbölüm, yüksek kalite reaktif ve reaktif son kullanma tarihleri ​​saygı. Deneyci korteks yüzeyinden menenjlerin ve büyük damarların hızlı kaldırılması için stereomicroscope altında mikro diseksiyon yetenekli gerekmektedir. Beyin izole ve mekanik ayrışmış bir kez, önemli sorunlardan biri taze izole beyin mikrodamarlar optimum enzimatik sindirim olduğunu. Kullanılan enzim türü ve kalitesi çok önemlidir. Partileri arasında düşük değişkenlik yüksek konsantrasyonda kollagenazlar tip I ve II ve dispase bir karışımı kullanıldı. Ayrıca önemli enzimatik sindirme süresi ve sindirim enzim konsantrasyonu / doku ağırlık / hacim arasındaki oran vardır. Beyin mikrodamar üretiminin en iyi verimi 30 dakika ve 1 saat sırasıyla her iki sindirimler boyunca 60 ug / ml 'de karıştırmak dispase / kolajenlerinin 1 ml 1 beyin korteksinde eşdeğeri ile elde edilmiştir.

Ayrıca, kritik hücre kirletici ortadan kaldırılmasıdırs (astrositler ve temel perisitler). Bu hücreler, endotelyal hücreler daha yüksek bir hızda çoğalır ve bu nedenle iyi bir sıkılık paraselüler sahip tek tabaka, homojen bir hücre kurulmasını engelleyen, ikincisi ile sıkı bir bağlantı yerlerine kurmak yoktur. Olmayan endotel hücreleri elimine edilir ise beyin endotelyal hücreler, mikrokapların bulunan diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında akış pompaları çok daha yüksek seviyelerde, özellikle P-gp, ifade göz önüne alındığında, bunlar, daha P-gp ligand ilaçların başka şekilde toksik konsantrasyonları tolere edebilir. Ilk iki gün için 4 ug / ml 'de göz mertebesinde tedavisi iyi endotel hücre saflık elde etmek için 2 ug / ml' de iki gün daha izledi. Bu seçim de venüllerin, ön kılcal arteryollerin veya daha büyük kılcal gelenler karşı kılcal endotel hücreleri tercih ve sıkı tek katmanlar yol açabilir. Buna ek olarak, zayıf plazma-türevi sığır serumu kullanılmasıdır endotel hücrelerinin 47,48 saf kültürleri elde etmek için zorunludur. Plazma-derived serum düz kas hücreleri ve bu nedenle perisitlerin için, fibroblastlar için mitojeniktir trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF), yoksundur.

Sıçan kuyruk geleneksel olarak tavsiye edilen kolajen tip I ile karşılaştırıldığında proliferasyon verimle bir 2-kat bir artış ile, fare ve insan fibronektin önemli bir avantaj elde edilir kollajen tip IV ün bir karışımı ile plastik ve filtrelerin tedavisinin görülmektedir. Hücre çoğalması için önemli ipuçları bu integrini ve büyüme faktörü (bFGF) aktivasyonu 49 gibi hücre dışı matriks tarafından sağlanmaktadır. Tampon konsantrasyonu ve kültür ortamının pH paraselüler sıkışma 50 üzerinde pozitif bir etkisi tarif edilmiş ve 5 mM HEPES tamponu ilavesi ile kültürler arasında daha iyi bir tekrarlanabilirlik görülmektedir.

Ekle Filtreler Co-kültür Kuruluş: Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu Farklılaşma

Beyin endotel hücreleri, b kezeen arıtıldı ve 6 gün için sürmektedir, bu filtreler üzerindeki kaplama olabilir. Yüksek yoğunlukta Cell kaplama mükemmel bir tek tabaka elde edilmesi için çok önemlidir. 12 oyuklu bir plaka filtre başına 160x10 3 hücrelerinin bir tohum yoğunluğu Tohumlamadan sonra konfluent tek tabaka 24 saat elde etmek için gerekli ve yeterli oldu. Ancak, çevreden primer beyin kılcal endotel hücrelerinin izolasyonu birincil hücreler ve özellikle beyin kapilar endotelial hücreler, güçlü bir şekilde ortam ile düzenlenir ve indüktif faktörler tarafından üretildiği bilindiği gibi bir BBB in vitro modelinin oluşturulması bir paradoks Farklı çevreleyen hücre türleri. Beyin kapiller endotel hücreleri tek başına hızla de-farklılaşmamaktadır kültüre ve bazı spesifik beyin endotel belirteçleri gevşek. Bu nedenle, primer endotel hücreleri, düşük geçiş (P1) kullanılmalıdır ve yeniden bağlanmış, en azından kısmen, astrositler 47,51 şartlandırılmış astrosit veya ortam ile birlikte-kültür ile çevreleriyle. Bu tutarbeyin endotel hücreleri ve astrositler olarak astrosit farklılaşması için de iki yönlü indüksiyon katılmaktadırlar. Astrositler ile RBEC kültürlenmesi interendothelial TJ 52,23 güçlü indüklenmesine yol açtı. Re-indüksiyon moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir, ve araştırma optimum endotel hücre farklılaşmasını 53,54 teşvik olabilir astrositlerde tarafından salgılanan belirli modüle faktörleri belirlemek için çeşitli laboratuvarlarda devam etmektedir. Lösemi inhibe edici faktör (LİF) de dahil olmak üzere beyin endotel hücreleri tarafından salgılanan faktörler astrositik 55,56 farklılaşmasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Ko-kültür kurulması önce, astrositler, glukokortikoid reseptör agonisti hidrokortizon içeren farklılaşma ortama maruz kalan ve ko-kültür ortamı kıvamlandırılmıştır. Hidrokortizon beyin endotelyal hücrelerin sızdırmazlığını artırmak için bilinen ve özellikle 57 sıçan ve fare 58,59 endotel hücreleri BBB modelleri kullanılır. Koşullandırılmış medium 3 gün sonra endotel hücre / astrosit ko-kültür sisteminin alt bölme toplandı ve daha sonraki kullanım için dondurulur. Ko-kültür şartlandırılmış ortamın kullanılması, 2 gün daha uygun paraselüler geçirgenliği ve kültürler arasında da geliştirilmiş yeniden üretilebilirlik ile 3 gün için endotel hücre farklılaşmasının süresi azalır.

Genel olarak, tarif protokol, 0.26 ± 0.11 x 10 cm -3 en birincil hücre bazlı BBB modelleri 22 'e benzer / dakika, 300 ohm üzerinde yeniden üretilebilir bir Teer · cm 2 ve ortalama bir paraselüler geçirgenlik katsayısı Pe (LY) verir 12. Biz mikrodamar enzimatik sindirme önerilen modülasyonu ile, bu metin içinde tarif protokol sıçan omurilik 60 ve farenin beyninden endotel hücrelerine uzatılabilir.

Moleküler ve Fonksiyonel Karakterizasyonu

Buna ek olarakTJ indüksiyon, astrositlerin, aynı zamanda, endotelyal hücreler, beyin 61'deki P-gp olarak akış nakil ekspresyonuna katkıda bulunur. Gerçekten biz BBB modelinde akış taşıyıcı P-gp ifadesini göstermektedir ve biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak, P-gp akış pompa lokalizasyonu polaritesini göstermek ve P-gp etkinliğinin işlevsel tahlili kullanılarak. GLT-1 ifadesi, mikrokapların bazal zar fraksiyonu içinde tespit edilmiştir, ancak kültürlenmiş Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu bulgulanmamıştır. Biz GLT-1 aşağı in vivo koşulları ve western blot analizi ile tespit edilemeyen dolayısıyla ile mukayeseli olarak RBEC kültürde düzenlenmiştir varsayımında. Fazla glutamat nörotoksik olduğu ve in vivo, GLT-1 apikal bölmeye (kan dolaşımı) bazal bölme (parankima) glutamat akışı için sorumludur. Astrosit kültürlerde, GLT-1 ifadesi çok düşüktür ve ortam 62,63 glutamat ilavesi ile indüklenir.

Ayrıca confIRM gibi LRP1, LDLR ve TfR olarak apikal membran akını taşıyıcıları ifadesidir. TfR ve LDLR işlevselliği, daha önce in vitro modelinde BBB 64 içine büyük baş hayvan ile gösterildiği gibi, tek tabaka abluminal tarafına luminal den Tf-Cy3 ve DiLDL arasında bağlanma deneyleri ve nakil ile gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, bu lipid astrositlerden şartı 65,66 bundan başka, in vitro olarak da dahil olmak üzere, astrositler ve beyin endotel hücreleri arasındaki çapraz-karışma teyit fizyolojik beyin kılcal endotel hücreleri üzerinde LDLR ekspresyonunu arttırır gösterilmiştir. Floresan boyalar ile taşıma örneklemek için seçmiş bu Cy3 ve DII spektroflorimetrik analiz laboratuvarlarında en mevcuttur, ve in vitro BBB modelleri doğrulamak için yararlı olduğunu düşünüyor gibi. Bununla birlikte, floresans, radyoaktivite ölçümü daha az duyarlıdır ve önemli verileri elde etmek için deneyler sayısında bir artış gerektirir.İdeal olarak, Tf ve LDL bu tür bir bağlanma / alım ve nakil deneyleri için (genellikle iyot 125), radyo etiketlenmiş bulunmaktadır.

Ayrıca önerilen protokol ile elde edilen farklılaşmış endotelyal hücre tek-tabakalı CCL2 serbest bırakılması ve BBB açılmasıyla ortaya koyduğu gibi, TNF-α neden olduğu inflamasyon yanıt olduğunu göstermektedir. CCL2 (MCP-1) ve onun reseptörü CCR2 multipl skleroz, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) 67, CNS travma 68 ve nöroenflamatuar koşullar altında 69,70, CNS içine lökosit göçü mediatörleri olarak bilinmektedir CNS patolojilerde rol oynar. BBB açılış CCL2 konsantrasyonu üst (apikal) ve alt (bazal) bölmeleri hem arasında dengelenmesini sağlar, çünkü test protokolü ile, CCL2 bir polarize salgılanması üzerinde sonucuna varamayız. Sonuç olarak, açık bir şekilde, 24 saat (Şekil 5A) de apikal bölmeye Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu tarafından üretilen CCL2 miktarını hafife.

Genel Bakış ve in vitro Modeller BBB Sınırlamalar: Ben n Vivo karşı İn Vitro ve Kemirgen İnsan Karşılaştırmalar karşı

In vitro BBB pasajda etkili olduğu pek çok umut verici bir merkezi sinir sistemi ilaçları, genellikle insan dışındaki türlerden izole edilmiş hücrelere göre BBB vitro modellerde ikinci nedeniyle tahmin eksikliği klinik çalışmalarda başarısız oldu. Protein ağları, sinyal iletimi, taşıyıcı ve reseptörlerin mekanik yönlerini okuyan geldiğinde bizim bilgimiz için, in vitro BBB modeller muhtemelen daha akıllı olan. In vitro olarak incelenecek her bir mekanizma, yol ya da hedef aynı hayvan türleri tamamlayıcı çevresel etkilere (diğer hücre tipleri, kimyasal maddeler, proteinler) tarafından düzenlenmesi için karakterize edilmiş ve in situ çalışmalar için kombine edilmelidirVe kısıtlamalar ve dikkatli insanlar izole mikrodamarlar ve endotel hücreleri ile, olası aşağıda uyarılmış zaman.

In vitro BBB modeller vücut yönetmelik izole otonom sistemleri olarak görülebilir, ancak hala önemli in vivo özellikleri ve çevresel uyaranlara tarafından düzenlenmesi için bir potansiyele sahip. Endotel hücre mono tabakaları nöro-vasküler glia birimi (NGVU) önemli bileşenleri bir dizi eksikliği ve kan ve vücut düzenleme izole edilir çünkü hiç "ideal" in vitro modelle BBB henüz 71,72,73 önerilmiştir. Perisitlerin 74,16 veya 17,18 nöron ya da plastik kaplama veya endotelyal göre en yaygın ve "kolay hale" in vitro BBB modellerde hücre büyümesi için kullanılan kültür ortamı ve serum için kullanılan hücre dışı matrisin farklı bileşenlerin eksikliği astrositler ile farklılaşmış hücreler protein sentezleme i modüle edebilirn in vivo durumda 75 ile karşılaştırılması. Bu modeller in vivo görüntülenen birçok taşıyıcıları ifade, ama hepsi olabilir. Bazı durumlarda, ilk izole edilmiş taşıma parametreleri kılcal (in vivo duruma yakın) olarak teyit edildi ve sonra da hücre kültür sistemleri 76,61 incelenmiştir.

Moleküler biyoloji araştırmaları izin verdi, aynı türlerden izole edilmiş kılcal ve düşük geçiş endotel hücre kültürlerinde, gen ekspresyonu ve protein karakterizasyonu ve farklı türler arasında, çoğu zaman, kemirgenler (fareler ve sıçanlar) ya da inek ve domuz küçük hayvanlardan İnsanlarda 77,78,75,15 için karşılaştırılması. In vivo ve in vitro beyin mikrovasküler endotel hücreleri arasında Transkriptomik karşılaştırma farklı şekilde eksprese edilen ve en sık önemli in vitro olarak azaldı çok sayıda gen transkript gösterdi. Böyle TfR ve pr olarak akını taşıyıcıları kodlayan transkriptvezikül ticareti karıştığı oteins esas hücrelerde endositoz ve veziküler taşımacılığında genel bir azalmayı işaret kültürlenmiş beyin endotelyal hücrelerinde aşağı regüle edilir. Saflık (puromycin tedavisi) ve hidrokortizon ile tedavi açısından Kültür manipülasyon bir daha "in vivo gibi" gen ekspresyon profil 77 geri yardımcı olabilir. Transkriptomik çalışmaları da., Insan endotel hücreleri ve astrositlerde ko-kültür içeren In vitro BBB modelleri 15 tarif edilmiştir ayrıca in vitro BBB modellerinde 75 kemirgeninizde dayalı insanlarda ilaç alımı hakkında tahminler karmaşık türler arasında önemli farklar saptandı. Ilgili olsa da post-mortem insan dokusuna düzenlenmiş erişim gerektiren ve heterojenite yaş, hastalık, ve muhtemelen tıbbi bağlı olarak, insan beyin endotel hücreleri kalite / özelliklerinde olduğu gibi bu modeller, düzenli olarak uygulanması daha zordur treatmendonörlerin t. Çabalar iyi fizyolojik, anatomik ve in vivo BBB fonksiyonel özelliklerini yeniden yeni in vitro modeller geliştirmek için yapılması gerekir. Üç hücre tiplerini içeren Co-kültürler derece kısıtlayıcı ve rutin uygulamak zor görünür. Bugüne kadar, en karmaşık in vitro BBB modeller, astrositler ile damar benzeri organizasyon içerir ve kan akışını taklit eden 75,79,80,81,82 ortamının akışı dahil dinamik modelleri, in vitro (DIV-BBB) olan 83,84,85. Beyin endotel hücreleri bir akışına maruz kaldıkları zaman, üretilen kesme gerilmesi örneğin hücre bölünmesi, farklılaşması, migrasyonu ve apoptoz 80 gibi endotel hücre fizyolojisinde alan farklı genlerin ekspresyonunu modüle eden hücre yüzeyinde mechanotransducers aktive eder. In vivo, kesme stresi kan akışı ile üretilen bir kurulmasına izin veren hücre temas okuyun, mitotik tutuklama sorumludurkan damarlarının 80 endotel hücre tek-tabakalı. Normal insan beyin mikrovasküler endotelyal hücrelerin genomik ve proteomik analiz BBB endotel fizyolojisi 84 kesme geriliminin etkisini gösterdi. Kesme gerilmesi CYP450 tarafından aracılık edilen 75,86, 75 oksidasyon enzimleri ve hücre canlılığı, endotel hücre yapışmasının daha yüksek bir derecede, dışarı verme pompası indüksiyon ve taşıyıcıları 75, glikoz metabolizmasının düzenlenmesi ve daha iyi bir polarizasyon sorumludur ifadesini arttırarak paraselüler geçirgenliğin düzenlenmesinde occludin ve ZO-1 87,75,80 ve buna bağlı olarak yüksek TEER gibi arası bağlantı elemanları kodlayan genlerin yaklaşık 1,500 - 2,000 cm ohm · 2, in vivo olarak bilinen en yakın 79,80 parametreler

Biyoteknoloji ve ilaç sektöründe, ilaç ya da yüksek verimli tarama (HTS) ve hayvan deneylerini azaltma çabalarının rutin tarama, ledset-kadar rutin daha zor olmaya devam beyin endotel hücreleri birincil kültür yerine kullanılmak üzere, farklı hücre çizgilerinin geliştirilmesi için. Çoğu durumda, beyin endotel hücrelerinin primer kültürleri, retroviral vektörler 88,89,75 kullanılarak plazmid DNA ile transfeksiyonu veya enfeksiyon yoluyla, ölümsüz bir gen (ya da SV40 polyoma virüsü, büyük T-antijeni veya adenovirüs E1A) ile transduse edilmiştir. Serebral kökenli çeşitli endotel hücre çizgileri gibi RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS veya rBCEC4 fare hücre çizgileri 88,75, b.End3 fare hücre hattı 90,75, PBMEC/C1 olarak geliştirilmiştir - 2 domuz hücre çizgisi 87,75 ve hCMEC/D3 insan hücre hattı 89,75. Diğer modeller, Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) veya CaCo2 hücresi çizgileri 12,75 olmayan serebral kaynaklı hücreler dayanmaktadır. Farklı insan beyin endotel hücre çizgileri arasında, yaygın olarak alıntı hCMEC/D3 edilmiştird ve 2005 91,92 yılında kuruluşundan bu yana BBB bir model olarak geliştirilmiş. Birincil kültürler, hücre çizgileri bu avantaj ve sınırlama gibi. Bu, primer kültürlerinde daha işlemek için daha kolay olan uzun bir ömrü vardır, iyi karakterize edilmiştir ve büyük ölçekli deneyler arasında yeniden izin verir. Ancak, hücre hatları, dokuya özgü işlevler vermek çevre düzenleme kaybeder ve in vivo 75, 89 hücrelerden oldukça farklı bir molekül bir fenotip elde edebilirsiniz. Özellikle, hücre hatları mevcut azaltılmış sızdırmazlık, düşük TEER ve gösteri taşıyıcı profil varyasyon 75,89 üretilen tekkatmanları. Böylece primer hücrelerde hayvan deneyleri ya da çalışmalar genellikle katma karmaşıklığına rağmen tercih edilir.

Acknowledgments

Vect-Horus mali destek Fonds Benzersiz Interministériel (FUI / MEDUL projesi) ve Vect-Horus ve Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, anlık ve PREVENTAD işbirlikçi projeler) den UMR7259 laboratuvar kabul ediliyor . UMR7259 laboratuvar ayrıca CNRS gelen ve Aix-Marseille Üniversitesi'nden İşletme mali destek kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22 (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34 (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85 (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316 (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8 (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119 (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42 (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259 (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53 (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110 (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56 (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324 (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283 (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206 (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55 (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10 (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6 (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10 (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74 (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22 (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73 (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311 (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73 (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224 (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12 (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6 (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13 (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21 (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200 (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97 (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018 (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19 (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37 (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15 (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126 (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138 (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15 (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5 (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6 (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40 (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17 (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8 (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14 (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339 (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8 (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12 (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. , (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49 (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 312-328 (2008).

Tags

Medicine Sayı 88 sıçan beyin endotel hücreleri (RBEC) fare omurilik sıkı bir bağlantı (TJ) reseptör-aracılı taşıma (RMT) düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) LDLR transferrin TfR P-glikoprotein (P -gp) transendoteliyal elektriksel direnç (TEER),
Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molino, Y., Jabès, F.,… More

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter