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Medicine

Establecimiento de un Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Abstract

La barrera hematoencefálica (BBB) ​​regula específicamente flujo molecular y celular entre la sangre y el tejido nervioso. Nuestro objetivo era desarrollar y caracterizar una singénico de rata altamente reproducible modelo in vitro de la BBB usando co-cultivos de células endoteliales de cerebro de rata primarios (DRECEI) y astrocitos para estudiar los receptores implicados en la transcitosis a través de la monocapa de células endoteliales. Los astrocitos fueron aislados por disección mecánica después de la digestión con tripsina y se congelaron durante el co-cultivo posterior. DRECEI se aislaron a partir de cortezas de rata 5 semanas de edad. Los cerebros se limpiaron de meninges y la sustancia blanca, y se disociaron mecánicamente después de la digestión enzimática. A partir de entonces, el homogeneizado de tejido se centrifugó en albúmina de suero bovino para separar fragmentos de vasijas a partir de tejido nervioso. Los fragmentos de vasijas fueron sometidos a una segunda digestión enzimática de las células endoteliales gratuitas de su matriz extracelular. Las células contaminantes restantes, tales como pericitos fueron fás eliminado mediante siembra de los fragmentos de microvasos en medio que contenía puromicina. Luego se pasaron sobre filtros de co-cultivo con astrocitos cultivados en el fondo de los pocillos. DRECEI expresa altos niveles de unión estrecha (TJ) proteínas tales como ocludina, claudina-5 y ZO-1 con una localización típica en los bordes de la celda. La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de las monocapas endoteliales del cerebro, lo que indica la estanqueidad de TJs alcanzó 300 ohmios · cm 2 en promedio. Los coeficientes de permeabilidad endotelial (PE) para lucifer amarillo (LY) fue altamente reproducible con una media de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Las células endoteliales del cerebro organizados en monocapas expresaron la eflujo transportador de la P-glicoproteína (P-gp), mostraron un transporte polarizado de rodamina 123, un ligando de la P-gp, y mostraron el transporte específico de transferrina-Cy3 y DiILDL través de la monocapa de células endoteliales. En conclusión, le ofrecemos un protocolo para la creación de un in vitroAcreditación modelo que es altamente reproducible debido a los métodos de control de calidad, y que sea adecuado para la investigación sobre de BBB transportadores y receptores.

Introduction

Muchos medicamentos desarrollados para el tratamiento de Sistema Nervioso Central (SNC) no son capaces de llegar al parénquima cerebral en concentraciones terapéuticamente relevantes. La acreditación protege el tejido nervioso cerebral de la fluctuación de la composición del plasma, de los agentes patógenos, y mantiene la homeostasis del parénquima cerebral mediante la restricción de flujo no específica de iones, péptidos, proteínas e incluso las células dentro y fuera del cerebro 1.

Características de BBB son inducidos y mantenidos por la proximidad íntima y la diafonía entre las células endoteliales de microvasos cerebro clase especializada y elementos vecinos de la unidad de neuro-glia-vascular (NGVU) tales como neuronas, células gliales (más precisamente astrocito END-pies), y pericitos ensheathed en la membrana basal, que se compone principalmente de colágeno de tipo IV, fibronectina, laminina y proteoglicanos 2,3. Los pericitos cubren aproximadamente el 22 - 32% del endotelio en el nivel capilar y juegan un importantepapel en la regulación de la proliferación endotelial, la angiogénesis y procesos inflamatorios. Las células endoteliales forman una hoja continua que cubre la superficie interior de los capilares. Ellos están interconectados por TJs, que forman una estructura semejante a una correa en la región apical y que contribuyen a la celda de polarización. Los astrocitos regulan de BBB propiedades y son fuentes de factores reguladores importantes tales como el TGF-β, GDNF, bFGF e IL-6. Los astrocitos deficientes en GFAP con funcionalidad incompleta no son capaces de regular de BBB propiedades 4. Las neuronas no están directamente involucrados estructuralmente en la formación de la BBB, pero también regulan aspectos importantes de la expresión de la proteína y BBB funciones 5.

Con el fin de estudiar más a fondo la estructura, fisiología y patología de la BBB, los modelos in vitro de la BBB se desarrollaron como herramientas de investigación. Células endoteliales de cerebro se han extraído de diversas especies de implementar en modelos de BBB in vitro basadoen cultivos de paso bajo las primarias de las especies bovina, porcina 6,7 8,9, 10,11,12 rata, ratón 13 y también humanos 14,15. Se sabe que estos modelos a imitar la acreditación in vivo, particularmente cuando se co-cultivaron con células gliales de rata o murino y / o pericitos 16,12, y / o los astrocitos derivados de células progenitoras neurales 17 y / o neuronas 18. Los modelos de laboratorio "en" a menudo se producen a partir de roedores, ya que permiten in vitro / in vivo en experimentos y comparaciones y / o el estudio de las células endoteliales del cerebro producidos a partir de modelos transgénicos 19.

De nuevo desarrollo de modelos in vitro BBB también han sido diseñadas para ayudar a predecir la captación cerebral de los posibles candidatos a fármacos del SNC antes de la prueba in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modelos in vitro de BBB se utilizan generalmente para comparar el transporte de fármacos con: i) la penetración conocido en el SNC o con lOW permeabilidad a través de la acreditación y no hay efectos centrales, y ii) la aparente Pe de los mismos medicamentos medidos en modelos animales de la misma especie. Los fármacos que pasan fácilmente la acreditación son en su mayoría lipófilo y cruzan las membranas celulares endoteliales del cerebro por mediada por lípidos difusión libre (cafeína, carbamazepina, etc.) Los medicamentos transportados negativamente, tal como digoxina, verapamilo o la ciclosporina A se extruyen de forma activa por transportadores de salida endoteliales del cerebro tales como la P-gp. Sin embargo, muchas de las moléculas terapéuticas de nuevo desarrollo son productos biofarmacéuticos, tales como proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales o siRNAs. La mayoría de ellos no cruzan la BBB debido a: i) la ausencia de transportadores específicos, y ii) la capa apretada de las células endoteliales, que impiden que las moléculas de alto peso molecular a partir de someterse a paso paracelular. Con estos límites, las estrategias de "caballo de Troya" han sido implementados utilizando vectores (anticuerpos, péptidos) contra los receptores conocidos en el BBB, involucrados in mediada por el receptor de transporte o transcitosis (RMT), tales como la transferrina (Tf) del receptor (TfR), el receptor de insulina (IR), o miembros de la del receptor de LDL (LDLR) relacionados con la familia del receptor (LDLR, LRP1). Tales receptores se han encontrado en aislados capilares del cerebro y en la acreditación in vivo 24,25. Los perfiles de transcripción para estos receptores, en particular los de la familia LDLR, se analizaron y se compararon entre las células endoteliales cerebrales y células endoteliales de cerebro co-cultivadas con astrocitos o en los capilares cerebrales directamente después de su extracción a partir de cerebro 26. Pardridge 24 abrió el campo con el anticuerpo OX-26 contra el receptor de transferrina (TfR), seguido por anticuerpos contra el receptor de la insulina y el receptor del factor de crecimiento de insulina 27,28. Con estos vectores basados ​​en anticuerpos, ArmaGen Technologies ha desarrollado una tecnología de plataforma Trojan horse molecular acreditación para entregar las drogas, incluyendo las proteínas, a través de la acreditación 29. Lala literatura es rica en datos que muestran la expresión de LRP1 en las células endoteliales del cerebro y su papel como receptor endocítica / carroñero potente. Análisis de transferencia Western sugirió que LRP1 se expresa en fracciones enriquecidas en los capilares del cerebro y en las células endoteliales capilares de cerebro de rata 30. Empresas como Angiochem LRP1 objetivo con vectores de péptidos derivados de la aprotinina que promueven la afluencia de drogas eficientes a través de la acreditación 31. Sin embargo, LRP1 también está involucrado en el transporte activo de Aß y su flujo de salida / autorización de parénquima cerebral a la sangre 32. Estos datos implican LRP1 en un transporte bidireccional través de la BBB en función de sus ligandos. biOasis desarrolla la tecnología de Transcend usando un melanotransferrina proteína para el transporte de productos biológicos, tales como enzimas lisosomales y anticuerpos través de la bbb 33 mientras VECT-HORUS desarrolla vectores de péptidos que se dirigen a la LDLR 34. No se sugiere que los datos de la PRL y LDLR se pueden utilizar para el transporte de difErent moléculas tales como enzimas lisosomales 35,36 o complejos de nanopartículas través de la bbb 37.

Nuestro campo de interés es la administración de fármacos para el SNC usando moléculas de vector y vectorizadas de drogas-candidatos para el tratamiento de enfermedades del SNC. En particular, la administración de fármacos a través de la acreditación tiene que ser considerado en el contexto de la neuroinflamación, un proceso que puede variar en su extensión, pero que es probablemente común a todas las lesiones y enfermedades del SNC, incluyendo la encefalitis, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer, etc neuroinflamación se asocia con la acreditación inflamación y potencialmente con los cambios en la fisiología de la acreditación y la permeabilidad paracelular y teniendo en cuenta que el transporte transcelular se pueden amplificar en condiciones patológicas 38,39,40,41,42,43. Por ejemplo, el TNF-α, ajustar, y otras citoquinas modulan la inflamación, y los experimentos con modelos in vitro en BHE han demostrado que pueden alterar las propiedades paracelulares de the monocapa de células endoteliales 38,39,40 y que el TNF-α también conduce a un aumento en el transporte transcelular de las LDL 41, holotransferrin 42 y lactoferrina 43.

Nuestro objetivo era desarrollar y caracterizar un optimizado y singénico de rata altamente reproducible acreditación modelo utilizando co-cultivos de células endoteliales cerebrales primarios y astrocitos. Utilizamos 5 semanas de edad y neonatales de ratas Wistar para la producción de las células endoteliales del cerebro y la producción de astrocitos, respectivamente. Un desafío fue establecer un protocolo que permite la producción de modelos BBB "semanal reproducibles". Para alcanzar este objetivo, se llevó a cabo todos los pasos del protocolo de producción en días fijos de la semana, a partir de la producción de los microvasos cerebro el miércoles de la primera semana. Las disecciones se realizaron casi todas las semanas en los últimos 3 años. Para mejorar aún más la reproducibilidad de las culturas, se estableció un sistema de aseguramiento de la calidad. Todo reagents y productos químicos fueron referenciados en una base de datos (fecha de entrada, existencias, plazo de caducidad, etc.)

El modelo se caracteriza después de un número de criterios, tales como la organización de las células endoteliales y la pureza, la TEER, LY permeabilidad, respuesta a agentes pro-inflamatorias, la expresión cualitativa y cuantitativa de las proteínas TJ, la funcionalidad de los transportadores de flujo de salida, tales como la P-gp, y receptores involucrado en la transcitosis a través de la monocapa de células endoteliales tales como el TfR o el LDLR.

Protocol

1. Producción de rata astrocitos

Para cada preparación utilice 10 ratas Wistar recién nacidos de ambos sexos.

  1. Sacrificar las ratas cortando cabezas con un par de tijeras y transferirlas de inmediato en un plato de Petri seca bajo una campana de flujo laminar. Eliminar los cerebros del cráneo sin el cerebelo y transferirlos inmediatamente en una placa de Petri que contenía tampón de disección en frío: HBSS suplementado con 1% albúmina de suero bovino (BSA bajo nivel de endotoxina), penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 mg / ml.
  2. Cortar los cerebros en un medio, para separar los 2 hemisferios cerebrales y transferirlos a una placa de Petri limpia con tampón de disección sobre hielo. Cortar el nervio óptico y eliminar las meninges bajo un microscopio estereoscópico.
  3. Lavar las piezas corticales extensamente en 50 ml de tampón de disección en frío.
  4. Coloque los trozos de corteza de 3 cerebros en un tubo Falcon de 15 ml y disociar la pipeta hacia arriba y hacia abajo de un golpele de veces con una pipeta desechable de 10 ml equipado con una punta azul en 6 ml de tripsina 0,05% - EDTA 0,02% durante 5 min a 37 ° C.
  5. Añadir 24 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y los siguientes antibióticos, penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 g / ml, un medio llamado medio de células gliales (GCM), y centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. Se seleccionaron lotes de FBS y validados para el crecimiento y la supervivencia de cutures de astrocitos.
  6. Resuspender el sedimento que contenía las células disociadas en 10 ml GCM y la placa en un 75 cm 2 matraz T (T75). Cambie el medio del día siguiente para eliminar los restos celulares y el ADN. Vuelva a colocar los medios de cultivo dos veces por semana.
  7. Después de 1 semana de la proliferación, agite suavemente las células gliales con un agitador orbital a 60 rpm durante 24 horas a 37 ° C en el GCM. Si el T75 no puede ser colocado en una incubadora con 5% de CO 2/95% de aire a 37 ° C atmósfera humidificada, complementar los medios de comunicación con HEPES 5 mM. Lavar las células dos veces para rquítelo las células microgliales no adherentes.
  8. Tres semanas después de la siembra, se lavan las células dos veces con DPBS sin calcio y magnesio. Añadir 3 ml de tripsina cálida 0,05%-EDTA 0,02%, se incuba a 37 ° C y espere hasta que la capa de células se dispersa (por lo general 5 min). Inhibir la actividad de la tripsina añadiendo 10 ml de GCM, transferir la suspensión de células en un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 120 xg durante 8 minutos.
  9. Resuspender el pellet de astrocitos en el 90% de SFB - 10% de DMSO, transferirlos a crioviales (2 x 10 6 células por criovial) y almacenar en nitrógeno líquido.

2. Aislamiento de cerebro de rata Microvasos

Nuestros procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Marsella y se ajustan a las normas nacionales y europeas (directiva de la UE N º 86/609). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados.

  1. Para cada preparación y para una Experimenter, use de 3 cinco semanas de edad ratas Wistar.
  2. Lunes de la primera semana, preparar 2 matraces T75 mediante el recubrimiento con colágeno de tipo IV y fibronectina, tanto a 1 g / cm 2 en el agua de cultivo estéril (10 ml por T75). Permitir a adherirse a 37 ° C hasta que la siembra de los microvasos.
  3. La mañana del miércoles de la primera semana, la eutanasia a las ratas bajo un flujo cada vez mayor de CO 2 para inducir somnolencia, pérdida de la postura y la interrupción de la respiración, a continuación, seguido por una dislocación cervical. Rocíe las cabezas con etanol al 70%. Cortar las cabezas con un par de tijeras y transferirlos a un plato de Petri seca bajo una campana de flujo laminar.
  4. Eliminar los cerebros del cráneo sin el cerebelo y los nervios ópticos, a continuación, transferirlos a una placa de Petri enfriada en hielo y se llena con tampón de disección en frío (HBSS suplementado con 1% de BSA, penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 g / ml) .
  5. Cortar los cerebros en medio para separar los 2 hemisferios cerebrales y el cerebro medio separado del deEbrain. Transfiera los prosencéfalos en una placa de Petri limpia en el hielo con tampón de disección.
  6. Tomar un par de hemisferios en una nueva placa de Petri con tampón de disección fría para quitar cuidadosamente las meninges de los prosencéfalos bajo un microscopio estereoscópico con N ° 5 pinzas curvas. Luego, limpiar el interior del cerebro para eliminar el edredón de la mielina y obtener una cáscara de la corteza. Estos pasos no deben tomar más de 2 horas para la conservación de tejidos y la supervivencia celular.
  7. Disociar la corteza de 3 cerebros en 6 ml de tampón de disección en frío en un homogeneizador Dounce de 7 ml por 10 golpes arriba y abajo con cada uno de 2 manos de mortero de diferentes autorizaciones, 71 micras seguido de 20 micras.
  8. Divida la suspensión para obtener el equivalente de 1 corteza en 1 ml de un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante.
  9. Se digiere la suspensión de 1 corteza con 1 ml de una solución enzimática que contiene una mezcla de colagenasas / dispasa (60 g / ml de R11; 0,3 U / ml), Tipo de DNasa I (35 g / ml - 20 K unidades / ml) y gentamicina (50 mg / ml) en un agitador durante 30 min a 37 ° C.
  10. Mezclar el 1 digest ml de 1 corteza con 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X y separada por centrifugación dependiente de la densidad a 3.600 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente el disco superior (mielina y el cerebro parénquima) y el sobrenadante a un tubo Falcon de 50 ml limpio y repetir la centrifugación. Mantenga el sedimento resultante contiene los microvasos cerebrales a 4 ° C.
  11. Desechar con cuidado el disco superior y el sobrenadante. Resuspender ambos gránulos resultantes que contienen los microvasos cerebrales con 1 ml de HBSS frío 1X y transferir a un tubo Falcon de 50 ml limpio.
  12. Lavar los microvasos mediante la adición de 20 ml de HBSS frío 1X y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante.
  13. Además digerir los microvasos de 1 corteza con 1 ml de la misma solución enzimática como se describe en el paso 2.9 durante 1 hora a 37 ° C en un SHaker.
  14. A continuación, mezclar los microvasos digeridos de cada uno de los 3 cortezas en un tubo y separar aún más en dos tubos Falcon de 50 ml para obtener extraídos de microvasos el equivalente de uno y medio (1.5) de la corteza por tubo. Añadir 30 ml de tampón de disección en frío y centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA.
  15. Resuspender el sedimento de microvasos en 10 ml de DMEM/F12 complementado con 20% de plaquetas bovina plasma pobre en suero derivado, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 2 ng / ml), heparina (100 mg / ml), gentamicina (50 mg / ml) y HEPES (2,5 mM), llamado medio celular endotelial (ECM) suplementado con puromicina a 4 g / ml.
  16. Tome los frascos T75 recubiertos 2 de la incubadora, aspirar el exceso de recubrimiento y placa los microvasos de cada tubo en un frasco T75 (microvasos extraídos de 1,5 corteza por matraz T75).

3. Purificación y proliferación de la Dirección Regional Primocultures

  1. Purificación: de miércoles a viernes, añadir puromycin a 4 g / ml a los medios de cultivo. Cambie el medio el jueves. El viernes, se lavan las células y añadir puromicina a 2 mg / ml hasta el lunes.
  2. Proliferación: el lunes de la segunda semana, se lavan las células y añadir insulina, transferrina y suplemento selenita de sodio al medio de cultivo hasta que los cultivos alcanzan el 90% de confluencia el miércoles de la segunda semana.

. 4 Diferenciación: Configurar el modelo in vitro acreditación

  1. Lunes de la segunda semana, preparar filtros (polietileno, 12 pozos, de tamaño de poro 1,0 m) por recubrimiento con una mezcla de colágeno tipo IV y fibronectina tanto en 0.5μg/cm 2 en el agua de cultivo estéril (500 l de mezcla en el compartimiento superior y 1,5 ml de agua de cultivo estéril en el compartimiento inferior). Deje que se adhieran a 37 ° C hasta que la Dirección Regional de la siembra.
  2. Lunes de la segunda semana, cinco días antes de que el establecimiento de la co-cultura, descongele los astrocitos de crioviales a 37 ° C y la transferenciaen un Falcon de 15 ml con 10 ml GCM. Centrifugar la suspensión a 120 xg durante 8 minutos a TA.
  3. Resuspender el pellet de astrocitos en GCM y la placa a una densidad de 30 x 10 3 células por cm 2 en placas de 12 pocillos.
  4. Miércoles de la segunda semana, justo antes de la disociación de la Dirección Regional con tripsina, lavar dos veces el filtro pre-recubierto con medio DMEM/F12. Pre-llenar las cámaras con ECM: 1,5 ml en el compartimiento inferior y 0,5 ml en el compartimento superior.
  5. Miércoles de la segunda semana, lavar dos veces la Dirección Regional con DPBS sin calcio y magnesio. Añadir 4 ml de tripsina cálida 0,05% - EDTA 0,02% de solución a 37 ° C por matraz T75 durante 30 segundos exactamente. Luego quite 3,5 ml de solución de tripsina y observar bajo el microscopio. Cuando la capa de células comienza a separarse de la matriz, ayudar a ellos golpeando suavemente el borde del matraz T75 hasta que todas las células están flotando.
  6. Añadir 9 ml de ECM por matraz T75 y transferir a un tubo Falcon de 15 ml. Muy disociar suavemente la célulasuspensión pipeteando arriba y abajo 4 veces con una pipeta de 10 ml equipado con una punta amarilla (evitar la producción de burbujas en la solución). Contar las células en la suspensión (aproximadamente 3 x 10 6 cells/T75) y la placa inmediatamente en filtros de pre-revestidos y precargadas a una densidad alta (160 x 10 células de 3 / filtro, por tanto, aproximadamente 18 filters/T75) (Figura 8 ). El día siguiente (jueves), cambie dos veces el medio del compartimiento superior para eliminar los residuos celulares.
  7. Jueves de la segunda semana, el día antes de la creación del co-cultivo, sustituir el medio de cultivo de astrocitos en 1,5 ml de medio de diferenciación (ECM con hidrocortisona a 500 nm), que se pueden complementar con 1/3 medio del compartimento basal acondicionado de un co-cultivo anterior (3 días de contacto entre las células endoteliales y astrocitos).
  8. Viernes de la segunda semana se define como el día 0 de la diferenciación; reemplazar el medio de cultivo de la conta filtrosnando la Dirección Regional con medio de diferenciación. Transfiera los filtros DRECEI en los pocillos que contienen los astrocitos. En estas condiciones, los modelos in vitro se diferencian y expresan proteínas relacionadas de unión-plazo de 3 días.
  9. Los modelos mantienen su diferenciación óptima durante 3 días más, entre el lunes y el miércoles de la tercera semana.

Representative Results

Protocolo de Producción
El protocolo se puede dividir en 3 fases correspondientes a cambios importantes en la composición del medio de cultivo: (a) Purificación de las células endoteliales de los microvasos, (b) proliferación, y (c) de diferenciación en los filtros (placas de polietileno de 12 pocillos con una porosidad de 1 m) en co-cultivo con astrocitos. Los diferentes pasos del protocolo de producción fueron asignados a determinados días de la semana con el fin de aumentar la reproducibilidad de los cultivos de células primarias (Figura 1). El miércoles de la primera semana, por lo tanto, 9 días antes de que el establecimiento del sistema de co-cultivo, los microvasos se aislaron (Figura 2A). Para purificar las células endoteliales, los cultivos se mantuvieron en presencia de concentraciones decrecientes de puromicina durante 5 días. La mayoría de las células contaminantes (principalmente pericitos) fueron eliminados y el crecimiento de células endoteliales fue más lento y sin modificación de su fenotipo. Husillo-scélulas haped crecen fuera de los fragmentos capilares aisladas de cerebro de rata de la materia gris (Figura 2B). El lunes de la segunda semana, los astrocitos de ratas se colocaron en la parte inferior de las placas de 12 pocillos. Miércoles, DRECEI se añadieron al compartimento luminal de los filtros. Siembra de alta densidad a 160 x 10 3 células / cm 2 (Figura 2C) ayuda a evitar vacíos en la periferia del filtro (Figura 2D) y genera una diferenciación homogénea de la monocapa de células endoteliales. Las células muestran la morfología típica en forma de huso alargado, alinear longitudinalmente, y formar una monocapa uniforme. Jueves, medio de cultivo de astrocitos se cambió para el medio de diferenciación acondicionado y los medios de co-cultivo anterior (Figura 2E). Viernes, DRECEI en filtros fueron cultivadas en medio de cultivo que contiene 500 nM de hidrocortisona y los filtros se transfirieron a placas de 12 pocillos que contienen los astrocitos. En la tercera semana, los experimentos Were a cabo entre el lunes y el miércoles.

RBEC Caracterización y Determinación de Elementos de Monocapa permeabilidad
El DRECEI se caracteriza por la inmunotinción de endotelial y BBB marcadores, así como por mediciones de TEER, permeabilidad de LY y la funcionalidad de los transportadores de eflujo, tales como la P-gp.

DRECEI obtenerse por el método de purificación de puromicina (Figura 1 y 2) crecieron en monocapas continuas no superpuestas que mostraron inhibición del crecimiento en la confluencia y se muestra firmemente adosados, fusiforme y la morfología en forma de huso. Culturas DRECEI expresan marcadores típicos de células endoteliales: mostraron inmunotinción positiva para la molécula de adhesión celular endotelial de plaquetas (Figura 3A; CD31/PECAM) y expresión de factor de von Willebrand (Figura 3B). Sin tratamiento puromicina, RBECs son invadidos rápidamente por pericitos detectados por inmunotinción desminaTaining (Figura 3C). Proteína ácida fibrilar glial (GFAP) expresado por astrocitos (Figura 3D) es un importante marcador de diferenciación de astrocitos. Con el número de alto pasaje, astrocitos pierden su capacidad para inducir la diferenciación de las células endoteliales. Por esta razón, los cultivos de astrocitos se estandarizaron por su tiempo de la cultura y sólo se sometieron a un pasaje.

El cultivo de DRECEI con medio suplementado con hidrocortisona, seguido por cocultivo con astrocitos y con medio desde el compartimiento inferior de co-cultivos anteriores condicionado condujo a una fuerte inducción de interendoteliales TJS en comparación con DRECEI cultivadas solas. Las células expresan la claudina-5, ZO-1 y ocludina proteínas, que se localizan en las uniones célula-célula, como se muestra por inmunofluorescencia (Figura 4B-D) y revelados por análisis de transferencia de Western para ZO-1 y ocludina proteínas (Figura 4E ). La distribución morfológica en c-ELL-a célula contactos en una configuración de cremallera refleja (a) la estanqueidad de la monocapa, (b) el origen cerebral de las células endoteliales de los capilares, y (c) es característica de las células endoteliales cerebrales altamente diferenciadas. Paracelular permeabilidad de la capa endotelial se monitorizó mediante la medición de la TEER y la tasa de afluencia de LY (457 Da) de la parte superior para el compartimiento inferior de los filtros. TEER se midió usando un ENDOHM-12 para las tazas de cultivo de 12 mm conectados a un voltohmmeter EVOM. La TEER de monocapas endoteliales del cerebro, lo que indica la estanqueidad de TJs alcanzó 300 ohmios · cm 2 en promedio (filtros de placas de 12 pocillos, datos no mostrados). El PE para LY (Pe (LY), utilizado como un control de la integridad de la barrera y co-incubadas con los compuestos ensayados) alcanzó un promedio de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (Figura 4F) durante un período de 1 año.

Con el fin de inducir la inflamación de DRECEI se utilizó el PRo-inflamatoria de citoquinas TNF-α en 5 ng / ml durante 24 horas, y siguió a la respuesta inflamatoria mediante la medición de CCL2 (MCP-1) la secreción por DRECEI en el compartimiento superior del sistema de cultivo que se duplicó de 120 ng / ml (no- tratados de control) a 250 ng / ml (Figura 5A). Tratamiento de TNF-α en 5 ng / ml o 50 ng / ml durante 24 horas también abrió la acreditación según lo revelado por Pe (LY) de medición (Figura 5B).

P-gp se visualizó en la Dirección Regional diferenciada por inmunocitoquímica (Figura 6A). Localización de la P-gp es conocido por ser altamente polarizada y se expresa esencialmente en la membrana apical de las células endoteliales 44 mientras que el transportador de glutamato-1 (GLT-1) se encuentra principalmente en la fracción basolateral 45. Para evaluar el grado de polarización de nuestra Dirección Regional culta, proteínas apical y basolateral fueron separados de las preparaciones de membrana plasmática mediante gradientes de densidad de sacarosa 46. Western blot serealizado para evaluar los niveles de expresión de P-gp y GLT-1 en plasma, apicales y preparaciones de membranas basales. Los microvasos recién extraídos de cerebro de rata se utilizaron como controles positivos los más cercanos a la distribución in vivo de estas proteínas (Figura 6B). En ambos microvasos y preparaciones de membrana DRECEI diferenciadas, la P-gp se expresó como una banda de 170 kDa, localizada principalmente en la fracción de membrana apical de F1 (Figura 6B, C). GLT-1 expresión fue de hecho expresado en la fracción de membrana basal F3 de microvasos como una banda de 65-70 kDa, pero no se detectó en el DRECEI cultivadas.

En experimentos paralelos, la actividad funcional de la P-gp en la monocapa de células endoteliales se ensayó usando rodamina 123 (R123) como un ligando. El abluminal a luminal (B a A) de flujo de salida de R123 era 1,7 veces mayor que en la dirección opuesta (Figura 6D). Para demostrar la participación de P-gp, utilizamos inhibidores específicos de P-gp, verapamil (25 M, 30 min de preincubación) y ciclosporina A (1 M, 30 min de preincubación). Con el verapamil y ciclosporina tratamiento, la acumulación de R123 en DRECEI se incrementó 1,6 veces y 2 veces, respectivamente, en comparación con el control sin tratar (Figura 6E).

Receptores implicados en la mediada por los receptores Transcitosis (RMT) Mecanismos
El modelo se caracteriza, además, para la expresión de diferentes receptores potencialmente implicados en mecanismos de transcitosis en la acreditación, tales como el LRP1, LDLR o TfR (Figura 7A).

Estudios de transporte funcionales se realizaron con los ligandos para TfR y LDLR. Vive DRECEI se incubaron con transferrina de rata marcado con Cy3 (Tf-Cy3) durante 180 min a 37 ° C (Figura 7B, C). Cuantificación de Tf-Cy3 absorción y el transporte en la rata modelo in vitro la acreditación mostró que la pendiente de las curvas disminuyó ligeramente más allá de 2.400 picomoless (Figura 7B), lo que sugiere que la unión / absorción fue saturable. Por otra parte, la saturación de la unión / captación se correlaciona con la acumulación de Tf en el compartimiento inferior. Para confirmar esta observación, Tf-Cy3 se incubó a 1.200 picomoles (parte ascendente de la curva) con un exceso de Tf no fluorescente a 4.800 picomoles (meseta / saturación) (Figura 7C). Estos experimentos mostraron una disminución de la acumulación de Tf-Cy3 en el compartimiento inferior y confirmaron un mecanismo saturable típica de la interacción ligando-receptor en nuestro modelo in vitro la acreditación.

Del mismo modo, la funcionalidad de LDLR se demostró por la absorción y el transporte de su DiILDL ligando través de la monocapa de células endoteliales (Figura 7D, E). Vivo RBEC se incubaron con DiILDL durante 30 minutos a 37 ° C. La unión / absorción no se correlaciona con la acumulación de DiILDL en el compartimiento inferior (Figura 7D). Cuantificación de DIILTransporte DL mostró que la pendiente de las curvas disminuyó más allá de 2 g, lo que sugiere que el transporte era saturable y relacionada con el receptor en nuestro modelo. Azida de sodio se añadió a 0,05%, 15 min antes de la incubación DiILDL (Figura 7E). La ausencia de toxicidad de la incubación azida de sodio al 0,05% fue evaluada por Pe (LY) de medición (datos no mostrados). Estos experimentos mostraron disminución de la acumulación DiILDL en el compartimiento inferior. En general, nuestros resultados sugieren RMT para DiILDL en nuestro modelo in vitro BBB.

Otros modelos in vitro de BBB basados ​​en células endoteliales de rata de la médula espinal o el cerebro de ratón
La digestión enzimática con una mezcla de colagenasas / dispasa es uno de los principales parámetros a controlar en términos de viabilidad celular y rendimiento de producción de los microvasos cerebrales. La concentración de enzima y más importante la relación entre la cantidad de enzima con respecto al tejido, NEEDS ser calibrado con precisión entre el cerebro de la rata, rata de la médula espinal y el cerebro de ratones. Densidad de siembra de microvasos y el número de células endoteliales para alcanzar el 90% de confluencia (9 días después de la siembra de los microvasos) estaban vinculados y son parámetros importantes para mejorar el crecimiento celular, limitar el número de duplicación de la población y la calidad de los modelos. Rata microvasos de la médula espinal fueron producidos con el mismo protocolo que el descrito en el presente documento para los microvasos de cerebro de rata (en términos de cantidad de tejido, 2 médulas espinales que corresponden aproximadamente a 1 cerebro) para obtener la misma cantidad de células por matraz T75 dentro de la misma escala de tiempo . Meninges de 5 semanas de edad, los ratones C57Bl6 cerebro eran difíciles de eliminar debido a que se adhieren a la corteza. Un breve tratamiento del cerebro con dispasa aparece para facilitar la eliminación de las meninges. Los parámetros importantes que contribuyen a la producción de reproducibles monocapas de células endoteliales de cerebro de rata, de la rata de la médula espinal y el cerebro de ratón se resaltan y se resumen en laFigura 8.

Figura 1
Figura 1. Diagrama de flujo que resume las principales etapas de la preparación del modelo vitro acreditación en. Las diferentes etapas del protocolo de producción fueron asignados a determinados días de la semana con el fin de aumentar la reproducibilidad de los cultivos de células endoteliales primarias. El protocolo comienza el miércoles de la primera semana, con la producción de los microvasos de 5 semanas de edad ratas Wistar.

Figura 2
Figura 2. Microfotografías de contraste de fase de la Dirección Regional, astrocitos y el sistema de co-cultivo. (A) de 5 semanas de edad fragmentos de microvasos rata Wistar en el momento de enchapado.(B) los cultivos DRECEI de tres días de edad tratadas durante 2 días con la puromicina sustrato de P-gp en 4 mg / ml. (C) monocapas endoteliales confluentes puro a 1 día después de la siembra en los filtros Millipore de una placa de 12 recubierta con colágeno de tipo IV y fibronectina. (D) Homogeneidad de la monocapa de células en la periferia del filtro de inserción. (E) confluentes de cultivo de astrocitos en el día de establecimiento de la co-cultivo mostrando caracterizado la morfología de nido de abeja. (F) Esquema representativo de la co-cultivo sistema con la localización de las fotomicrografías en C, D y E.

Figura 3
Figura 3. Caracterización de las culturas DRECEI por microscopía de inmunofluorescencia. (A) las células endoteliales de cerebro expresan las células endoteliales de plaquetasPECAM/CD31 molécula de adhesión en el borde de la celda, (B) el factor de von Willebrand (vWF) muestra una tinción punteada relativamente, más brillante y más agregado en algunas células que otros, y se concentra en la zona perinuclear. (C) Sin tratamiento puromicina de DRECEI culturas, pericitos son detectados con una inmunotinción positiva para desmina (en verde) y tienen núcleos redondos pequeños característicos. (D) Los astrocitos expresan proteína ácida glial fibrilar (GFAP). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Caracterización inmunocitoquímica de la rata in vitro modelo de acreditación y la permeabilidad paracelular deLY través de la monocapa endotelial. La monocapa celular se inmunotiñó con (A) vimentina para revelar una monocapa confluente de células endoteliales de cerebro con la no superposición de la morfología y las células en forma de huso típico con morfología endotelial y la expresión de las proteínas de unión estrecha (B) claudina-5 , (C) ZO-1 y (D) ocludina, también detectado por Western blot para ZO-1 y ocludina proteínas (E). (F) de la capa monomolecular opresión en el modelo de 12 pocillos acreditación se evaluó midiendo el transporte de amarillo lucifer (LY-CH, sal de dilitio), una molécula hidrófila pequeña (MW 457 Da) que se sabe están retenidos por el BBB. Brevemente, LY se incubó en el compartimiento superior del sistema de cultivo en contacto con las células endoteliales cerebrales durante 60 minutos a 37 ° C. Después de este tiempo, se recogió el medio de el compartimiento inferior y la fluorescencia se cuantificó por análisis fluorimétrico con un spectrofluorimetER con excitación a 430 nm, y emisión a 535 nm. Los resultados se expresan en la permeabilidad o PE en 10 -3 cm / min. La barrera se considera permeable o abierta cuando el Pe de LY está por encima de 0.6x10 -3 cm / min. Durante cada experimento 1 hora, el volumen depurado promedio fue trazado en función del tiempo y de la pendiente estimada por análisis de regresión lineal. La pendiente de la curva de aclaramiento para filtros de control con recubrimiento-IV fibronectina colágeno tipo se denota PSF y la pendiente de la curva de aclaramiento para filtros con monocapas de células endoteliales de cerebro se denominó PST. Se calculó el valor PS para la monocapa endotelial (PSE) a partir de: Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ecuación 1

Los valores del PSE fueron divididos por el área de la porciónmembrana unidades organizativas (1,1 cm 2 para filtros Millipore de placas de 12 pocillos) y el resultado fue el coeficiente de permeabilidad (Pe) con un promedio de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Los resultados se presentan con una representación gráfica de dispersión vertical para n = 90 ensayos (media de n = 3 para n = 6 monocapas por ensayo).

La figura 5
Figura 5. In vitro respuesta del modelo acreditación al tratamiento con el agente pro-inflamatoria TNF-α. El medio de cultivo desde el sistema de cultivo fue reemplazado justo antes del tratamiento de TNF-α en 5 ng / ml en el compartimiento superior para 6 hr, 12 hr y 24 h. Liberación de CCL2 por DRECEI se cuantificó en el compartimiento superior por ensayo ELISA en comparación con el control no tratado. Tenga en cuenta que la MCP-1 niveles aumentan ligeramente como una función del tiempo, Incluso en los pozos no tratados. Integridad de la barrera celular endotelial medida por endotelial de PE para LY Pe (LY) reveló un aumento en la permeabilidad de la monocapa por 24 h de tratamiento con TNF-α en 5 ng / ml o 50 ng / ml en el intervalo de 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min y 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min, respectivamente, en comparación con el control en 0,33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (prueba de la t de Student, p <0,05).

La figura 6
Figura 6. Funciones del transportador de eflujo gp-P y. Expresión del transportador de eflujo gp-P en las células endoteliales del cerebro co-cultivadas con astrocitos por inmunocitoquímica (A) y Western Blot (B & C) La Dirección Regional de polarización. Proteínas de la membrana de la célula se extrajeron con un fraccionamiento de proteínas celulareskit ción. Las membranas plasmáticas se obtuvieron mediante lisis y centrifugaciones diferenciales hipotónicas para eliminar orgánulos y núcleos. Separación de proteínas apical y basolateral de las membranas de plasma se obtuvieron por gradiente de densidad de sacarosa. P-gp se localizó principalmente en la fracción apical (F1), mientras transportador de glutamato-1 (GLT-1) se localizó principalmente en la fracción basolateral (F3). Microvasos purificados antes de chapado se utilizaron como control para la localización in vivo de estas proteínas. Actividad de la P-gp se determinó mediante la medición de la polaridad de transporte de R123, un ligando de P-gp. El flujo de 1 M R123 se midió durante 1 hora a 37 ° C en el luminal-a abluminal (A a B) y en las direcciones-abluminal-a luminal (B a A) opuestos. El mismo experimento se realizó sin la Dirección Regional para evaluar la difusión pasiva a través del filtro de inserción y los datos se normalizaron con respecto a este valor para Pe (R123) el cálculo (véase la Figura 5 (R123) (A a B). Verapamilo (25 M, 30 min de preincubación) y ciclosporina A (1 M, 30 min de preincubación) fueron utilizados como inhibidores de P-gp de referencia. Acumulación R123 en la Dirección Regional se midió después de 2 horas, con o sin la preincubación con los inhibidores de la P-gp (prueba de la t de Student, p <0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 7
Figura 7. Caracterización de receptores implicados en la mediada por el receptor Transcytosis (RMT). (A) La monocapa RBEC diferenciada se immunostained con anticuerpos contra la densidad de receptores relacionados con lipoproteínas de baja 1 (LRP1) y el receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LDLR). Imagen confocal de DRECEI sondeó para la captación de DiILDL, un ligando fluorescente del LDLR y para la captación de rata transferrina-Cy3, un ligando fluorescente de la tinción punteada TfR espectáculo sobre la superficie de la célula, con algunos agrupación en la región perinuclear. (B) Rata de Tf-Cy3 esta en el compartimiento superior que contiene la monocapa DRECEI diferenciado en 75, 150, 300, 600, 1.200, 2.400 y 4.800 picomoles / insertar durante 180 min a 37 ° C (200 l en el compartimiento superior y 1.200 l en el compartimiento inferior). Después de este tiempo, Cy3 fluorescencia se cuantificó en el lisado celular (200 l de PBS 0,1% de Triton X100) y en el compartimiento inferior mediante análisis fluorimétrico con un espectrofluorímetro con excitación a 550 nm y emisión a 570 Nm. Unidades de fluorescencia se transformaron en picomoles utilizando un rango de trabajo lineal. (C) Para los experimentos de saturación, rata Tf-Cy3 esta en el compartimiento superior que contiene la monocapa DRECEI diferenciada en 1.200 picomoles / insertar durante 180 min a 37 ° C con o sin 15 min pre-incubación con 4.800 picomoles / inserto de Tf no fluorescente. El transporte en el compartimiento inferior se cuantificó como en (B) (prueba de la t de Student, p <0,05). (D) DiILDL esta en el compartimiento superior que contiene la monocapa DRECEI diferenciada en 1, 2, 4 y 8 filtros mg / inserción durante 30 min a 37 ° C (200 l en el compartimiento superior y 1.200 l en el compartimiento inferior). Después de este tiempo, Dil fluorescencia se cuantificó en el lisado celular (200 l de PBS 0,1% de Triton X100) y en el compartimiento inferior mediante análisis fluorimétrico con un espectrofluorímetro con excitación a 554 nm y emisión a 571 nm. FluorescentesCence unidades se transformaron en microgramos utilizando un rango de trabajo lineal. (E) Para el transporte experimentos de bloqueo, se añadió azida de sodio al 0,05% 15 minutos antes de la incubación de DiILDL a 2 g / insertar durante 30 min a 37 ° C. El transporte en el compartimiento inferior se cuantificó como en (D) (prueba de la t de Student, p <0,05). La ausencia de toxicidad de incubación azida de sodio al 0,05% fue evaluada por Pe (LY) medida (datos no presentados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. In vitro de BBB modelos de células endoteliales de la médula espinal de ratas o de cerebro de ratón. La mesa altaluces parámetros importantes para la extracción de los microvasos del cerebro de la rata, rata de la médula espinal y el cerebro del ratón. Las microfotografías muestran inmunotinción para ZO1 y occludin en monocapas de células endoteliales preparadas a partir de cerebro de la rata, rata de la médula espinal y el cerebro del ratón.

Discussion

Se describe la aplicación de un protocolo reproducible semanal para el aislamiento y chapado de microvasos cerebrales, después de la purificación y la cultura de DRECEI y la ulterior organización de co-cultivos con astrocitos de rata primarios para generar un modelo de acreditación in vitro con propiedades características BBB.

Establecer con éxito estandarizada en cultivos de BBB in vitro requiere condiciones óptimas en los múltiples pasos secuenciales del proceso. El modelo fue (a) optimizado para obtener la permeabilidad paracelular más baja, que sigue siendo el "santo grial" de los modelos in vitro en BBB, y (b) validado por eflujo y los mecanismos de RMT.

Producción, purificación y proliferación de la Dirección Regional

El mayor reto a la hora de cultivar la Dirección Regional es lograr la reproducibilidad entre diferentes culturas. Estandarización del protocolo requiere herramientas de alta calidad para dissección, los reactivos de alta calidad y el respeto de las fechas de caducidad de reactivos. El experimentador tiene que ser experto en micro-disección bajo microscopio estereoscópico para la eliminación rápida de las meninges y los grandes vasos de la superficie de la corteza. Una vez que los cerebros están aislados y mecánicamente disociadas, uno de los principales retos es la digestión enzimática óptima de los microvasos cerebrales recién aisladas. El tipo y la calidad de los enzimas utilizados es crítica. Se utilizó una mezcla de colagenasas tipo I y II y dispasa a alta concentración con baja variabilidad entre lotes. También son importantes la duración de la digestión enzimática y la relación entre el peso de la concentración de enzima / tejido / volumen de la digestión. El mejor rendimiento de la producción de los microvasos de cerebro se obtuvo con el equivalente de cortezas de 1 cerebro en 1 ml de colagenasas / dispasa mezcla a 60 g / ml durante ambas digestiones, respectivamente 30 min y 1 h.

También crítica es la eliminación de la contaminación de la células (astrocitos y principalmente pericitos). Estas células proliferan a una velocidad más alta que las células endoteliales y no establecen uniones estrechas con este último, lo que impide el establecimiento de una monocapa de células homogénea con buena restricción paracelular. Teniendo en cuenta que las células endoteliales del cerebro expresan niveles mucho más altos de las bombas de eflujo, especialmente la P-gp, en comparación con los otros tipos de células que se encuentran en microvasos, toleran mejor las concentraciones de otro modo tóxicos de los fármacos de ligando de P-gp, mientras que las células no endoteliales se eliminan. Tratamiento Puromicina a 4 g / ml para los dos primeros días fue seguido por dos días más en 2 mg / ml para obtener una buena pureza de las células endoteliales. Esta selección también puede favorecer a las células endoteliales de los capilares en comparación con aquellos de las vénulas, arteriolas pre-capilares o microvasos más grandes, y dar lugar a monocapas estrictas. Además, el uso de suero bovino derivado de plasma pobre es un imperativo para obtener cultivos puros de células endoteliales 47,48. El plasma-dersuero IVED carece de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), que es mitogénico para los fibroblastos, las células del músculo liso y por lo tanto para los pericitos.

Hemos observado que el tratamiento de plástico y filtros con una mezcla de colágeno de tipo IV a partir de ratones y fibronectina humana produce una ventaja significativa, con un aumento de 2 veces el rendimiento de la proliferación en comparación con el colágeno tipo tradicionalmente recomendada I a partir de la cola de rata. Señales importantes para la proliferación celular son proporcionados por la matriz extracelular tales como la integrina y el factor de crecimiento (bFGF) de activación 49. Concentración del tampón y el pH del medio de cultivo se han descrito para impactar positivamente en paracelular estanqueidad 50 y se observó una mejor reproducibilidad entre culturas con la adición de tampón HEPES a 5 mM.

La diferenciación de la Dirección Regional: Co-cultura Establecimiento en Insert Filters

Una vez que las células endoteliales del cerebro han been purificó y han proliferado durante 6 días, se pueden sembraron en placas de filtros. Chapado celular a alta densidad es fundamental para obtener una monocapa perfecto. Una densidad de siembra de 160x10 3 células por 12 filtros de placa así era necesaria y suficiente para obtener una monocapa confluente de 24 horas después de la siembra. Sin embargo, el aislamiento de células endoteliales capilares cerebrales primarios de su entorno es una paradoja en la construcción de un modelo de acreditación in vitro, ya que se sabe que las células primarias, y las células endoteliales de los capilares cerebrales en particular, están fuertemente regulados por su entorno y los factores producidos por inductivos los diferentes tipos de células circundantes. Células endoteliales de los capilares del cerebro cultivadas solas-des diferenciar rápidamente y pierden algunos marcadores específicos endoteliales del cerebro. Por lo tanto, las células endoteliales primarias deben ser utilizados a baja paso (P1) y volver a conectar, al menos en parte, con su entorno mediante co-cultivo con astrocitos o medio acondicionado por astrocitos 47,51. Esto se mantienecierto para la diferenciación de astrocitos como células endoteliales cerebrales y astrocitos están involucrados en dos vías de inducción. El cultivo de la Dirección Regional de astrocitos condujo a una fuerte inducción de TJ interendoteliales 52,23. Los mecanismos moleculares de re-inducción siguen siendo en gran parte desconocido, y la investigación está en curso en varios laboratorios para identificar factores moduladores específicos secretadas por astrocitos, que podrían promover una óptima diferenciación celular endotelial 53,54. Factores secretados por las células endoteliales del cerebro, incluyendo el factor inhibidor de la leucemia (LIF) se han mostrado para inducir la diferenciación de los astrocitos 55,56. Antes de establecimiento de co-cultivo, los astrocitos se expusieron a medio de diferenciación que contiene el glucocorticoide hidrocortisona agonista del receptor, y co-cultivo El medio acondicionado. Hidrocortisona es conocido para mejorar la estanqueidad de las células endoteliales del cerebro y se usa en modelos de BBB especialmente de rata y el ratón 57 58,59 células endoteliales. La medi acondicionadoum se recoge desde el compartimiento inferior del sistema de co-cultivo de células / astrocito endotelial después de 3 días y congelar para su uso posterior. El uso de medio de co-cultivo acondicionado reduce el momento de la diferenciación de células endoteliales a 3 días con la permeabilidad paracelular óptima para 2 días más y también mejora la reproducibilidad entre las culturas.

En general, el protocolo se describe produce una TEER reproducible más de 300 ohmios · cm 2 y un coeficiente medio de la permeabilidad paracelular Pe (LY) de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, similar a los mejores modelos de BBB basados ​​en células primarias 22, 12. El protocolo se describe en el presente manuscrito con la modulación propuesta de microvasos digestión enzimática se puede extender a las células endoteliales de la médula espinal de rata 60 y de los ratones cerebro.

Caracterización molecular y funcional

AdemásTJ inducción, astrocitos también contribuyen a la expresión de transportadores de salida, tales como la P-gp en células endoteliales del cerebro 61. Nos muestran, de hecho expresión del transportador de eflujo de la P-gp en el modelo de la acreditación y demostramos la polaridad de la bomba de eflujo de localización de P-gp mediante enfoques bioquímicos, y de la actividad de P-gp usando un ensayo funcional. GLT-1 se detectó expresión en la fracción de membrana basal de los microvasos, pero no se detectó en DRECEI cultivadas. Nuestra hipótesis es que GLT-1 fue regulado en nuestra cultura RBEC en comparación con las condiciones in vivo y, por consiguiente, no detectable por análisis de Western blot. El exceso de glutamato es neurotóxico e in vivo, GLT-1 es responsable de glutamato de flujo de salida desde el compartimiento basal (parénquima) al compartimento apical (circulación de la sangre). En cultivos de astrocitos, GLT-1 expresión sigue siendo muy baja y es inducida por la adición de glutamato en el medio de 62,63.

También confIRM de la expresión de los transportadores de afluencia en la membrana apical como LRP1, LDLR y TfR. Funcionalidad del TfR y LDLR se demostró con la unión y el transporte experimentos de Tf-Cy3 y DiLDL del luminal hacia el lado abluminal de la monocapa como se muestra previamente con un bovino in vitro modelo de acreditación 64. Curiosamente, se ha demostrado que el requisito de lípidos a partir de astrocitos aumenta la expresión de LDLR en las células endoteliales de los capilares del cerebro 65,66 confirmar aún más la diafonía fisiológica entre astrocitos y células endoteliales del cerebro, incluyendo in vitro. Hemos elegido para ejemplificar transporte con colorantes fluorescentes tales como Cy3 y Dil teniendo en cuenta que el análisis espectrofluorimétrico está disponible en la mayoría de los laboratorios, y puede ser útil para validar los modelos de BBB vitro. Sin embargo, la cuantificación de la fluorescencia es mucho menos sensible que la radiactividad y requiere un aumento en el número de experimentos para obtener datos significativos.Idealmente, Tf y LDL suelen ser radiomarcado (yodo 125) para este tipo de experimentos de unión / de captación y transporte.

También muestran que la monocapa de células endoteliales diferenciadas obtenido con el protocolo propuesto responde a la inflamación inducida por el TNF-α, como se revela por la liberación de CCL2 y la acreditación de apertura. CCL2 (MCP-1) y su receptor CCR2 están implicados en patologías del sistema nervioso central tales como la esclerosis múltiple, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 67, trauma del SNC 68 y se conocen como mediadores de la migración de leucocitos en el SNC en condiciones neuroinflammatory 69,70. Con el protocolo de prueba, no se puede concluir en una secreción polarizada de CCL2 porque BBB abertura permite que la concentración CCL2 se equilibre entre ambos (apical) e inferior (basal) compartimentos superiores. En consecuencia, se subestima claramente la cantidad de CCL2 producido por la Dirección Regional en el compartimiento apical a las 24 horas (Figura 5).

Descripción General y Limitaciones de la acreditación de modelos in vitro: I n Vivo frente a in vitro y roedores frente comparaciones Humanos

Muchos fármacos prometedores del SNC que resultaron eficaces en la acreditación pase in vitro fracasaron en los ensayos clínicos debido a la falta de previsibilidad de los modelos de BBB vitro a menudo basadas en células aisladas de otras especies que no sean humanos. A lo mejor de nuestro conocimiento, los modelos in vitro en BHE son probablemente más predictiva cuando se trata de estudiar los aspectos mecanicistas de las redes de proteínas, la transducción de señales, transportistas y receptores. Cada mecanismo, camino o el objetivo a ser estudiado in vitro tiene que caracterizarse por su regulación por señales ambientales complementarios (otros tipos de células, los productos químicos, proteínas) y se combinaron para estudios in situ con las mismas especies de animales, Y cuando sea posible, con los microvasos y células endoteliales aisladas de humanos, con las restricciones y precauciones evocada a continuación.

En modelos in vitro de BBB tienen que ser vistos como sistemas autónomos, aislados de la regulación del cuerpo, pero aún dotados de grandes propiedades en vivo y un potencial para la regulación de las señales ambientales. No "ideal" in vitro acreditación modelo se ha propuesto todavía 71,72,73 debido a las monocapas de células endoteliales carecen de una serie de componentes importantes de la unidad vascular neuro-glia (NGVU) y se aíslan de la sangre y la regulación del cuerpo. La falta de pericitos 74,16 o 17,18 neuronas o los diferentes constituyentes de la matriz extracelular utilizado para el recubrimiento de plástico o el medio de cultivo y suero utilizado para el crecimiento celular in vitro en el modelos "hechas más fácil" en más común de BBB y basado en endotelial células diferenciadas con los astrocitos pueden modular la expresión de proteínas in comparación con la situación in vivo 75. Estos modelos pueden expresar muchos transportistas se muestran en vivo, pero no todos. En algunos casos, los parámetros de transporte se verificaron primero en microvasos aislados (más cercanos a la situación in vivo), y luego estudió en sistemas de cultivo celular 76,61.

Investigación de la biología molecular ha permitido la caracterización de genes y la expresión de la proteína en microvasos aisladas y cultivos de células endoteliales de paso de bajos de las mismas especies, y entre diferentes especies, lo más a menudo a partir de animales pequeños, tales como roedores (ratones y ratas) o de vaca y cerdo en comparación con los seres humanos 77,78,75,15. Comparación entre Transcriptomic in vivo y en las células endoteliales microvasculares del cerebro in vitro mostraron numerosas transcripciones de genes que son expresados ​​diferencialmente y más a menudo significativamente downregulated in vitro. Las transcripciones que codifican transportadores de afluencia como TfR y proteins implicados en el tráfico de vesículas son downregulated principalmente en las células endoteliales del cerebro cultivadas, lo que sugiere una disminución general en la endocitosis y el transporte vesicular en tales células. Manipulación de la cultura en términos de pureza (tratamiento puromicina) y el tratamiento con hidrocortisona puede ayudar a restaurar un "in vivo como" perfil más la expresión génica 77. Transcriptomic estudios también revelaron diferencias importantes entre las especies que complican aún más las predicciones sobre la absorción del fármaco en seres humanos según los roedores en los modelos de BBB in vitro 75. Modelos in vitro de BBB que implican co-cultivo de las células endoteliales y astrocitos humanos se han descrito 15. Aunque relevantes, estos modelos son más difíciles de poner en práctica de manera regular, ya que requieren el acceso regulado al tejido humano post-mortem y hay heterogeneidad en la relación calidad / propiedades de las células endoteliales de cerebro humano en función de la edad, las enfermedades, y posiblemente médica treatmenT de donantes. Los esfuerzos deben hacerse para desarrollar nuevos modelos in vitro que mejor reproducen la fisiológica, anatómica y las características funcionales de la in vivo BBB. Co-culturas que implican tres tipos de células son muy restrictivas y parecen difíciles de aplicar de forma rutinaria. Hasta la fecha, los modelos más complejos in vitro en de BBB son los modelos dinámicos in vitro (DIV-BBB) que incluyen organización-buque similar en astrocitos y que incluyen un flujo de medio que imita el flujo de sangre 75,79,80,81,82, 83,84,85. Cuando las células endoteliales cerebrales están expuestos a un flujo, la tensión de cizallamiento generada activa mechanotransducers en la superficie celular, que modulan la expresión de diferentes genes implicados en la fisiología de las células endoteliales, tales como la división celular, la diferenciación, la migración y la apoptosis 80. In vivo, la tensión de cizallamiento generada por el flujo de sangre es responsable de la detención de la mitosis en el contacto celular, que permite el establecimiento de unmonocapa de células endoteliales en los vasos sanguíneos 80. El análisis genómico y proteómico de las células normales del endotelio microvascular cerebro humano mostró el impacto de la tensión de cizallamiento en la acreditación endotelial fisiología 84. La tension de cizallamiento es responsable de la supervivencia celular, un mayor grado de adhesión de células endoteliales, bomba de eflujo de inducción y mejor de polarización de los transportadores 75, la regulación del metabolismo de la glucosa 75,86, la oxidación mediada por enzimas de CYP450 75 y la regulación de la permeabilidad paracelular mediante el aumento de la expresión de los genes que codifican para los elementos de unión intercelulares como occludin y ZO-1 87,75,80 y consecuentemente alta TEER alrededor 1500 - 2000 ohm · cm 2, el más cercano a la conocida en vivo Parámetros 79,80

En la industria de la biotecnología y la farmacéutica, la investigación rutinaria de drogas o cribado de incluso elevado (HTS) y los esfuerzos para reducir la experimentación con animales, llevópara el desarrollo de diferentes líneas de células para ser utilizadas en sustitución del cultivo primario de células endoteliales cerebrales que permanecen más difícil de configurar de forma rutinaria. En la mayoría de los casos, los cultivos primarios de células endoteliales cerebrales fueron transducidas con un gen de inmortalización (virus de polioma SV40 o antígeno T grande o E1A de adenovirus), ya sea por la transfección de ADN de plásmido o mediante infección usando vectores retrovirales 88,89,75. Varias líneas de células endoteliales de origen cerebral se han desarrollado como el RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs o líneas de células de rata rBCEC4 88,75, la línea celular b.End3 ratón 90,75, el PBMEC/C1 - 2 línea celular porcina 87,75, y la línea celular humana hCMEC/D3 89,75. Otros modelos se basan en células de origen no cerebral tales como el riñón canino de Madin-Darby (MDCK) o líneas de células Caco2 12,75. Entre las diferentes líneas celulares endoteliales cerebrales humanos, el hCMEC/D3 ha sido ampliamente citard y la mejora de un modelo de acreditación desde su creación en 2005 91,92. Como cultivos primarios, líneas celulares presentan ventajas y limitaciones. Son más fáciles de manejar que los cultivos primarios, tienen una vida útil extendida, están bien caracterizados y permitir la reproducibilidad entre experimentos a gran escala. Sin embargo, las líneas de células pueden perder funciones específicas de tejido, pierda la regulación ambiental y adquirir un fenotipo molecular muy diferentes de las células in vivo 75, 89. En particular, las monocapas generados a partir de líneas celulares presentes estanqueidad reducido, de bajo TEER y variación perfil espectáculo transportador 75,89. Así, los experimentos en animales o estudios en células primarias se prefieren a menudo a pesar de su complejidad añadida.

Acknowledgments

Apoyo financiero a VECT-HORUS se reconoce desde el Fonds Único Interministerial (FUI proyecto / MEDUL) y para Vect-HORUS y el laboratorio UMR7259 de la Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC y proyectos de colaboración PREVENTAD) . El laboratorio UMR7259 también reconoce el apoyo financiero del CNRS y de la Universidad Aix-Marseille.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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References

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Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores
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Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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