Summary
El aprendizaje de nuevas asociaciones de estímulo-respuesta se acopla a una amplia gama de procesos neuronales que se reflejan en última instancia en el cambio de pico de salida de las neuronas individuales. Aquí se describe un protocolo de comportamiento que permite el registro continuo de la actividad de una sola neurona mientras que los animales adquieren, extinguen y readquirir una respuesta condicionada en una sola sesión experimental.
Abstract
Mientras que el tema de la educación ha atraído un enorme interés de los científicos, tanto de comportamiento y neuronales, relativamente pocos investigadores han observado la actividad de una sola neurona mientras que los animales están adquiriendo una respuesta operantemente acondicionado, o cuando se extingue esa respuesta. Pero incluso en estos casos, los períodos de observación por lo general abarcan sólo una única etapa de aprendizaje, es decir, la adquisición o la extinción, pero no ambos (las excepciones incluyen los protocolos que emplean el aprendizaje reversión; ver Bingman et al 1 para un ejemplo.). Sin embargo, la adquisición y la extinción implican diferentes mecanismos de aprendizaje y por lo tanto se espera que estén acompañados de diferentes tipos y / o loci de la plasticidad neuronal.
En consecuencia, hemos desarrollado un paradigma de comportamiento que instituye tres etapas de aprendizaje en una sola sesión de comportamiento y que es muy adecuado para el registro simultáneo de los potenciales de acción de las neuronas individuales. Animales de unre entrenados en una tarea de elección forzada intervalo único que requiere el mapeo de cada uno de dos posibles respuestas de opción a la presentación de diferentes estímulos visuales nuevos (adquisición). Después de haber alcanzado un criterio de rendimiento predefinido, una de las dos respuestas de opción ya no está reforzada (extinción). Después de una cierta disminución en el nivel de rendimiento, las respuestas correctas se refuerzan de nuevo (readquisición). Mediante el uso de un nuevo conjunto de estímulos en cada sesión, los animales pueden experimentar el proceso de adquisición-extinción-readquisición repetidamente. Debido a las tres etapas de aprendizaje ocurren en una sola sesión de comportamiento, el paradigma es ideal para la observación simultánea de la salida de clavar de múltiples neuronas individuales. Utilizamos las palomas como sistemas modelo, pero la tarea se puede adaptar fácilmente a cualquier otra especie capaz de aprendizaje discriminativo acondicionado.
Introduction
El aprendizaje de nuevas asociaciones de estímulo-respuesta en los resultados se acopla a una amplia gama de procesos de plasticidad neural. Estos procesos se reflejan en última instancia, en la salida de pico cambiante de las neuronas individuales. Podría decirse que uno de los paradigmas de aprendizaje más frecuentemente empleado es el condicionamiento del miedo pavloviano realizado con roedores. En este contexto, la adquisición y la extinción de una respuesta condicionada se llevan a cabo dentro de unas pocas docenas de ensayos 2. El rápido desarrollo de miedo condicionado puede ser ventajosa debido a que permite la ejecución de un gran número de animales dentro de un corto período de tiempo. Asimismo, la adquisición y la extinción se pueden observar dentro de unas pocas decenas de ensayos en un solo día en los animales ingenuos 3,4 o repartidos en 2 a 3 días 2,5-8. Sin embargo, los conocimientos adquiridos acerca de los cambios de la actividad neuronal durante el aprendizaje en estos experimentos no se aplican necesariamente fuera del dominio de condicionamiento del miedo. Por ejemplo, el comportamiento dirigido a un objetivo impulsado por la posiciónrefuerzo tiva se modela de forma más adecuada por operante en lugar de procedimientos de condicionamiento pavloviano, y puede, en parte, dependerá de diferentes sustratos neurales 9,10. Además, el condicionamiento del miedo se desarrolla tan rápidamente que las respuestas neuronales a la CS sólo pueden ser observados por unas pocas docenas de ensayos, poner límites severos sobre el análisis de los cambios de la actividad neuronal durante el aprendizaje.
Por desgracia, la adquisición y la extinción de la respuesta operante suele tardar varios días. Esto es perjudicial para las investigaciones neurofisiológicas, porque es muy difícil de registrar la actividad de las células individuales durante más de unas pocas horas. Debido a la gran similitud de las formas de onda de los potenciales de acción registrados extracelularmente, es problemático afirmar que los picos registrados en un solo día se generan a partir de la misma célula que los picos con formas de onda similares registrados en la siguiente 11,12, especialmente en áreas con un alto densidad celular tales como el hipocampo.
(Columbia livia forma domestica) son organismos modelo clásico en la psicología experimental 13-17. Estas aves son capaces de realizar discriminaciones visuales complejas 18, puede adaptarse de forma flexible a los cambios de comportamiento de las contingencias de refuerzo 19,20, y son los trabajadores de forma única ávidos, la realización de ensayos de 1000 con una cantidad mínima de refuerzo. Estas características los hacen especialmente adecuado para los experimentos descritos a continuación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de Ética
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices alemanas para el cuidado y uso de animales en la ciencia. Los procedimientos fueron aprobados por un comité nacional de ética del estado de Renania del Norte-Westfalia, Alemania.
Descripción general del sistema
Operante Cámara Testing
La cámara operante (Figura 1), mide 34 cm x 34 cm x 50 cm. Tres teclas translúcidas de respuesta (4 cm x 4 cm, que se encuentra aproximadamente a 20 cm por encima del nivel del suelo) están empotrados en la pared posterior de la cámara. Los estímulos se muestran a través de una pantalla plana LCD montado detrás de las claves de respuesta. Dos bombillas de 2 vatios ubicados en las paredes laterales proporcionan una iluminación tenue. La cámara se encuentra en un cubículo de atenuación del sonido para enmascarar los sonidos extraños. Altavoces con ruido blanco en todo momento. Alimentación (grano) es proporcionada por una tolva de alimentos situada por debajo de la cientollave er. Hardware Experimental está controlado por código de MATLAB custom-written 21. Los animales son monitoreados constantemente a través de una cámara digital conectada a la pared frontal de la cámara.
Microdrive hecha a la medida
Microdrives que albergan 16 hilos de los electrodos están hechos a construirse en nuestro laboratorio; el diseño está basado en el trabajo de Bilkey y colegas 22,23, y se remite al lector a estos artículos para obtener una descripción detallada. Hemos modificado su diseño para permitir un mayor número de electrodos (16 en lugar de 8, 25 micras alambres de nicrom) y conectamos los cables de los electrodos a través de la cola de plata conductora a la toma headstage. Además, utilizamos sobrerregulación de las puntas de los electrodos para reducir la impedancia y de lograr mejores relaciones señal-ruido (aplicar -3 V para ~ 3 segundos; impedancias deben caer a <100 kW).
Una vez que el Microdrive está montado, los electrodos se cortan a la longitud deseada, consejos son cleaned en un baño ultrasónico (Tergazyme en agua destilada) durante 20 min y se enjuagaron otra 20 min en agua destilada. Baño de oro de puntas de los electrodos debe tener lugar inmediatamente antes de la implantación. Por tierra, se utiliza un electrodo de bola de plata, colocado por encima del cerebelo lateral. Especificación de los materiales se proporciona en la tabla Materiales que acompaña a este artículo.
Una cuestión importante cuando se trabaja con animales se mueven libremente es artefactos de movimiento. Se encontró que los artefactos de movimiento en nuestros configuraciones son en gran parte debido a: a) las impedancias de electrodos de alta (> 500 kW) y B) de fijación imperfecta de los contactos entre el tapón (implante) y el zócalo (headstage) mientras el animal está en movimiento. Una variedad de microconnectors disponibles en el mercado no funciona de manera satisfactoria para la grabación de su libertad de circulación de aves, debido a que el contacto mecánico entre el enchufe y el zócalo se deteriora rápidamente a través de vigorosos movimientos de las palomas (cabeza-meneo, key-picoteo). La mejor conexión mecánica entre el implante y headstage se logró con asambleas headplug de Ginder Científico. Estos conjuntos de enchufe y clavija cuentan con 18 contactos y están firmemente adheridas entre sí por una tuerca redonda.
Electrofisiológico Configuración de grabación
La configuración de la electrofisiología comprende los siguientes componentes: 1) una headstage hecha a la medida con la ganancia unitaria (amplificador operacional) 2) módulos de amplificación diferencial 15 alojados en dos unidades de montaje en rack (DPA-2FS y EPMS-07, respectivamente; npi electronic GmbH, Alemania ), 3) una de analógico a digital de 16 canales (potencia 1401 marca I). Raw señales se amplifican 1.000 x y filtrado paso banda (500-5.000 Hz, 1 filtro de orden st), digitalizadas con una frecuencia de muestreo de 16 a 20 kHz y almacenadas con Spike2 versión 7.06a de procesamiento fuera de línea. Horario de los eventos (como el inicio del estímulo o picotazos clave individual del animal) son capturadas a través de una caja de IO puerto paralelo laboratorio construido (véase Rose; Et al 21) y transmitida al convertidor AD para el almacenamiento junto con los datos neurofisiológicos (ver Figura 1).. Procesamiento sin conexión se describe adicionalmente más adelante.
Generalidades Figura 1. Sistema. Flujo de información es simbolizada por flechas de color. Computer 1 controla el hardware correspondiente a la salida del comportamiento (pantalla de estímulo a través del monitor de pantalla plana, luz de la casa, tolva de alimentación, la luz de alimentación, claves de respuesta) y envía las marcas de tiempo de eventos para el convertidor AD. Computer 2 almacena señales neurofisiológicas obtenidos del convertidor A / D y las marcas de tiempo de eventos recibidos del ordenador 1. La fotografía de la izquierda muestra la cámara de acondicionamiento interior de la cabina de atenuación del sonido. Sus elementos son: 1) la cáscara de atenuación de sonido, 2-4) Tecla de respuestas, 5) de la tolva de alimentos, 6) Luz alimentador 7) luz de la casa, 8) de la cámara de observación.
Forzado-Single-Intervalo-Choice (CFSE) Discriminación de tareas
Para mayor claridad, vamos a describir la tarea final CFSE aquí y luego explicar los pasos necesarios para entrenar a los animales en esta tarea a continuación.
La tarea CFSE se describe en la Figura 2. Después de que haya transcurrido el intervalo entre ensayos (ITI), la tecla central se transilumina verde para un máximo de 5 segundos ('fase de inicialización'). Inmediatamente después de la tercera respuesta del animal dentro de 5 segundos, uno de los diversos estímulos de muestra se presenta en la tecla central durante 2 segundos ("fase de la muestra '; ejemplo estímulos se muestran en el recuadro a la Figura 2). Después de 2 segundos, la tecla central es de nuevo transiluminados verde, y el animal tiene que responder una vez más antes de que se transiluminados las dos teclas laterales ("fase de confirmación"). Dependiendo de la identidad del estímulo mostradoen la fase de muestra, se requiere que el animal para dirigir una respuesta única a la izquierda o la tecla derecha ("fase de elección"). Si se elige el destino correcto, acceder a premiar (grano) se concede por 2 seg. Por lo tanto, el núcleo de la tarea consiste en responder a la tecla de selección izquierda después de la presentación de un estímulo particular en la tecla central, y la respuesta a la tecla decisión correcta después de la presentación de otro estímulo. La razón de que la fase de la muestra se encuentra entre corchetes por una inicialización y una fase de confirmación es mantener la cabeza de los animales frente a la tecla central mientras que el estímulo de la muestra se presenta.
Una vez que los amos de los animales esta tarea para un solo par de estímulos (en adelante, los estímulos "familiar", FS), se presenta con un nuevo estímulo (NS) par en cada nueva sesión, y tiene que aprender cuál de los dos estímulos nuevos es para ser seguido por una respuesta a la izquierda o la tecla elección correcta. La pareja FS se sigue presentando en thOSE experimentos para servir como condición de control adecuado. Un desempeño adecuado en la tarea final se basa esencialmente en la voluntad de los animales para realizar> 1000 pruebas en las probabilidades globales de refuerzo <0,5. Los siguientes párrafos describen un procedimiento de entrenamiento en la que complejidad de la tarea se incrementa gradualmente hasta que el animal alcanza el nivel de la CFSE; al mismo tiempo, hay que aumentar para asegurar un alto rendimiento en la tarea final probabilidad de refuerzo y el número de ensayos por sesión.
1. Entrenamiento Animal
- Restricción de la Alimentación
- Pesar los animales después de al menos dos semanas de acceso libre a la comida. Tome este peso como el peso de la lactancia de forma gratuita. Restringir el acceso a los alimentos en los próximos 1-2 semanas hasta que los animales alcanzan el 85% de su peso en periodo libre.
- Es crítico que las palomas mantener una apariencia física saludable y actividad normal durante toda la duración de todo el experimento. Aello, un seguimiento cuidadoso de la apariencia y el peso de los animales a través de toda la duración de la formación y las pruebas de comportamiento. Pesar los animales antes y después de cada sesión experimental para evaluar la ingesta diaria de alimentos. Suministrar alimentos adicionales si es necesario para evitar una mayor pérdida de peso. Proporcionar un acceso sin restricciones a los alimentos durante el fin de semana.
- Automodelado
Automodelado sirve para habituar al animal a la cámara experimental y establecer la respuesta condicionada.- Presentar un estímulo visual 5 segundos (en adelante, el estímulo de la inicialización, IS) en la tecla central. Inmediatamente después de la terminación de la SI o un solo beso de la clave de respuesta (lo que ocurra primero), apagar iluminación de las teclas y el presente premio de comida (2 segundos de activación de la tolva de alimentación).
- Mantenga el ITI considerablemente más largo que el tiempo de presentación de la muestra para facilitar el aprendizaje 24. Utilice los valores de 120 segundos para el ITI y ejecutar 40 pruebas por día. Luego vuelva a utilizar el IScomo el estímulo clave de inicialización, confirmación, y la elección en la tarea final (véase la Figura 2). Esta fase de la capacitación se llevará a los animales de una semana aproximadamente.
- Una vez que el animal responde de forma fiable (en> 85% de los ensayos), disminuya el paso a paso ITI a 10 segundos y el tiempo de presentación de la muestra a 2 seg. Al mismo tiempo, aumentar el número de respuestas requeridas para el refuerzo a 3 (relación fija de 3, FR 3). Además, aumentar el número total de ensayos por día. Elija parámetros de tal manera que el animal es entrenado todos los días durante aproximadamente 1 h. Esta fase de formación tendrá una duración de aproximadamente 2 semanas.
- Repita los pasos 1.2.1 - 1.2.3 para las teclas de respuesta izquierdo y derecho hasta que los sujetos responden de forma fiable a la SI en las 3 llaves. Ensayos alternativos con la activación de la izquierda, derecha y tecla central azar.
- Ahora presentan el IS por primera vez en el centro y luego, condicionado a una respuesta, ya sea en la tecla lateral (omitir refuerzo para elcentrar respuesta clave). Claves alternativas activados secundarios al azar de un ensayo a otro. Terminar ensayos en los que el sujeto no responde a la tecla central después de 5 seg. Repita hasta que el animal realiza de forma fiable (~ 3 días).
- Introducir 2 nuevos estímulos que más tarde servirán de FS en la tarea final (véase la Figura 2, la inserción, por ejemplo). Repita los pasos 1.2.1 - 1.2.3 con estos estímulos. En respuesta se establecerá más rápidamente que con el primer estímulo, generalmente dentro de 4 días.
Figura 2. Ilustración del paradigma de comportamiento. Después de una ITI de 5 segundos, la tecla central se transilumina verde para un máximo de 5 segundos (inicialización). Si el animal responde 3x dentro de estos 5 seg, 1 de los 4; Muestra los estímulos se presentan en la misma posición. Después de un tiempo de presentación de la muestra fija de 2 segundos durante el cual el animal tiene que responder al menos una vez, la clave de picoteo central se transilumina verde de nuevo (de confirmación). Después de otro beso, las teclas laterales 2 están transiluminados verde. El sujeto indica su elección por responder una vez a una de las teclas laterales. Durante la adquisición y readquisición, las respuestas correctas son seguidos por 2 seg acceso a los alimentos acompañados por la activación de la luz de alimentación, o la activación de la luz de alimentación solo. Si no es correcto, luces de la casa se apagan durante 3 segundos. Durante la extinción, tanto las respuestas correctas e incorrectas al estímulo extinción siguen siendo intrascendente. El recuadro muestra ejemplo novedosos y de estímulo familiarizado pares.
- Formación de un solo intervalo de elección forzada (CFSE) Tarea para Familiar Estímulos
- Establecer la secuencia completa de la inicialización, la muestra, de la confirmación, y la elección: en cada ensayo, presente fiRST IS (FR 3), a continuación, cualquiera de las dos FS (2 segundos de duración determinada), y de nuevo el IS (FR 1). Utilice un diseño por petición de decisión: en cada ensayo, transiluminar sólo la tecla opción que es correcta para el FS dado. Esta fase de la formación debería tener aproximadamente 1 semana.
- Una vez que el sujeto realiza de forma fiable (> 85% de respuestas a la tecla lateral respectivo), introducir pruebas de libre elección (las dos teclas laterales transiluminados durante la fase de elección). Si el animal responde al lado correcto, proporcionar acceso a los alimentos durante 2 seg. Las respuestas incorrectas son seguidos por el castigo de tiempo de espera (luces de sala off durante 2 segundos). Si no se da respuesta a menos de 3 segundos, dar por terminado el juicio y reinicie ITI. Animales suelen aprender estos subcomponentes de la tarea dentro de 2 semanas.
- Poco a poco aumentar la fracción de los ensayos de libre elección durante las sesiones posteriores del 20% al 100%.
- Si el sujeto realiza> 90% de aciertos en pruebas de libre elección, disminuir la recompensa de probabilidad para las respuestas correctas a 0,5mientras que en paralelo aumentar el número de ensayos por sesión a 1000. No cambie los parámetros de cada día / sesión, pero elegir de forma flexible en función del nivel de rendimiento de la materia relativa a las omisiones de inicialización y el porcentaje de respuestas correctas. Esta fase de formación tendrá una duración de aproximadamente 4 semanas.
- Las palomas tienden a rechazar la respuesta a estímulos no familiares. Por lo tanto, una vez que el animal realiza confiablemente> 1.000 ensayos, respuestas autoforma a un gran conjunto de estímulos visuales (ver sección 1.2). Sin embargo, no preexpose los estímulos visuales destinados para su uso posterior como nuevos estímulos en el paradigma final, pero las pantallas de color uniforme.
- Tarea final de un solo intervalo de elección forzada, con estímulos nuevos en diferentes condiciones de refuerzo
- Calentamiento
Deje que el sujeto realiza 50 ensayos con sólo el FS. Establecer recompensa probabilidad para estos estímulos a <1 (por ejemplo, 0,5 a 0,8) durante todas las fases para evitar la saciedad prematura y,Por lo tanto, la falta de motivación para responder. - Etapa de adquisición
Ensayos al azar alternas con presentación de FS y NS. Asignar diferentes claves de respuesta sean más exactas para los dos NS y reforzar cada respuesta correcta. Calcular el porcentaje de respuestas correctas, como un promedio móvil de los últimos 120 ensayos. Adquisición se considera completo una vez que el rendimiento de cada uno de los NS supera el 85%, pero no antes de un mínimo de 150 ensayos se han ejecutado. - Etapa de Extinción
Deje de reforzar las respuestas incorrectas correctas y castigar a un NS azar (estímulo extinción). Comienza la fase de readquisición cuando correcta de responder a los estímulos extinción cae por debajo de 60% y el animal ha experimentado por lo menos 150 ensayos en esta fase en total. - Fase de readquisición
Una vez más reforzar correcta y castigar las respuestas incorrectas al estímulo de extinción, ya que durante la fase de adquisición. Terminar la sesión cuando el rendimiento de este estímulo supera el 85% y el ánimals realizaron al menos 150 ensayos en esta fase en total.
- Calentamiento
2. Electrofisiología
- La implantación de electrodos
Cirugía de implantación se lleva a cabo después de animales repetidamente (3-4x) completado toda la secuencia de adquisición-extinción-readquisición y se describe en más detalle en otra parte 25.- Coloque 5-6 microsrews de acero inoxidable en el cráneo para el anclaje de un montaje de cabezal de cementación dental incluyendo el Microdrive.
- Lleve a cabo una craneotomía justo por encima de la región del cerebro de intereses; a continuación, diseccionar cuidadosamente la dura y bajar los electrodos en la posición deseada.
- Antes de anclar el Microdrive en la cabeza montar, aplicar vaselina alrededor de la cánula guía; esto evitará cemento dental desde que encierra el tubo de guía.
- Utilice un electrodo de bola de plata aislada colocado debajo del cráneo que cubre el cerebelo como del suelo.
- Proporcionar animales con analgésicos (Carprofeno, 10 mg / kg, inyecta dos veces al día) durante tres días después de la cirugía. Permitir que los animales se recuperen durante al menos 2 semanas.
- Grabaciones Mientras Animales realizar la tarea
- Utilice un nuevo par de estímulos novedosos para cada sesión y avanzar electrodos al menos 125 m (media revolución del tornillo de accionamiento) antes de comenzar. Si no se observan los potenciales de acción de suficiente relación señal-ruido, abortar la sesión, coloque el animal en la jaula y volver a intentarlo al día siguiente.
- Coloque el cable de headstage de tal manera que no interfiera con el picoteo normal del animal y de comportamiento de alimentación. Esto se puede conseguir conectando el cable con varias correas elásticas a la parte superior de la cámara de acondicionamiento y habituar a las aves para el cable conectado para algunas horas.
- Si está disponible, hacer uso de un conmutador para proporcionar mayor libertad de movimiento para las aves.
- Análisis de señales Desconectado
- Band-pculo-filtro de todos los canales de 500 a 5000 Hz con pendiente roll-off fuera de línea con Spike2. Extraer los picos con umbrales de amplitud y ordenarlos manualmente empleando el análisis de componentes principales.
- Examine ordenar los resultados con código MATLAB custom-written (disponibles en MATLAB Central de Exchange, File ID # 37339 del archivo). Una sola unidad bien aislada (Figura 3) debe cumplir con todos los siguientes criterios: a) un grupo claramente separados en el espacio de componentes principales, b) no hay señales de múltiples unidades cuando todas las ondas grabadas se superponen y se representan en el mapa de calor (Figura 3A ), c) distribuidos simétricamente amplitudes de onda pico (Figura 3B), d) la grabación estable durante toda la sesión como lo demuestra la amplitud inmutable espiga (Figura 3C), e) no hay o muy pocos eventos de pico que se producen durante el período refractario del pico anterior (Figura 3D), y una relación señal-ruido (SNR) de al menos 2 (SNR es aquí defined como la diferencia entre el mínimo y el máximo de la forma de onda de pico promedio, dividida por la anchura recortado de la banda de ruido (2,5 º y 97,5 º percentiles de la distribución de los valores de la primera bandeja de todas las formas de onda)). SNR de la unidad mostrada en la Figura 3 es 3,9.
- Inspeccione canales prima fuera de línea para los artefactos relacionados con el movimiento. Deseche los canales cuando esté indicado.
- Artefactos eléctricos que ocurren durante el picoteo pueden en raras ocasiones pueden confundir con las formas de onda de pico adecuados. Prueba de la contaminación de las grabaciones mediante el examen del histograma de tiempo de pico cuenta en relación con cada beso clave (histograma peri-picotea tiempo, PPTH, Figura 3E) registrada. Artefactos inducidos picoteo-aparecen como un pico en el histograma estrecha (± 50 ms) a tiempo 0. Como una comprobación adicional, trazar las formas de onda de todos los eventos registrados pico putativos dentro de ± 20 ms de un beso clave por separado y compararlo con pico formas de onda detectadas outside esta ventana (Figura 3F).
Métricas de la Figura 3. Calidad para el aislamiento unidad. A) Mapa de calor de los valores de tiempo de tensión todas las formas de onda. B) Distribución de (Azules) valores de tensión de todas las formas de onda máxima (rojo), mínima (verde), y el ruido. Las distribuciones están bien separados, lo que indica un excelente aislamiento unidad. C) tasa espontánea de fuego (rojo, calculada a partir de segmentos de 2 segundos en todos los intervalos entre ensayos) y amplitudes pico (pico a pico) como una función del tiempo en la sesión. Ambas curvas se suavizan con una función de vagón (ancho: 50 puntos de datos) D) Distribución interspike-intervalo para esta unidad.. Ancho de intervalo, 10 ms (recuadro: 1 ms). Intervalos muy cortos son casi ausente (<0,1% de los intervalos de por debajo de 4 mseg). <strong> E) PSTH dispara a picotazos clave. Los recuentos de eventos cerca de la tecla picotear (± 20 ms) se destacan en rojo. F) Las 157 formas de onda registradas dentro de ± 20 ms de los eventos clave Peck. Las formas de onda se comparan favorablemente con la forma general de forma de onda se muestra en el panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Comportamiento
Figura 4A muestra el rendimiento de comportamiento de un animal en una sesión de ejemplo. El nivel de rendimiento del animal alcanza criterio para NS 2 dentro de los 180 ensayos (45 presentaciones de estímulo) y está cerca del 100% para el NS 1 desde el principio. Esta estrategia - primera respuesta a la misma clave tanto para los nuevos estímulos, y luego ajustando respuestas para uno de los estímulos - es lo más a menudo observado como inicial aleatoria responder a ambos NS. En esta sesión, el NS 2 se eligió aleatoriamente a someterse a la extinción, lo que significa que todas las opciones siguientes este estímulo siguen siendo intrascendente (transición entre las etapas de aprendizaje se indican mediante líneas de puntos verticales negras). Durante la extinción, el rendimiento disminuye para el estímulo de extinción, pero se mantiene alta para el otro NS. Criterio que se alcanza en el juicio 370. Las respuestas correctas e incorrectas están reforzados y castigados otra vez (readquisición) y nivel de rendimiento alcanza el criterio de. juicio 402 Nivel de rendimiento para FS es consistentemente alta (> 95%; datos no presentados). b) número de ensayos necesarios para completar cada etapa de aprendizaje media (promedio de más de 5 animales y 44 sesiones en total). En promedio, los animales necesitan ~ 700 ensayos para responder consistentemente responder correctamente. Extinción tomó ~ 900 pruebas, y la readquisición sólo unos 60 ensayos, sustancialmente menores que la adquisición inicial (Figura 4B).
Figura 4. Ejemplo de resultados de comportamiento. A) el rendimiento Uno de pájaro de los 2 nuevos estímulos en las tres etapas de aprendizaje. Las curvas representan decisiones correctas por ciento (promedio de los últimos 120 ensayos, correspondientes a 30 presentaciones del estímulo correspondiente) en función del número total de los ensayos, por separado para la novela stimulnosotros 1, 2 estímulo nuevo, y promediado entre ambos estímulos. Rendimiento de los estímulos familiares fue consistentemente por encima del 95% de respuestas correctas (datos no mostrados) B) número de ensayos necesarios para alcanzar el rendimiento criterio en cada una de las tres etapas de aprendizaje media.; barras de error, SEM.
Neural datos
La Figura 5 muestra el patrón de respuesta de dos unidades en el caudolaterale nidopallium (NCL) grabado mientras un animal estaba realizando la tarea CFSE. Modulación de la respuesta durante la presentación del NS se muestra en la Figura 5A. En la fase de adquisición, las unidades responde fuertemente a NS 2 (designado para la extinción), con la disminución de las respuestas hacia el final de la fase de adquisición y poco cambio en cocción durante las otras dos etapas de aprendizaje. Hay poca responder a NS 1 a través de toda la sesión. El aumento de la respuesta en torno a 3-4 segundos después del inicio del estímulo de muestra se debe recompensar la entrega. Los niveles de actividadrelativas a estímulos familiares no fueron modulados (datos no mostrados).
Figura 5B muestra el patrón de respuesta de otra unidad NCL registrada durante CFSE. Esta neurona responde durante movimientos correctos hacia la izquierda, pero no (superior izquierda), sugestivos de codificación sensoriomotora. Sin embargo, la fuerza de la respuesta cambió con las etapas de aprendizaje: los dos paneles inferiores muestran las funciones de densidad espiga (SDFs) activan a las opciones hacia la derecha para una conocida (izquierda) y un estímulo novedoso (derecha), dividido en cuartiles sucesivos para ilustrar el desarrollo a través de la sesión experimental. Las respuestas fueron más bajos para el estímulo familiarizado durante toda la sesión, a pesar de que los tiempos medios de movimiento para las dos condiciones de estímulo son muy similares (superior derecha). Por otra parte, las respuestas durante opciones hacia la derecha después de la presentación de la novela pero no el estímulo familiarizado disminuyeron durante el curso de la sesión experimental (no acompañado de una disminución en la línea de base de abetotasa ing). Por lo tanto, ambas neuronas disminuyeron disparar como una novela estímulo particular se convirtió en cada vez más familiar, con la neurona en la Figura 5B que codifica para un movimiento específico, además de la novedad del estímulo anterior a ese movimiento.
Figura 5. Patrones de respuesta de dos unidades de ejemplo registrada durante la tarea SFIC. A) de Spike densidad funciones provocaron la aparición de la novela 2 estímulos NS NS 1 y 2 (fila superior e inferior, respectivamente), se separaron por 3 fases de aprendizaje (columnas ), con respuestas en cada fase de aprendizaje de nuevo dividido en 3 partes iguales (temprana, media tarde). NS 2 fue designado para la extinción. PSTHs (anchura bin 1 ms) fueron suavizadas con un kernel gaussiano exponencial modificado (σ = 100 ms y τ = 100 ms). B)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo describe una tarea conductual complejo adecuado para las grabaciones de una sola unidad concurrentes. Hemos descrito la tarea CFSE para las palomas, pero se puede adaptar fácilmente a los roedores al exigir asoma la nariz o de la palanca de pulsar en lugar de picotazos clave, y sustituyendo visual por olfativo, auditivo, o estímulos táctiles.
Tal vez los pasos más críticos durante el procedimiento de formación son: 1) la reducción gradual de la recompensa probabilidad y 2) aumento en el número de juicio. En cuanto a refuerzo intermitente para los estímulos familiares, nos decidimos por las probabilidades de recompensa que van de 0,5 a 0,8; Estos son lo suficientemente alta para producir un rendimiento estable pero suficientemente baja para evitar la saciedad prematura. Dicho esto, muchas aves están dispuestos a realizar bien las probabilidades de recompensa de hasta 0,2.
El gran número de ensayos por sesión (500-1500) es necesaria debido a la adquisición, extinción y readquisición de si la respuesta condicionadaMPLY requiere esta cantidad de pruebas, y debido a que la estimación precisa de las tasas de disparo es difícil con menos de, digamos, 25 ensayos, sobre todo cuando se grabe de neuronas con bajas tasas de disparo (en el NCL, disparando las tasas de referencia son <1 Hz). En consecuencia, se establece el número mínimo de ensayos necesarios para completar una etapa de aprendizaje de tal manera que cada estímulo se muestra por lo menos 35 veces.
Para un animal ingenuo, entrenamiento en la tarea CFSE tarda aproximadamente 4 meses, pero la duración exacta depende en gran medida de la persona. Debido a las altas exigencias de la tarea, es bastante probable que no todos los animales acabarán funcionando bien en el paradigma final. Si un ave individual se salta demasiadas pruebas o produce altas tasas de error durante el entrenamiento, no dude en reemplazar este tema. En nuestra experiencia, es muy probable que este animal nunca funcionará correctamente en la tarea final.
La mayoría de los estudios previos que llevan a cabo las grabaciones de una sola unidad enpalomas con libertad de movimientos no se registraron correctamente la salida del motor durante la grabación. Esto complica la interpretación de las respuestas neuronales durante los períodos críticos de los ensayos, como la presentación de la muestra o las fases de retardo 25. Este problema es inherente a go / no-go tareas en las que el experimentador lo general no sabe lo que el sujeto está haciendo en no-go ensayos; la misma advertencia se aplica a las tareas de memoria de trabajo incorporando un período prolongado retraso. Para lograr el control sobre el movimiento de los animales sin el empleo de la cabeza de fijación, se diseñó una tarea en la que los animales tienen para llevar a cabo la misma acción (picoteo) a pesar de que las condiciones de la muestra (estímulos) cambio. En nuestro paradigma CFSE, tanto de entrada visual, así como la salida del motor está bien-controlados y monitoreados constantemente. Dado que los animales están obligados a picotear cada estímulo de muestra a lo largo de su presentación, mantenemos constante de salida del motor, mientras que los animales están viendo estímulos con diferentes historias de aprendizaje. Actualmente estamos explorando methods para lograr incluso un mejor control de la salida del motor, tales como conectar un acelerómetro para la headstage para el registro continuo de movimientos de la cabeza. Además, estamos desarrollando métodos para medir la fuerza de cada tecla picotear por medio de un transductor mechanoelectric.
Nuestro paradigma permite desentrañar las contribuciones de los sensoriales, motoras, y las variables cognitivas a las tasas de disparo neuronal mediante la identificación de los patrones típicos de respuesta neural. Por ejemplo, se esperaría que una neurona premotora para las respuestas hacia la izquierda para aumentar la cocción durante la fase de muestra cada vez que el animal se va a hacer una respuesta hacia la izquierda, independientemente de la identidad de estímulo. Del mismo modo, se espera que las neuronas motoras simples para disparar durante picoteo, o el movimiento izquierda-o hacia la derecha. Una neurona que representa expectativa de recompensa, por el contrario, sería fuego durante la fase de muestra, y más aún para el FS que los NS durante la adquisición temprana (porque recompensa subjetiva probabilidad es más alta en FS de NS trriales antes de NS se aprenden), pero esto debe revertir más tarde, cuando los NS se clasifican consistentemente correctamente (porque recompensa objetivo probabilidad es más alta en las pruebas correctas NS). Finalmente, se espera que las neuronas sensibles a las características específicas de estímulo para disparar constantemente para uno de los estímulos de muestra sin ningún cambio a través de las etapas de aprendizaje.
Debido a que la grabación de la unidad extracelular es propensa a grabar picos de varias unidades a la vez 11,26, la inspección de una serie de indicadores de calidad es importante para clasificar correctamente los picos como originaria de una sola o de varias neuronas 27. Usando tetrodos en lugar de electrodos individuales sin duda producirá un incremento adicional en la clasificación de la calidad 11. Esto debe ser considerado cuando las grabaciones en las regiones del cerebro con una alta densidad celular (por ejemplo, el hipocampo) o muy alta actividad espontánea (como el entopallium) están destinados. Sin embargo, los microplugs que usamos sólo están disponibles para un máximo de 18 conexiones que por ahora constituyen un límite superior en el número total de canales de grabación.
En resumen, hemos desarrollado una tarea de alta complejidad para los animales de experimentación no primates. Esta tarea fue diseñada para permitir la investigación de los fenómenos de aprendizaje con las grabaciones de una sola neurona, pero al mismo tiempo es adecuado para hacer frente a temas como la categorización, la toma de decisiones, y la codificación de recompensa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a MCS (PARA 1581, el STU 544/1-1) y OG (PARA 1581, SFB 874). La página web de la DFG es http://www.dfg.de/en/index.jsp. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación de los autores manuscript.The agradecer a Thomas Seidenbecher para que nos proporciona el protocolo de sobrerregulación, así como Tobias Otto para obtener ayuda con la configuración del electrofisiológico equipo de grabación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resistance wire (for use as electrodes) | California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA | Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm) | |
| Microconnectors | Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada | GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage) | |
| Cannulae | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4" | |
| Gold solution for plating | Neuralynx, Bozeman, MT, USA | SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355 | |
| Solution for ultrasonic bath | Alconox, Inc., New York, USA | 1304 | Tergazyme |
| Conductive glue | Henkel Loctite | LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive | |
| Stainless steel screws | J.I. Morris, Southbridge, MA, USA | F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches | |
| Light-curing dental cement | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Omniceram Evo Flow A2 | |
| Light-curing unit | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit) | |
| Filter amplifiers | npi electronic GmbH, Germany | DPA-2FS | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | power 1401 | |
| Spike2 software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Version 7.06a | |
| MATLAB | The Mathworks, Natick, MA, USA | R2012a |
References
- Bingman, V. P., Gasser, B. A., Colombo, M. Responses of pigeon (Columba livia) wulst neurons during acquisition and reversal of a visual discrimination task. Behav Neurosci. 122, 1139-1147 (2008).
- Herry, C., Ciocchi, S., Senn, V., Demmou, L., Müller, C., Lüthi, A. Switching on and off fear by distinct neuronal circuits. Nature. 454, 600-606 (2008).
- Quirk, G. J., Repa, C., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances short-latency auditory responses of lateral amygdala neurons: parallel recordings in the freely behaving rat. Neuron. 15, 1029-1039 (1995).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., Ledoux, J. E. Components of Tone-Evoked Spike Trains in Auditory Cortex and Lateral Amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Maren, S. Auditory fear conditioning increases CS-elicited spike firing in lateral amygdala neurons even after extensive overtraining. Eur J Neurosci. 12, 4047-4054 (2000).
- Milad, M. R., Quirk, G. J. Neurons in medial prefrontal cortex signal memory for fear extinction. Nature. 420, 713-717 (2002).
- Hobin, J. A., Goosens, K. A., Maren, S. Context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala represents fear memories after extinction. J Neurosci. 23, 8410-8416 (2003).
- Maren, S., Hobin, J. A. Hippocampal regulation of context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala. Learn Mem. 14, 318-324 (2007).
- Knapska, E., et al. Differential involvement of the central amygdala in appetitive versus aversive learning. Learn Mem. 13, 192-200 (2006).
- Harloe, J. P., Thorpe, A. J., Lichtman, A. H. Differential endocannabinoid regulation of extinction in appetitive and aversive Barnes maze tasks. Learn Mem. 15, 806-809 (2008).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63, 43-54 (1995).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, (1998).
- Skinner, B. F.
- Herrnstein, R. J. Relative and absolute strength of response as a function of frequency of reinforcement. J Exp Anal Behav. 4, 267-272 (1961).
- Brown, P. L., Jenkins, H. M.
- Epstein, R., Kirshnit, C. E., Lanza, R. P., Rubin, L. C. 34;Insight" in the pigeon: antecedents and determinants of an intelligent performance. Nature. 308, 61-62 (1984).
- Mazur, J. E. Varying initial-link and terminal-link durations in concurrent-chains schedules: a comparison of three models. Behav Processes. 66, 189-200 (2004).
- Herrnstein, R. J., Loveland, D. H.
- Stüttgen, M. C., Yildiz, A., Güntürkün, O. Adaptive criterion setting in perceptual decision making. J Exp Anal Behav. 96, 155-176 (2011).
- Stüttgen, M. C., Kasties, N., Lengersdorf, D., Starosta, S., Güntürkün, O., Jäkel, F. Suboptimal criterion setting in a perceptual choice task with asymmetric reinforcement. Behav Processes. 96, 59-70 (2013).
- Rose, J., Otto, T., Dittrich, L. The Biopsychology-Toolbox: a free, open-source Matlab-toolbox for the control of behavioral experiments. J Neurosci Methods. 175, (2008).
- Bilkey, D. K., Muir, G. M. A low cost, high precision subminiature microdrive for extracellular unit recording in behaving animals. J Neurosci Methods. 92, 87-90 (1999).
- Bilkey, D. K., Russell, N., Colombo, M. A lightweight microdrive for single-unit recording in freely moving rats and pigeons. Methods. 30, 152-158 (2003).
- Gallistel, C. R., Gibbon, J.
- Starosta, S., Güntürkün, O., Stüttgen, M. C. Stimulus-response-outcome coding in the pigeon nidopallium caudolaterale. PLoS One. 8, (2013).
- McNaughton, B. L., O'Keefe, J., Barnes, C. A. The stereotrode: a new technique for simultaneous isolation of several single units in the central nervous system from multiple unit records. J Neurosci Methods. 8, 391-397 (1983).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. J Neurosci. 31, 8699-8705 (2011).
