Summary
Att lära sig nya stimulus-responsassociationer ingriper med ett brett spektrum av neurala processer vilka slutligen reflekteras förändra spik utmatning av individuella nervceller. Här beskriver vi en beteende protokoll som gör det möjligt för kontinuerlig registrering av en enda neuron aktivitet medan djur förvärva, släcka, och återförvärva en betingad respons inom en enda försökssession.
Abstract
Även frågan om lärande har rönt stort intresse från både beteende-och neurala forskare har endast relativt få utredare observerade enda neuron aktivitet medan djuren förvärvar en operantly betingad respons, eller när detta svar är släckt. Men även i dessa fall, observationsperioder omfattar oftast bara ett enda steg i lärandet, dvs förvärv eller utdöende, men inte båda (undantag inkluderar protokoll använder återföring lärande, se et al Bingman 1 för ett exempel.). Men förvärv och utrotning medföra olika mekanismer lärande och förväntas därför åtföljas av olika slag och / eller loci av neural plasticitet.
Därför utvecklade vi en beteendevetenskaplig paradigm som institut tre stadier av lärande i ett enda beteende session och som är väl lämpad för samtidig inspelning av enstaka nervceller "aktionspotentialer. Djur enre utbildade på ett enda intervall forcerad val uppgift som kräver mappning vardera av två möjliga val svar på presentationen av olika nya visuella stimuli (förvärv). Efter att ha nått en fördefinierad prestationskravet, en av de två val svaren inte längre förstärkt (utrotning). Efter en viss minskning i prestanda, är korrekta svar förstärkta igen (återförvärv). Genom att använda en ny uppsättning av stimuli i varje session, kan djuren genomgå förvärvet-utrotning-återförvärv processen flera gånger. Eftersom alla tre studieetapper inträffa i en enda beteende session är ett paradigm idealisk för samtidig observation av den tillsatta utmatningen från multipla enstaka neuroner. Vi använder duvor som modellsystem, men uppgiften kan lätt anpassas till andra arter som kan lära rade diskriminering.
Introduction
Att lära sig nya stimulus-respons-utfall föreningar engagerar ett stort antal neurala plasticitet processer. Dessa processer är i slutändan återspeglas i den föränderliga spik produktionen av enskilda nervceller. Förmodligen en av de mest sysselsatt lärande paradigm är Pavlovsk rädsla Conditioning genomföras med gnagare. I denna inställning, förvärv och utrotning av en betingad respons ske inom några tiotal försök 2. Den snabba utvecklingen av kondition rädsla kan vara en fördel eftersom det gör att köra ett stort antal djur inom en kort tid. Dessutom kan observeras förvärv och utrotning inom några tiotals försök på en enda dag i naiva djur 3,4 eller spridda över 2 till 3 dagar 2,5-8. Men de insikter om de förändringar av neural aktivitet under inlärning i dessa experiment inte nödvändigtvis gälla utanför domänen av rädsla konditionering. Till exempel, målinriktat beteende drivs av positiontiva förstärkning är mer adekvat sätt modelleras genom operant istället Pavlovian rutiner konditionering, och kan delvis bero på olika neurala substrat 9,10. Dessutom utvecklar rädsla konditionering så snabbt att neurala svar på CS bara kan observeras för några dussin försök att placera stränga gränser för analys av förändringar av neural aktivitet under inlärning.
Tyvärr tar förvärv och utrotning av operant svarar oftast flera dagar. Detta är till skada för neurofysiologiska undersökningar, eftersom det är notoriskt svårt att registrera aktiviteten av enskilda celler under mer än ett par timmar. På grund av den höga likheten mellan vågformer av extracellulärt inspelade aktionspotentialer, är det problematiskt att hävda att spikar som spelats in på en dag genereras från samma cell som spikar med liknande vågformer som spelats in på nästa 11,12, särskilt i områden med en hög celltäthet, såsom hippocampus.
(Columbia livia forma domestica) är klassiska modellorganismer i experimentell psykologi 13-17. Dessa fåglar har möjlighet att utföra komplexa visuella diskriminering 18, kan flexibelt anpassa beteendet till förändrade armeringsutsedda 19,20, och är unikt ivrig arbetare, som utför 1.000 försök med minimal mängd av förstärkning. Dessa egenskaper gör dem särskilt lämpliga för de experiment som beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethics Uttalande
Alla experiment utfördes i enlighet med de tyska riktlinjerna för vård och användning av djur i vetenskap. Rutiner har godkänts av en nationell etisk kommitté i delstaten Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Systemöversikt
Operant Testing avdelningen
Den operant kammare (Figur 1) mäter 34 cm x 34 cm x 50 cm. Tre genomskinliga svarsknapparna (4 cm x 4 cm, som ligger ca 20 cm över golv) är infälld i den bakre väggen i kammaren. Stimuli visas via en LCD-skärm monterad bakom tangenterna respons. Två 2-watts glödlampor placerade på sidoväggarna ger dunkel belysning. Kammaren är inrymt i ett ljuddämpande skåp att maskera ovidkommande ljud. Högtalare ger vitt brus vid alla tillfällen. Mat (korn) är försedd med ett livsmedel tratt belägen under centER-tangenten. Experimentell hårdvara styrs av specialskrivna MATLAB-kod 21. Djuren övervakas kontinuerligt genom en digitalkamera ansluten till den främre väggen hos kammaren.
Custom-byggda Microdrive
Microdrive bostäder 16 elektrodtrådar är specialbyggda i vårt laboratorium; designen är baserad på arbete av Bilkey och kollegor 22,23, och läsaren hänvisas till dessa artiklar för en detaljerad beskrivning. Vi ändrade sin design för att möjliggöra ett större antal elektroder (16 istället för 8, 25 um Nichrome trådar), och vi ansluter elektrodkablarna via ledande silver lim till huvudsteg uttaget. Dessutom använder vi förgyllning av elektrod tips för att minska impedansen och uppnå bättre signal-till-brus-förhållanden (ansöka -3 V för ~ 3 sekunder, impedans bör sjunka till <100 kQ).
När mikrostationen är monterad, är elektroder kapas till önskad längd, tips är cleaned i ett ultraljudsbad (Tergazyme i destillerat vatten) under 20 min och sköljdes ytterligare 20 min i destillerat vatten. Förgyllning av elektrodspetsar bör ske omedelbart före implantationen. För jordning, använder vi en silver kula elektrod placerad ovanför den laterala lillhjärnan. Specifikation av material är anordnad i Material tabell som åtföljer denna artikel.
En viktig fråga när man arbetar med fritt rörliga djur är rörelseartefakter. Vi fann att rörelse artefakter i våra installationer är till stor del på grund av att a) hög elektrod impedans (> 500 kQ) och b) bristfällig fastsättning av kontakterna mellan pluggen (implantat) och hylsan (huvudsteg) när djuret rör sig. En mängd olika kommersiellt tillgängliga microconnectors inte fungera tillfredsställande för inspelning från fritt rörliga fåglar, eftersom den mekaniska kontakten mellan stickpropp och uttag försämras snabbt genom kraftfulla rörelser duvorna (huvud-guppande, nyckel-hack). Den bästa mekaniska anslutningen mellan implantat och huvudsteg uppnåddes med headplug församlingar från Ginder Scientific. Dessa plug-socket församlingar har 18 kontakter och är väl fäst på varandra med en ringmutter.
Elektrofysiologiska inspelning Setup
Den elektrofysiologi installationen består av följande delar: 1) en specialbyggd huvudsteg med enhetsförstärkning (operationsförstärkare) 2) 15 differentialförstärka moduler inrymt i två rackmonterade enheter (DPA-2FS och EPMS-07, respektive, NPI elektroniska GmbH, Tyskland ), 3) en 16-kanals analog-till-digital omvandlare (power 1401 markera I). Råa signaler förstärks 1000 x och bandpassfiltreras (500-5,000 Hz, ett första ordningens filter), digitaliseras med en samplingsfrekvens på 16 till 20 kHz och lagras med Spike2 Version 7.06a för offline bearbetning. Tider för evenemanget (t.ex. stimulans debut eller enskilda nyckel pecks av djuret) fångas via en laboratoriebyggd parallellport IO box (se Rose, Et al 21) och vidarebefordras till AD-omvandlaren för förvaring tillsammans med neurofysiologiska data (se figur 1).. Offline bearbetning beskrivs ytterligare nedan.
Figur 1. Systemöversikt. Informationsflöde symboliseras av färgade pilar. Dator 1 styr hårdvara avseende beteende utgång (stimulans display via platt bildskärm, hus ljus, mat hopper, feeder ljus, svarsknapparna) och skickar händelsetidsstämplar till AD-omvandlaren. Dator 2 lagrar neurofysiologiska signaler erhållna från A / D-omvandlare och händelsetidsstämplar fått från dator 1. Bilden till vänster visar den konditionekammaren inne i ljuddämpande skåp. Dess element är: 1) Ljuddämpande skal, 2-4) svarsnyckels, 5) mat hopper, 6) matar ljus 7) hus ljus, 8) observation kamera.
Single-Intervall-Forced-Choice (SIFC) Diskriminering Task
För tydlighetens skull beskriver vi den sista SIFC uppgiften här och sedan förklara de steg som behövs för att träna djur på denna uppgift nedan.
Den SIFC uppgift beskrivs i figur 2. Efter intertrial intervallet (ITI) har löpt ut, är den mittknappen genomlysta gröna i upp till 5 sek ('initieringsfasen'). Omedelbart efter den tredje svaret av djuret inom 5 sekunder, är en av flera prov stimuli presenteras på mittknappen i 2 sekunder ("provfasen", exempel stimuli visas i infällda till figur 2). Efter 2 sekunder, är mittknappen igen genomlysta gröna, och djuret måste svara en gång innan de två sidoknapparna är genomlysta ('bekräftelsefasen "). Beroende på identiteten av den stimulans som visasi provfasen, är djuret som krävs för att leda ett enda svar på antingen vänster eller högerknappen ("val fasen"). Om den väljer rätt destination, tillgång att belöna (korn) beviljas för 2 sek. Således kärnan i uppgiften består i att svara på den vänstra valet nyckeln efter presentationen av en viss stimulans på mittknappen och svara på rätt val nyckeln efter presentationen av en annan stimulans. Anledningen till att provfasen och avslutas med initiering och en bekräftelsefasen är att hålla djurens huvud framför mittknappen medan provet stimulus presenteras.
När djur mästarna denna uppgift för ett enda par av stimuli (hädanefter "bekanta" stimuli, FS), den presenteras med en ny stimulus (NS) par i varje ny session, och måste lära sig vilken av de två nya stimuli är som skall följas av ett svar på den vänstra eller den högra val-tangenten. FS par fortsätter att presenteras under those experiment för att tjäna som lämplig kontrollgrupp. Tillräcklig prestanda på den sista uppgiften hänger ytterst på djurens vilja att utföra> 1.000 studier på övergripande förstärknings sannolikheter <0.5. Följande punkter beskriver en tränings förfarande där uppgiften komplexitet ökas gradvis tills djuret når nivån för SIFC; på samma gång, förstärkning sannolikhet och antalet försök per session behöver ökas för att säkerställa konsekvent hög prestanda på den slutliga uppgiften.
1. Animal Training
- Mat Restriktion
- Väg djuren efter minst två veckors fri tillgång till mat. Ta denna vikt som fri-matningsvikt. Begränsa åtkomst mat under de kommande 1-2 veckor tills djuren når 85% av sin fria matning vikt.
- Det är viktigt att duvor bibehålla en sund utseende och normal aktivitet under hela hela experimentet. TillDärför noggrant övervaka djurens utseende och vikt över hela varaktigheten av beteendeträning och testning. Väg djur före och efter varje experimentsessionen att bedöma dagliga födointaget. Tillhandahålla ytterligare mat om det är nödvändigt för att förhindra ytterligare viktminskning. Ge obegränsad tillgång till mat under helgen.
- Autoshaping
Autoshaping tjänar till att vänja djuret till den experimentella kammare och etablera betingad svara.- Presentera en 5-sek visuell stimulans (hädanefter, initiering stimulans, IS) på mittknappen. Omedelbart efter uppsägning av IS eller ett enda hack till svarsknappen (det som kommer först), stänga av knappbelysning och presentera mat belöning (2 sek aktivering av livsmedels hopper).
- Håll ITI betydligt längre än provet presentationstiden för att underlätta lärande 24. Använd värden för 120 sek för ITI och köra 40 försök per dag. Senare återanvändning ISsom initieringen, bekräftelse, och val nyckel stimulans i den sista uppgiften (se figur 2). Denna fas av utbildningen kommer att ta djuren cirka en vecka.
- När djuret reagerar på ett tillförlitligt sätt (i> 85% av försöken), minska ITI stegvis ner till 10 sek och provpresentationstiden ner till 2 sek. Vid samma tid, öka antalet svar som krävs för förstärkning till 3 (fast förhållande av 3, FR 3). Dessutom ökar det totala antalet försök per dag. Välj parametrar såsom att djuret är utbildade varje dag under ca en timme. Denna fas av utbildningen kommer att pågå ungefär 2 veckor.
- Upprepa steg 1.2.1 - 1.2.3 för vänster och höger svarsknapparna tills försöks tillförlitligt svara på IS på alla tre knapparna. Alternativa försök med aktivering av vänster, höger och center nyckel slumpmässigt.
- Nu presenterar den först i mitten och sedan, villkorat av ett svar, på vardera sidan tangent (uteslut förstärkning förcentrera nyckel svar). Alternativa sidoknapparna aktiveras slumpmässigt från rättegång till rättegång. Avsluta prövningar där motivet inte svarar på mittknappen efter 5 sek. Upprepa tills djuret utför tillförlitligt (~ 3 dagar).
- Införa 2 nya stimuli som senare kommer att fungera som FS i den sista uppgiften (se figur 2, infälld, för exempel). Upprepa steg 1.2.1 - 1.2.3 med dessa stimuli. Reagera kommer att upprättas snabbare än med den första stimulans, vanligen inom 4 dagar.
Figur 2. Illustration av den beteende paradigmet. Efter en ITI av 5 sekunder, är det mittknappen genomlysta gröna i upp till 5 sek (initiering). Om djuret svarar 3x inom dessa 5 sekund, en ut ur fyra, Prov stimuli presenteras vid samma position. Efter en fast provpresentation tid på 2 sekunder under vilken djuret måste svara åtminstone en gång, är den centrala hacknyckel genomlysta gröna igen (bekräftelse). Efter en annan hack, är knapparna 2 sido genomlysta gröna. Ämnet visar sitt val genom att svara en gång till en av sidoknapparna. Vid förvärv och återförvärv, är korrekta svar, följt av 2 sek tillgång mat tillsammans med aktivering av matar ljus, eller aktivering av enbart matar ljus. Om felaktig, är huset ljus avstängd 3 sek. Under utrotning, både korrekta och felaktiga svar på utdöende stimulans förblir oviktiga. Infällda bilden visar t.ex. nya och välbekanta stimulans par.
- Utbildning av en Single-Intervall Forced-Choice (SIFC) Uppgift för Familiar Stimuli
- Upprätta hela sekvensen för initiering, prov, bekräftelse, och val: på varje försök, nuvarande fiRST IS (FR 3), får en av de två FS (2 sek fast varaktighet), sedan igen IS (FR 1). Använd en uppmanad-val utformning: i varje försök, transilluminate bara valet nyckel som är korrekt för den givna FS. Denna fas av utbildning bör ta ca 1 vecka.
- När ämnet utför tillförlitligt (> 85% svar till respektive sidoknappen), införa fritt valbara studier (båda sidoknappar genomlysta under valet fasen). Om djuret är ett svar på den korrekta sidan, ge tillgång mat för 2 sek. Felaktiga svar följs av time-out straff (houselights off 2 sek). Om inget svar ges inom 3 sek, avsluta rättegången och starta ITI. Djur lär sig oftast dessa delkomponenter av uppgiften inom 2 veckor.
- Successivt öka andelen fritt valbara studier under efterföljande sessioner från 20% till 100%.
- Om motivet utför> 90% rätt i fritt valbara studier, minskar belönings sannolikheten för korrekta svar till 0,5medan samtidigt öka antalet försök per session till 1000. Ändra inte parametrar varje dag / session men välj dem flexibelt beroende på vilken prestandanivå i ämnet om initiering försummelser och andelen rätta svar. Denna fas av utbildningen kommer att pågå ca 4 veckor.
- Duvor brukar vägra svara på okända stimuli. Därför, när djuret tillförlitligt utför> 1.000 försök, figur svar på en stor uppsättning visuella stimuli (se avsnitt 1.2). Dock inte preexpose de visuella stimuli avsedda för senare användning som nya stimuli i slut paradigmet men enhetliga färgskärmar.
- Final Single-Intervall Forced-Val uppgift med nya stimuli Under olika Förstärkning Villkor
- Warm-up
Låt motivet utföra 50 försök med endast FS. Ställ belöning sannolikheten för dessa stimuli till <1 (säg, från 0,5 till 0,8) under alla faser för att förhindra för tidig mättnadskänsla och,Därför, brist på motivation att svara. - Förvärv Stage
Slumpmässigt alternativa försök med presentation av FS och NS. Tilldela olika svarsknappar som stämmer för de två NS och förstärka varje rätt svar. Beräkna andelen rätta svar som kör i genomsnitt under de senaste 120 försöken. Förvärv anses vara komplett när prestanda för var och en av NS överstiger 85%, men inte innan minst 150 studier har utförts. - Släcknings Stage
Sluta förstärka korrekta och bestraffa felaktiga svar på en slumpmässig NS (utrotning stimulus). Börja återförvärv fas när rätt svara på utdöende stimulans sjunker under 60% och djuret har upplevt minst 150 försök i denna fas totalt. - Reacquisition stadium
Igen förstärka rätt och straffa felaktiga svar till utrotning stimulans, som under förvärvsstadiet. Avsluta sessionen när prestanda för denna stimulans överstiger 85% och animals utfört minst 150 försök i denna fas totalt.
- Warm-up
2. Elektro
- Elektrod Implantation
Implantationskirurgi sker efter djur flera gånger (3-4x) fullföljde hela förvärvs utrotning-återförvärv sekvens och beskrivs mer i detalj på annan plats 25.- Placera 5-6 microsrews rostfritt stål på skallen för att tandcement huvudmontage inklusive mikrostationen.
- Utför en kraniotomi strax ovanför hjärn regionen av intresse; sedan försiktigt dissekera dura och sänka elektroderna till den önskade positionen.
- Innan förankring av mikrodrivanhuvudfästet, applicera vaselin runt styr kanyl; detta kommer att förhindra dental cement från omsluter styrröret.
- Använd en isolerad silver kula elektrod placerad under skallen ligger över lillhjärnan som marken.
- Ge djuren med smärtstillande medel (Karprofen, 10 mg / kg, injicerades två gånger dagligen) under tre dagar efter operation. Låt djuren att återhämta sig i minst 2 veckor.
- Inspelningar Medan djur utföra uppgiften
- Använd ett par nya nya stimuli för varje session och förskott elektroder minst 125 nm (ett halvt varv på drivskruven) före start. Om inga aktionspotentialer med tillräcklig signal-till-brus-förhållande observeras avbryta sessionen, placera djuret i buren och försök igen nästa dag.
- Ordna headstage kabeln så att den inte stör djurets normala plockning och ätbeteende. Detta kan uppnås genom att fästa kabeln med flera elastiska band till toppen av konditioneringskammaren och habituerade fåglarna till den anslutna kabeln i några timmar.
- Om tillgängligt, använder sig av en kommutator att ge extra rörelsefrihet för fåglarna.
- Offline signalanalyser
- Band-pass-filter alla kanaler från 500 till 5000 Hz med brant roll-offs offline med hjälp Spike2. Extrahera spikar med amplitud trösklar och sortera dem manuellt anställa principalkomponentanalys.
- Undersök sortering resultat med specialskrivna MATLAB-kod (finns på MATLAB Central File Exchange, Fil ID # 37339). En väl isolerad enhet (figur 3) bör uppfylla samtliga av följande kriterier: a) en klart avskild klustret i principalkomponentutrymme, b) inga tecken på multipla enheter när alla inspelade vågformerna är överlagrade och plottades som värmekarta (figur 3A ), c) som är symmetriskt fördelade toppvågform amplituder (figur 3b), d) stabil inspelning under hela sessionen, vilket framgår av oföränderlig spik amplitud (figur 3C), e) att inga eller mycket få spik händelser som inträffar under den refraktära perioden för den föregående spike (Figur 3D), och en signal-till-brus-förhållande (SNR) på minst 2 (SNR är här defined som skillnaden mellan den lägsta och högsta av det genomsnittliga spik vågform, dividerat med trimmade bredd brusbandet (2.5 e och 97.5: e percentilen av fördelningen av värden från den första bin i alla vågformer)). SNR för den enhet som visas i fig 3 är 3,9.
- Inspektera rå kanaler offline för rörelserelaterade artefakter. Kasta kanaler när detta anges.
- Elektriska artefakter förekommer under nyckel picka kan i sällsynta fall förväxlas med rätt spik vågformer. Test för kontaminering av de registreringar genom att undersöka den tid histogram över spik räknas i förhållande till varje registrerad nyckel hack (peri-hack tid histogram, PPTH, Figur 3E). Picka-inducerad artefakter visas som en topp i histogrammet nära (± 50 ms) på tiden 0. Som en extra kontroll, rita vågformer av alla förmodade spik händelser som registrerats inom ± 20 ms med en nyckel picka separat och jämför den med spik vågformer detekteras outside fönstret (Figur 3F).
Figur 3. Kvalitets mätetal för enhets isolering. A) Värme karta över alla vågformer "tid-spänningsvärden. B) fördelningar av max (röd), minimum (grön) och buller (blå) spänningsvärden för alla vågformer. Fördelning är väl separerade, vilket indikerar utmärkt enhet isolering. C) Spontan eldhastighet (röd, beräknat från 2-sec segment i alla intertrial intervaller) och spik amplituder (topp-till-topp) som funktion av tiden i session. Båda kurvor jämnas med en boxcar funktion (bredd: 50 datapunkter) D) Interspike-intervallfördelning för denna enhet.. Bin bredd, 10 ms (infällda: 1 msek). Mycket korta mellanrum är nästan frånvarande (<0,1% av intervaller under 4 ms). <strong> E) PSTH utlöste nyckel hackar. Evenemangs räknar nära nyckeln picka (± 20 msek) markeras rött. F) Alla 157 vågformer som registrerats inom ± 20 ms av viktiga picka händelser. De vågformer i jämförelse till övergripande formen vågform som visas i panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beteende
Figur 4A visar den beteendemässiga prestanda hos ett djur i en modellsession. Den prestandanivå av djuret når kriteriet för NS 2 inom 180 försök (45 stimulans presentationer) och är nära 100% för NS 1 från början. Denna strategi - först svara på samma nyckel för både nya stimuli, och sedan justera svar för en av stimuli - är ungefär lika ofta observeras som initial slump svara på båda NS. I denna session, NS 2 var slumpmässigt valt att genomgå utdöende, vilket innebär att alla val efter denna stimulans förblir oviktiga (övergång mellan inlärningssteg indikeras med vertikala svarta streckade linjer). Under utrotning, minskar prestanda för utrotning stimulans men förblir hög för andra NS. Criterion nås i rättegång 370. Korrekta och felaktiga svar är nu förstärkt och straffas på nytt (återförvärv) och prestationsnivån når kriteriet i. rättegång 402 Performance nivå för FS är genomgående hög (> 95%, data visas ej). b) Medelvärde antal försök som behövs för att slutföra varje steg i lärandet (medelvärde över fem djur och 44 sessioner totalt). I genomsnitt djur behövs ~ 700 försök att konsekvent svara svara korrekt. Extinction tog ~ 900 försök, och återförvärv enbart ca 60 försök, betydligt mindre än den ursprungliga anskaffnings (Figur 4B).
Exempel beteendemässiga resultat. A) Figur 4. En fågel prestanda för de två nya stimuli i alla tre faser av lärande. Kurvor skildra procent riktiga val (medelvärde under de senaste 120 försöken, vilket motsvarar 30 presentationer av respektive stimulus) som en funktion av det totala antalet försök, separat för romanen stimuloss 1, stimulans roman 2, och i genomsnitt över båda stimuli. Prestanda för bekanta stimuli var genomgående över 95% korrekta (data visas ej) B) Medelvärde antal försök som behövs för att uppnå kriteriet prestanda i var och en av de tre etapperna i lärandet.; felstaplar, SEM.
Neural Data
Figur 5 visar svarsmönstret av två enheter i nidopallium caudolaterale (NCL) in medan ett djur utförde den SIFC uppgiften. Response utstyrning vid presentation av NS visas i fig. 5A. I förvärvsfasen, enheterna reagerar starkt till NS 2 (utsedd för utrotning), med svar minskar mot slutet av förvärvsfasen och små förändringar i skottlossning under de två andra stadier av lärande. Det finns inte mycket att svara på NS 1 över hela sessionen. Svars ökningen cirka 3-4 sekunder efter prov stimulans debut beror på att belöna leverans. Aktivitetsnivånrör kända stimuli inte modulerad (data visas ej).
Figur 5B visar svarsmönstret annan NCL enhet inspelad under SIFC. Denna neuron reagerar under höger men inte åt vänster rörelser (övre vänster), som tyder på sensomotoriska kodning. Men ändrade svarsstyrka över stadier av lärande: de två nedersta panelerna visar spik täthetsfunktioner (SDF) utlöses till medurs val för en bekant (till vänster) och en ny stimulus (höger), delas upp i successiva kvartiler för att illustrera utvecklingen över den experimentella sessionen. Svaren var lägre för den välbekanta stimulans under hela passet, även om de genomsnittliga rörelsetider för de två stimulansFörhållandena var mycket likartad (uppe till höger). Dessutom svar under medurs val efter presentationen av romanen, men inte den välbekanta stimulans minskade under loppet av den experimentella session (inte parallellt med en minskning av baslinjen granningshastighet). Således både neuroner minskade bränning som en särskild ny stimulans blev alltmer förtrogna med neuronen i fig. 5B, som kodar för en specifik rörelse i tillägg till det nya i stimulus före den rörelsen.
Figur 5. Svarsmönster från två exempelheter som registrerats under SFIC uppgiften. A) Spike densitet funktioner som utlöses till uppkomsten av två nya stimuli NS 1 och NS 2 (övre och nedre raden, respektive), delas upp i 3 inlärningsfaser (kolumner ), med svar i varje inlärningsfasen åter delas upp i tre lika stora delar (början, mitten, slutet). NS 2 utsågs till utrotning. PSTHs (bin bredd 1 ms) var jämnas med en exponentiellt modifierad Gausskärna (σ = 100 ms och τ = 100 ms). B)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver ett komplext beteende uppgiften lämplig för samtidiga enda enhet inspelningar. Vi har beskrivit SIFC uppgift för duvor, men det kan enkelt anpassas till gnagare genom att kräva näsa petar eller spak trycka istället nyckel hackar, och ersätta visuellt genom lukt, hörsel, eller taktila stimuli.
Kanske de mest kritiska stegen under utbildningsförfarandet är 1) gradvis minskning av belöning sannolikhet och 2) ökning av provnummer. Beträffande intermittent förstärkning för de bekanta stimuli, beslutade vi om belöning sannolikheter mellan 0,5 och 0,8; dessa är tillräckligt hög för att åstadkomma en stabil prestanda, men tillräckligt låg för att förhindra för tidig mättnadskänsla. Som sagt, många fåglar är villiga att gå bra för belöning sannolikheter ner till 0,2.
Det stora antalet försök per session (500-1,500) är nödvändigt på grund av att förvärvet, utplåning, och återförvärv av kondition svara simply kräver detta många prövningar, och eftersom den precisa uppskattningen av bränning priser är svårt med mindre än, säg, 25 försök, speciellt vid inspelning från nervceller med låga bränning priser (i NCL, baslinjen bränning priser är <1 Hz). Därför ställer vi det lägsta antalet försök som krävs för att slutföra en lärande skede så att varje stimulus visas minst 35 gånger.
För en naiv djur, träning på SIFC uppgiften tar cirka 4 månader, men den exakta längden beror mycket på individen. På grund av de höga krav på uppgiften, är det ganska troligt att inte alla djur kommer att sluta bra resultat på den slutliga paradigm. Om en enskild fågel hoppar för många prövningar eller producerar höga felfrekvens under träning, tveka inte att ersätta detta ämne. Enligt vår erfarenhet är det mycket troligt att djuret aldrig kommer att fungera ordentligt på den sista uppgiften.
De flesta tidigare studier bedriver enda enhet inspelningar ifritt rörliga duvor misslyckats med att korrekt registrera motoreffekt under inspelning. Detta försvårar tolkningen av neuronala svar under kritiska perioder av försöken, som prov presentation eller fördröjningsfaserna 25. Detta problem är inneboende i go / no-go uppgifter där försöksledaren oftast inte vet vad ämnet gör på no-go försök; samma varning gäller för arbetsminnesuppgifter som innehåller en längre fördröjningsperiod. För att få kontroll över förflyttning av djuren utan att använda huvud-fixering, utformade vi en uppgift där djur har att utföra samma åtgärd (nyckel picka) även om förhållanden (prov stimuli) förändring. I vår SIFC paradigm, är både synintryck och motoreffekt välkontrollerad och övervakas kontinuerligt. Eftersom djuren måste picka på varje prov stimulans under hela sin presentation, vi håller motorutgång konstant medan djuren tittar stimuli med olika inlärningshistoria. Vi undersöker för närvarande methods för att uppnå ännu bättre kontroll över motorutgång, till exempel fästa en accelerometer på huvudsteg för kontinuerlig registrering av huvudrörelser. Dessutom utvecklar vi metoder för att mäta kraften i varje nyckel picka genom en mechanoelectric givare.
Vår paradigm tillåter befria bidragen av sensoriska, motoriska och kognitiva variabler till neurala bränning priser genom att identifiera typiska neurala svarsmönster. Till exempel skulle en premotoriska neuron för åt vänster svar förväntas öka bränning under provfasen när djuret kommer att göra en åt vänster svar, oberoende av stimulans identitet. På samma sätt skulle enkla motoriska nervceller förväntas brand under nyckelhack eller vänster-eller högerrörelse. En neuron som representerar belöning förväntan, å andra sidan, skulle brand under provfasen, och mer så för FS än NS under tidig förvärv (eftersom subjektiva belöning sannolikheten är högre på FS än NS trrial innan NS är inlärda), men detta bör vända senare när NS konsekvent klassificeras korrekt (på grund av objektiv belöning sannolikheten är högre på rätt NS prövningar). Slutligen är nervceller som svarar på specifika stimulansfunktioner väntas skjuta konsekvent för ett av prov stimuli utan någon förändring över stadier av lärande.
Eftersom extracellulära enhetsinspelning är benägen att spela in spikar från flera enheter på en gång 11,26, inspektera ett antal kvalitetsmått är viktigt att korrekt klassificera spikar som har sitt ursprung från en enda eller från flera nervceller 27. Använda tetrodes istället för enskilda elektroder skulle säkert ge en ytterligare ökning av sortering kvalitet 11. Detta bör beaktas när inspelningar i hjärnregioner med hög celltäthet (exempelvis hippocampus) eller mycket hög spontan aktivitet (t.ex. entopallium) är avsedda. Men de microplugs vi använder är endast tillgänglig för upp till 18 anslutningar som nu utgör en övre gräns för det totala antalet inspelningskanaler.
Sammanfattningsvis, utvecklade vi en uppgift av hög komplexitet för icke-primat försöksdjur. Denna uppgift var anpassade för att möjliggöra utredning av inlärningsfenomen med singel-neuron inspelningar, men samtidigt är lämpligt att ta itu med ämnen som kategorisering, beslutsfattande, och belöning kodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats med bidrag från den tyska Research Foundation (DFG) till MCS (FÖR 1581, STU 544/1-1) och OG (FOR 1581, SFB 874). Webbplatsen för DFG är http://www.dfg.de/en/index.jsp. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuscript.The Författarna tackar Thomas Seidenbecher för att förse oss med förgyllning protokoll samt Tobias Otto för att få hjälp med att inrätta den elektrofysiologiska färdskrivare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resistance wire (for use as electrodes) | California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA | Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm) | |
| Microconnectors | Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada | GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage) | |
| Cannulae | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4" | |
| Gold solution for plating | Neuralynx, Bozeman, MT, USA | SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355 | |
| Solution for ultrasonic bath | Alconox, Inc., New York, USA | 1304 | Tergazyme |
| Conductive glue | Henkel Loctite | LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive | |
| Stainless steel screws | J.I. Morris, Southbridge, MA, USA | F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches | |
| Light-curing dental cement | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Omniceram Evo Flow A2 | |
| Light-curing unit | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit) | |
| Filter amplifiers | npi electronic GmbH, Germany | DPA-2FS | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | power 1401 | |
| Spike2 software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Version 7.06a | |
| MATLAB | The Mathworks, Natick, MA, USA | R2012a |
References
- Bingman, V. P., Gasser, B. A., Colombo, M. Responses of pigeon (Columba livia) wulst neurons during acquisition and reversal of a visual discrimination task. Behav Neurosci. 122, 1139-1147 (2008).
- Herry, C., Ciocchi, S., Senn, V., Demmou, L., Müller, C., Lüthi, A. Switching on and off fear by distinct neuronal circuits. Nature. 454, 600-606 (2008).
- Quirk, G. J., Repa, C., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances short-latency auditory responses of lateral amygdala neurons: parallel recordings in the freely behaving rat. Neuron. 15, 1029-1039 (1995).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., Ledoux, J. E. Components of Tone-Evoked Spike Trains in Auditory Cortex and Lateral Amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Maren, S. Auditory fear conditioning increases CS-elicited spike firing in lateral amygdala neurons even after extensive overtraining. Eur J Neurosci. 12, 4047-4054 (2000).
- Milad, M. R., Quirk, G. J. Neurons in medial prefrontal cortex signal memory for fear extinction. Nature. 420, 713-717 (2002).
- Hobin, J. A., Goosens, K. A., Maren, S. Context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala represents fear memories after extinction. J Neurosci. 23, 8410-8416 (2003).
- Maren, S., Hobin, J. A. Hippocampal regulation of context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala. Learn Mem. 14, 318-324 (2007).
- Knapska, E., et al. Differential involvement of the central amygdala in appetitive versus aversive learning. Learn Mem. 13, 192-200 (2006).
- Harloe, J. P., Thorpe, A. J., Lichtman, A. H. Differential endocannabinoid regulation of extinction in appetitive and aversive Barnes maze tasks. Learn Mem. 15, 806-809 (2008).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63, 43-54 (1995).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, (1998).
- Skinner, B. F.
- Herrnstein, R. J. Relative and absolute strength of response as a function of frequency of reinforcement. J Exp Anal Behav. 4, 267-272 (1961).
- Brown, P. L., Jenkins, H. M.
- Epstein, R., Kirshnit, C. E., Lanza, R. P., Rubin, L. C. 34;Insight" in the pigeon: antecedents and determinants of an intelligent performance. Nature. 308, 61-62 (1984).
- Mazur, J. E. Varying initial-link and terminal-link durations in concurrent-chains schedules: a comparison of three models. Behav Processes. 66, 189-200 (2004).
- Herrnstein, R. J., Loveland, D. H.
- Stüttgen, M. C., Yildiz, A., Güntürkün, O. Adaptive criterion setting in perceptual decision making. J Exp Anal Behav. 96, 155-176 (2011).
- Stüttgen, M. C., Kasties, N., Lengersdorf, D., Starosta, S., Güntürkün, O., Jäkel, F. Suboptimal criterion setting in a perceptual choice task with asymmetric reinforcement. Behav Processes. 96, 59-70 (2013).
- Rose, J., Otto, T., Dittrich, L. The Biopsychology-Toolbox: a free, open-source Matlab-toolbox for the control of behavioral experiments. J Neurosci Methods. 175, (2008).
- Bilkey, D. K., Muir, G. M. A low cost, high precision subminiature microdrive for extracellular unit recording in behaving animals. J Neurosci Methods. 92, 87-90 (1999).
- Bilkey, D. K., Russell, N., Colombo, M. A lightweight microdrive for single-unit recording in freely moving rats and pigeons. Methods. 30, 152-158 (2003).
- Gallistel, C. R., Gibbon, J.
- Starosta, S., Güntürkün, O., Stüttgen, M. C. Stimulus-response-outcome coding in the pigeon nidopallium caudolaterale. PLoS One. 8, (2013).
- McNaughton, B. L., O'Keefe, J., Barnes, C. A. The stereotrode: a new technique for simultaneous isolation of several single units in the central nervous system from multiple unit records. J Neurosci Methods. 8, 391-397 (1983).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. J Neurosci. 31, 8699-8705 (2011).
