Summary
Lære nye stimulus-respons foreninger indgreb med en bred vifte af neurale processer, der i sidste ende afspejles i skiftende spike produktion af individuelle neuroner. Her beskriver vi en adfærdsmæssig protokol giver mulighed for løbende registrering af enkelt neuron aktivitet, mens dyr erhverve, slukke, og generhverve en betinget svar inden for en enkelt eksperimentel session.
Abstract
Mens emnet læring har tiltrukket stor interesse fra både adfærdsmæssige og neurale videnskabsfolk har kun relativt få efterforskere observeret enkelt neuron aktivitet, mens dyrene henter et operantly betinget reaktion, eller når dette svar er slukket. Men selv i disse tilfælde, observationsperioder normalt omfatter kun en enkelt etape af læring, dvs erhvervelse eller udslettelse, men ikke begge (undtagelser omfatter protokoller beskæftiger tilbageførsel læring se Bingman m.fl. 1 for et eksempel.). Men køb og udslettelse medføre forskellige mekanismer læring og forventes derfor at være ledsaget af forskellige typer og / eller loci af neural plasticitet.
Derfor har vi udviklet en adfærdsmæssig paradigme, som institutter tre stadier af læring i en enkelt adfærdsmæssige session og som er velegnet til samtidig optagelse af enkelte neuroner 'handling potentialer. Dyr enre uddannet på et enkelt interval tvunget valg opgave, som kræver kortlægning hver af to mulige valg reaktioner på præsentationen af forskellige nye visuelle stimuli (køb). Efter at have nået en forudbestemt ydelse kriterium, en af de to choice svarmuligheder ikke længere styrkes (ekstinktion). Efter en vis formindskelse i præstationsniveau, er korrekte svar forstærket igen (generhvervelse). Ved hjælp af et nyt sæt af stimuli i hver session, kan dyrene gennemgå købet-udslettelse-generhvervelse proces flere gange. Da alle tre stadier af læring sker i en enkelt adfærdsmæssige session paradigmet er ideel til den samtidige observation af spiking output af flere enlige neuroner. Vi bruger duer som modelsystemer, men opgaven kan nemt tilpasses til andre arter er i stand til betinget indlæring diskrimination.
Introduction
Lære nye stimulus-respons-outcome foreninger engagerer en bred vifte af neurale plasticitet processer. Disse processer er afspejles i sidste ende skiftende spike produktion af individuelle neuroner. Velsagtens en af de hyppigst anvendte læring paradigmer er pavlovsk frygt condition udført med gnavere. I denne indstilling, køb og udryddelse af en betinget reaktion finde sted inden for et par dusin forsøg 2. Den hurtige udvikling af konditioneret frygt kan være fordelagtigt, fordi det giver mulighed for at køre et stort antal dyr inden for en kort tid. Også, kan observeres erhvervelse og udslettelse inden for et par snese forsøg med en enkelt dag i naive dyr 3,4 eller spredt over 2 til 3 dage 2,5-8. Imidlertid fik indsigt om ændringerne af neural aktivitet under læring i disse eksperimenter ikke nødvendigvis gælder uden for området af frygt condition. For eksempel målrettet adfærd drevet af positivetive forstærkning mere fyldestgørende modelleret af operant snarere end Pavlovs condition procedurer, og kan til dels afhænge af forskellige neurale substrater 9,10. Også frygt condition udvikler sig så hurtigt, at neurale reaktioner på CS kun kan observeres i et par dusin forsøg placere alvorlige grænser for analysen af ændringer i neural aktivitet under indlæring.
Desværre, erhvervelse og udslettelse af operant reagerer normalt tager mange dage. Dette er skadeligt for neurofysiologiske undersøgelser, fordi det er notorisk vanskeligt at optage aktiviteten af enkelte celler i mere end nogle få timer. Grund af den høje lighed mellem de bølgeformer af ekstracellulært indspillede virkningspotentialer, er det problematisk at hævde, at spikes er optaget på én dag er genereret ud fra den samme celle som spikes med lignende kurver optaget på den næste 11,12, især i områder med høj celletæthed såsom hippocampus.
(Columbia livia forma domestica) er klassiske modelorganismer i eksperimentel psykologi 13-17. Disse fugle er i stand til at udføre komplekse visuelle forskelsbehandling 18, kan fleksibelt tilpasse adfærd til skiftende forstærkning uforudsete 19,20, og er entydigt ivrig arbejdstagere, der udfører 1.000 forsøg med minimal mængde af armering. Disse egenskaber gør dem særligt egnede til de nedenfor beskrevne forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiske retningslinjer
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de tyske retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr i videnskaben. Reglerne blev godkendt af en national etisk komité i staten Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
System oversigt
Operant Test Chamber
Den operant kammer (figur 1) måler 34 cm x 34 cm x 50 cm. Tre gennemskinnelige respons nøgler (4 cm x 4 cm, som ligger cirka 20 cm over gulvhøjde) er forsænket i bagvæggen af kammeret. Stimuli bliver vist gennem en LCD fladskærm monteret bag respons nøgler. To 2-Watt pærer placeret på sidevæggene giver dim belysning. Kammeret har til huse i en lyddæmpende aflukke at maskere uvedkommende lyde. Højttalere giver hvid støj på alle tidspunkter. Fødevarer (korn) som leveres af en fødevare tragt placeret under centis nøgle. Eksperimentel hardware styres af custom-skrevet Matlab kode 21. Dyr overvåges konstant gennem et digitalt kamera fastgjort til den forreste væg i kammeret.
Specialbyggede Microdrives
Microdrives hus 16 elektrodeledninger er specialbygget i vores laboratorium; designet er baseret på arbejde af Bilkey og kolleger 22,23, og læseren henvises til disse artikler til en detaljeret beskrivelse. Vi ændret deres design for at give mulighed for et større antal elektroder (16 i stedet for 8, 25 um nikkelchromlag ledninger), og vi forbinder elektrodetrådene via ledende sølv lim på hovedtrin stikket. Derudover bruger vi forgyldning af elektroden tips til at reducere impedans og at opnå bedre signal-til-støj-forhold (gælder -3 V for ~ 3 sek impedanser skulle falde til <100 kohm).
Når mikrodrev er samlet, er elektroder skæres til den ønskede længde, tips er cleaned i et ultralydsbad (Tergazyme i destilleret vand) i 20 minutter og skylledes yderligere 20 minutter i destilleret vand. Forgyldning af elektrodespidserne bør finde sted umiddelbart før implantation. For grundstødning, bruger vi en sølvkugle elektrode placeret over den laterale lillehjernen. Specifikation af materialer er fastsat i Materials tabel, der ledsager denne artikel.
Et vigtigt spørgsmål, når man arbejder med frit bevægelige dyr er bevægelse artefakter. Vi fandt, at bevægelse artefakter i vores opsætninger skyldes i høj grad a) høj elektrode impedanser (> 500 kohm) og b) ufuldkommen fastgørelse af kontakterne mellem proppen (implantat) og stikket (hovedtrin), mens dyret er i bevægelse. En række af kommercielt tilgængelige microconnectors ikke fungerer tilfredsstillende til optagelse i frit bevægelige fugle, fordi den mekaniske kontakt mellem stik og stikkontakt hurtigt forringes gennem energiske bevægelser af duer (head-vugger, key-hakke). Den bedste mekanisk forbindelse mellem implantat og hovedtrin blev opnået med headplug samlinger fra Ginder Scientific. Disse plug-socket forsamlinger har 18 kontakter, og er fast fastgjort til hinanden ved en ring møtrik.
Elektrofysiologiske Recording Setup
Elektrofysiologi setup består af følgende komponenter: 1) en specialbygget hovedtrin med enhed gevinst (operationsforstærker) 2) 15 differential forstærker-moduler opstaldet i to rack enheder (DPA-2FS og EPMS-07, henholdsvis NPI electronic GmbH, Tyskland ), 3) et 16-kanals analog-til-digital-konverter (effekt 1401 mærket I). Rå signaler forstærkes 1.000 x og band-pass filtreret (500-5.000 Hz, 1. ordens filter), digitaliseret med en samplingfrekvens på 16-20 kHz og lagres med Spike2 Version 7.06a til offline forarbejdning. Arrangementets tid (såsom stimulus debut eller individuelle centrale pecks af dyret) er fanget via et laboratorium indbygget parallel port IO box (se Rose; M.fl. 21) og sendes til AD konverter til opbevaring sammen med de neurofysiologiske data (se figur 1).. Offline behandling er beskrevet yderligere nedenfor.
Figur 1.. Systemoversigt. Informationsflow er symboliseret ved farvede pile. Computer 1 styrer hardware vedrørende adfærdsmæssig output (stimulus display via fladskærm, hus lys, mad hopper, feeder lys, respons tangenter) og sender event tidsstempler til AD konverter. Computer 2 lagrer neurofysiologiske opnåede signaler fra A / D-konverter og event tidsstempler modtaget fra computer 1.. Fotografiet til venstre viser konditioneringskammeret inde i lyddæmpende aflukke. Dens elementer er: 1) Lyd-formildende skal, 2-4) respons nøgles, 5) mad hopper, 6) feeder lys 7) hus lys, 8) observation kamera.
Single-interval-Tvungen Choice (SIFC) Forskelsbehandling Task
For klarhedens skyld vil vi beskrive den endelige SIFC opgave her og derefter forklare de nødvendige skridt for at træne dyrene på denne opgave nedenfor.
Den SIFC opgave er skitseret i fig. 2. Efter intertrial interval (ITI) er gået, er midterste tast gennemlyst grøn i op til 5 sekunder (initialisering fase "). Umiddelbart efter den tredje reaktion af dyret inden for 5 sekunder, er en ud af flere eksempler stimuli præsenteres på center-tasten i 2 sek ("prøve fase« eksempel stimuli er vist i det indsatte til figur 2). Efter 2 sek, er center-tasten igen gennemlyste grøn, og dyret skal reagere gang mere inden de to side tasterne gennemlyste ('bekræftelse fase "). Afhængig af identiteten af stimulus visti prøven fase dyret kræves til at lede en enkelt reaktion på enten venstre eller højre tast ("valg fase"). Hvis det vælger den korrekte destination, adgang til at belønne (korn) gives for 2 sek. Således kernen i opgaven består i at reagere på den venstre valg nøglen efter fremlæggelse af et bestemt stimulus på midten nøglen, og reagere på det rigtige valg nøglen efter præsentation af en anden stimulus. Grunden til, at prøven fase efterfølges af en initialisering og en bekræftelse fase er at holde dyrenes hoved foran midten nede, mens prøven stimulus præsenteres.
Når dyret mestre denne opgave for et enkelt par stimuli (fremover, vante 'stimuli, FS), det præsenteres med en roman stimulus (NS) par i hver ny session, og har til at lære, hvilke af de to nye stimuli er at blive efterfulgt af en reaktion til venstre eller det rigtige valg tasten. FS parret fortsætter med at blive præsenteret i løbet af thOSE eksperimenter til at tjene som egnet kontrol tilstand. Tilstrækkelig præstation på den afsluttende opgave er stærkt afhængig af dyrenes villighed til at udføre> 1.000 forsøg på generel styrkelse sandsynligheder <0,5. De følgende afsnit beskriver en uddannelse procedure, hvor opgaven kompleksitet gradvist, indtil dyret når niveauet af SIFC; på samme tid, forstærkning sandsynlighed og antal forsøg per session skal øges for at sikre en konsekvent høj ydeevne på den endelige opgave.
1.. Animal Training
- Mad begrænsning
- Dyrene efter mindst to ugers fri adgang til mad afvejes. Tag denne vægt som fri-fodring vægt. Begræns mad adgang over de næste 1-2 uger, indtil dyrene nå 85% af deres gratis-fodring vægt.
- Det er afgørende, at duer opretholde et sundt udseende og normal aktivitet i hele varigheden af hele eksperimentet. Tilherpå omhyggeligt overvåge dyrenes udseende og vægt i hele varigheden af adfærdsmæssige uddannelse og test. Dyr vejes før og efter hver eksperimentel session for at vurdere daglige fødeindtagelse. Levere yderligere mad hvis det er nødvendigt for at forhindre yderligere vægttab. Give ubegrænset adgang til mad i løbet af weekenden.
- Autoshaping
Autoshaping tjener til at vænne dyret til den eksperimentelle kammer og etablere betinget reagere.- Præsenter en 5 sekunders visuel stimulus (fremover, initialisering stimulus, IS) på midten tasten. Umiddelbart efter afslutning af IS eller en enkelt hakke til nøglen respons (hvad der kommer først), slukke centrale belysning og nuværende mad belønning (2 sek aktivering af den mad tragt).
- Hold ITI betydeligt længere end prøven præsentationen tid til at fremme læring 24. Brug værdier på 120 sek for ITI og køre 40 forsøg per dag. Senere genbruge ISsom initialiseringen, bekræftelse og valg nøgleimpuls i den endelige opgave (se figur 2). Denne fase af uddannelsen vil tage dyrene cirka en uge.
- Når dyret reagerer pålideligt (i> 85% af forsøg), mindske ITI trinvis ned til 10 sek og prøven præsentationen tid ned til 2 sek. På samme tid øges antallet af svar er nødvendige for forstærkning til 3 (fast forhold på 3, FR 3). Derudover øge det samlede antal forsøg per dag. Vælg parametre, således at dyret er trænet hver dag i cirka 1 time. Denne fase af uddannelsen vil vare omkring 2 uger.
- Gentag trin 1.2.1 - 1.2.3 til venstre og højre respons nøgler indtil emner pålideligt reagere på IS på alle 3 taster. Alternative forsøg med aktivering af venstre, højre og center nøgle tilfældigt.
- Nu præsentere først i midten og derefter betinget af et svar, på begge sider nøgle (udelad forstærkning for denmidterste tast respons). Suppleant aktiverede sidetasterne tilfældigt fra forsøg til forsøg. Afslut forsøg, hvor emnet ikke reagerer på centrum nøglen efter 5 sek. Gentag, indtil dyret udfører pålideligt (~ 3 dage).
- Indføre 2 nye stimuli, som senere vil tjene som FS i den sidste opgave (se figur 2, indpresningsdybde, for eksempler). Gentag trin 1.2.1 - 1.2.3 med disse stimuli. Reaktion vil blive etableret hurtigere end med den første stimulus, normalt inden for 4 dage.
Figur 2. Illustration af adfærdsmæssige paradigme. Efter en ITI på 5 sek, er midterste tast gennemlyst grøn i op til 5 sekunder (initialisering). Hvis dyret reagerer 3x inden for disse 5 sekunder, 1 ud af 4, Prøve stimuli præsenteres på samme position. Efter en fast prøve præsentation på 2 sek, hvor dyret skal reagere mindst én gang, er det centrale hakke nøgle gennemlyste grøn igen (bekræftelse). Efter endnu en hakke, er de 2 sidetasterne gennemlyste grøn. Emnet viser sit valg ved at reagere en gang til en af side nøgler. Under anskaffelse og genanskaffelse, er korrekte svar efterfulgt af 2 sek mad adgang ledsaget af aktivering af feeder lys, eller aktivering af feeder lys alene. Hvis forkert, er hus lys slukket i 3 sek. Under uddø, både rigtige og forkerte svar til udslettelse stimulus forblive ligegyldig. Indsatte viser eksempel nye og velkendte stimulus par.
- Uddannelse af en Single-interval Tvungen-Choice (SIFC) Opgave for Familiar Stimuli
- Etablere den fulde sekvens af initialisering, prøve, bekræftelse og valg: for hvert forsøg, nuværende first IS (FR 3), så en af de to FS (2 sek fast varighed), så igen IS (FR 1). Brug et bedt choice design: i hvert forsøg, transilluminate kun valget nøgle, som er korrekt for den givne FS. Denne fase af uddannelse bør tage ca 1 uge.
- Når emnet udfører pålideligt (> 85% svar til den respektive side-tasten), indføre gratis choice forsøg (begge Sidetaster gennemlyste under valg fase). Hvis dyret reagerer på den korrekte side, giver føde adgang for 2 sek. Forkerte svar efterfølges af time-out straf (houselights efter 2 sek.) Hvis der ikke svares inden for 3 sek afslutte retssag og re-start ITI. Dyr lærer som regel disse delkomponenter opgaven inden for 2 uger.
- Gradvist øge fraktionen af frit-valg-forsøg i efterfølgende sessioner fra 20% til 100%.
- Hvis motivet udfører> 90% korrekt i fri-choice forsøg mindske belønning sandsynlighed for korrekte svar til 0,5mens parallelt øge antallet af forsøg per session til 1.000. Du må ikke ændre parametrene hver dag / session, men vælger dem fleksibelt afhængigt af niveauet af emnet vedrørende initialisering udeladelser og procentdelen af korrekte svar ydeevne. Denne fase af uddannelsen vil vare ca 4 uger.
- Duer har en tendens til at nægte at reagere på ukendte stimuli. Derfor, når dyret pålideligt udfører> 1.000 forsøg, autofigur svar på et stort sæt af visuelle stimuli (se afsnit 1.2). Du skal dog ikke preexpose de visuelle stimuli bestemt til senere brug som nye stimuli i sidste paradigme, men ensartet farve skærme.
- Final Single-interval Tvungen-Valg Task med nye stimuli under forskellige Forstærkning Betingelser
- Warm-up
Lad emnet udføre 50 forsøg med kun FS. Sæt belønning sandsynlighed for disse stimuli til <1 (sige, 0,5 til 0,8) i alle faser for at forebygge for tidlig mæthed, ogderfor, mangel på motivation til at reagere. - Erhvervelse Stage
Tilfældigt alternative forsøg med præsentation af FS og NS. Tildele forskellige respons taster som korrekt for de to NS og styrke hver korrekt svar. Beregn procentdelen af korrekte svar som et løbende gennemsnit over de sidste 120 forsøg. Akkvisitionen betragtes som fuldstændig, når ydeevne for hver af de NS overstiger 85%, men ikke før minimum 150 forsøg er blevet henrettet. - Extinction Stage
Stop styrkelse korrekte og straffe forkerte svar til en tilfældig NS (udslettelse stimulus). Begynd generhvervelsesfasen når korrekt at reagere på udslettelse stimulus falder til under 60%, og dyret har oplevet mindst 150 forsøg i denne fase i alt. - Generhvervelse fase
Igen styrke korrekt og straffe forkerte svar til udryddelsen stimulus, som i løbet af købet scenen. Afslut session, når ydeevne for denne stimulus overstiger 85%, og animals udført mindst 150 forsøg i denne fase i alt.
- Warm-up
2. Elektrofysiologi
- Elektrode Implantation
Implantering finder sted efter dyrene gentagne gange (3-4x) gennemførte hele købet-udslettelse-generhvervelse sekvens og er beskrevet mere detaljeret andetsteds 25.- Placer 5-6 rustfrit stål microsrews på kraniet til forankring en dental cement hovedmonteringsindretningen herunder Microdrive.
- Udfør en craniotomy lige over hjernen region af interesse; derefter forsigtigt dissekere dura og sænke elektroderne til den ønskede position.
- Før forankring Microdrive til hovedet montere, anvende vaseline omkring vejledning kanyle; dette vil forhindre dental cement fra omslutter styrerøret.
- Brug en isoleret sølvkugle elektrode placeret under kraniet overliggende lillehjernen som jorden.
- Give dyr med smertestillende (carprofen, 10 mg / kg, injiceres to gange dagligt) i tre dage efter operationen. Tillade, at dyr til at komme sig i mindst 2 uger.
- Optagelser Mens Dyr udføre opgaven
- Brug et par nye nye stimuli for hver session og forlods elektroder på mindst 125 m (en halv omdrejning af drevet skrue) før start. Hvis ingen handling potentialer i tilstrækkelig signal-til-støj-forhold er overholdt, afbryde sessionen, skal du placere dyret i hjemmet bur og prøv igen den næste dag.
- Arranger hovedtrin ledningen, så den ikke forstyrrer dyrets normale hakke og fodring adfærd. Dette kan opnås ved at fastgøre kablet med flere elastiske stropper til toppen af konditioneringskammeret og habituating fuglene i det tilsluttede kabel i nogle timer.
- Hvis det er tilgængeligt, gøre brug af en kommutator til at give ekstra bevægelsesfrihed for fuglene.
- Offline signalanalyse
- Band-pass-filter alle kanaler fra 500 til 5.000 Hz med stejl roll-offs offline med Spike2. Uddrag spikes med amplitude tærskler, og sortere dem manuelt beskæftiger principal komponent analyse.
- Undersøg sortering resultater med custom-skrevet Matlab kode (findes på MATLAB Central File Exchange, File ID # 37339). Et godt isoleret enkelt enhed (Figur 3), skal opfylde alle følgende kriterier: a) en klart adskilt klynge i hovedbestanddel rum, b) ingen tegn på flere enheder, når alle optagne kurver overlejret og plottet som zonekort (figur 3A ), c) fordelt symmetrisk spids bølgeform amplituder (figur 3B), d), stabil optagelse under hele mødet som det fremgår af uforanderlige spike amplitude (figur 3C), e) ingen eller meget få spike begivenheder, der opstår i løbet af den refraktære periode i det foregående spike (figur 3D), og et signal-til-støj-forhold (SNR) på mindst 2 (SNR er her defined som forskellen mellem minimum og maksimum af den gennemsnitlige spike bølgeform, divideret med den trimmede bredde af støj-båndet (2,5 th og 97,5 th percentiler i fordelingen af værdier fra den første bakke af alle kurver)). SNR af apparatet vist i figur 3 er 3,9.
- Efterse rå kanaler offline i bevægelse-relaterede artefakter. Kassér kanaler, når indiceret.
- Elektriske artefakter, der opstår under nøgle hakke kan i sjældne tilfælde forveksles med ordentlig spike kurver. Test for forurening af optagelserne ved at undersøge time histogram spike tæller i forhold til hver registreret tast hakke (peri-peck tid histogram PPTH, figur 3E). Hakke-induceret artefakter vise sig som et højdepunkt i histogrammet tæt (± 50 ms) til tiden 0. Som en ekstra kontrol, plotte kurver alle formodede spike begivenheder registreret inden for ± 20 msek af en nøgle hakke separat og sammenligne det med spike kurver opdaget outside dette vindue (Figur 3F).
Figur 3.. Kvalitet målinger for enhed isolation. A) Varme kort over alle kurveformer 'tid spænding værdier. B) fordelinger af maksimum (rød), minimum (grøn) og støj (blå) spænding værdier i alle kurver. Fordelingerne er godt adskilt, hvilket indikerer fremragende enhed isolation. C) Spontan skudhastighed (rød, beregnet ud fra 2-sec segmenter i alle intertrial intervaller) og spike amplituder (peak-to-peak) som en funktion af tid i session. Begge kurver blev glattet med en boxcar-funktion (bredde: 50 datapunkter) D) Interspike-interval fordeling til denne enhed.. Bin bredde 10 msek (inset: 1 msek). Meget korte intervaller er næsten fraværende (<0,1% af intervaller under 4 msek). <strong> E) PSTH udløst til centrale Pecks. Event-tæller tæt på nøglen hakke (± 20 ms) er fremhævet rødt. F) Alle 157 waveforms optaget inden for ± 20 msek om nøglebegivenheder hakke. Bølgeformerne sammenligne positivt til den samlede bølgeform vist i panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behavior
Figur 4A viser adfærdsmæssige resultater af et dyr i et eksempel session. Niveauet af dyret ydeevne når kriterium for NS 2 inden for 180 forsøg (45 stimulus præsentationer) og er tæt på 100% for NS 1 fra begyndelsen. Denne strategi - først reagerer på den samme nøgle til både nye stimuli, og derefter justere svar til en af de stimuli - er omtrent lige så ofte observeret som indledende tilfældig reagere på begge NS. I denne session blev NS 2 tilfældigt udvalgt til at gennemgå udslettelse, hvilket betyder, at alle valg efter denne stimulus forblive ligegyldig (overgangen mellem trin læring er angivet med lodrette sorte stiplede linjer). Under uddø, ydeevne falder for udryddelsen stimulus, men forbliver højt for de andre NS. Kriterium er nået i forsøg 370. Rigtige og forkerte svar er nu styrket og straffes igen (generhvervelse) og performance niveauet når kriterium i. forsøg 402 resultat for FS er konstant høj (> 95%, data ikke vist). b) Middel antal forsøg, der er nødvendige for at afslutte hver fase af læring (gennemsnit over 5 dyr og 44 sessioner i alt). I gennemsnit dyr behov ~ 700 forsøg til at reagere konsekvent reagere korrekt. Extinction tog ~ 900 forsøg, og generhvervelse blot omkring 60 forsøg, væsentligt mindre end den oprindelige erhvervelse (figur 4B).
Figur 4.. Eksempel adfærdsmæssige resultater. A) En fugl præstation for de 2 nye stimuli på tværs af alle tre faser af læring. Kurver skildrer procent korrekte valg (gennemsnit over de sidste 120 forsøg, svarende til 30 præsentationer af de respektive stimulus) som en funktion af det samlede antal forsøg, separat for roman stimulos 1 roman stimulus 2, og i gennemsnit på tværs af begge stimuli. Performance til velkendte stimuli var konsekvent over 95% korrekt (data ikke vist) B) Gennemsnitligt antal forsøg er nødvendige for at opnå kriterium resultater i hver af de tre faser af læring.; fejlsøjler, SEM.
Neural data
Figur 5 viser reaktionsmønster af to enheder i nidopallium caudolaterale (NCL) indspillet, mens et dyr var udfører SIFC opgaven. Reaktion modulation under præsentationen af NS er vist i figur 5A. I købet fase enhederne reagerer stærkt til NS 2 (udpeget til at uddø), med svarene faldende mod slutningen af fase erhvervelse og lille ændring i fyring i de to andre faser af læring. Der er lidt reagerer på NS 1 over hele sessionen. Stigningen svar omkring 3-4 sek efter prøve stimulus debut skyldes belønne levering. Aktivitetsniveauetvedrørende velkendte stimuli ikke blev moduleret (data ikke vist).
Figur 5B viser respons mønster af en anden NCL enhed registreret under SIFC. Dette neuron reagerer i løbet af højre-men ikke mod venstre bevægelser (øverst til venstre), som tyder på sensomotoriske kodning. Men svar styrke ændret sig gennem stadier af læring: de to nederste paneler viser spike tæthedsfunktioner (SDFs), der udløses til højregående valg af den ene velkendte (til venstre) og en roman stimulus (til højre), opdelt i successive kvartiler at illustrere udviklingen i hele den eksperimentelle session. Svarene var lavere for den velkendte stimulus hele sessionen, selvom den gennemsnitlige bevægelse tider for de to stimulus betingelser var meget ens (øverst til højre). Desuden svarene under højregående valg efter præsentation af romanen, men ikke den velkendte stimulus faldt i løbet af den eksperimentelle session (ikke modsvares af et fald i baseline granning sats). Således faldt både neuroner fyring som en særlig ny stimulus blev mere velkendt, med neuron i figur 5B, som koder for en bestemt bevægelse i tillæg til nyhed af stimulus forud for denne bevægelse.
Figur 5.. Reaktionsmønstre fra to eksempler, der konstateres under SFIC opgaven. A) Spike tæthedsfunktioner udløst til starten på den 2 nye stimuli NS 1 og NS 2 (øvre og nedre række, henholdsvis), delt op i 3 læring faser (kolonner ), med svarene i hver indlæringsfase igen delt op i 3 lige store dele (begyndelsen, midten, sent). NS 2 blev udpeget til udslettelse. PSTHs (bin bredde 1 ms) blev glattet med en eksponentielt modificeret Gaussisk kerne (σ = 100 msek og τ = 100 ms). B)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en kompleks adfærdsmæssig opgave er egnet til samtidige single-unit optagelser. Vi har beskrevet SIFC opgave for duer, men det kan nemt tilpasses til gnavere ved at kræve næse stikker eller løftestang trykke snarere end centrale Tønde, og erstatte visuel af olfaktoriske, auditive eller taktile stimuli.
Måske den mest kritiske trin under proceduren uddannelse er 1) gradvis reduktion af belønning sandsynlighed og 2) stigning i forsøg nummer. Med hensyn til intermitterende forstærkning for de velkendte stimuli, besluttede vi på belønning sandsynligheder spænder fra 0,5 til 0,8; disse er høje nok til at producere en stabil ydeevne, men lav nok til at forhindre for tidlig mæthed. Når det er sagt, mange fugle er villige til at udføre godt for belønning sandsynligheder ned til 0,2.
Det store antal forsøg per session (500-1,500) er nødvendig, fordi erhvervelse, udslettelse, og generhvervelse af konditioneret reagere simply kræver det mange forsøg, og fordi den præcise beregning af fyring satser er vanskeligt med mindre end fx 25 forsøg, især når du optager fra neuroner med lav fyring satser (i NCL, baseline fyring satser er <1 Hz). Derfor sætter vi det mindste antal forsøg der er nødvendige for at gennemføre en lærende fase, således at hver stimulus er vist mindst 35 gange.
For en naiv dyr, træning på SIFC opgave tager cirka 4 måneder, men den nøjagtige varighed afhænger meget af den enkelte. På grund af de høje krav til opgaven, er det meget sandsynligt, at ikke alle dyr vil ende klarer sig godt på det sidste paradigme. Hvis en person fugl springer alt for mange forsøg eller producerer høje fejlprocenter under træning, skal du ikke tøve med at erstatte dette emne. Det er vores erfaring, er det meget sandsynligt, at dette dyr vil aldrig udføre den endelige opgave.
De fleste tidligere undersøgelser gennemfører single-unit optagelser ifrit bevægelige duer undladt at registrere motorens output under optagelsen. Dette komplicerer fortolkningen af neuronale reaktioner i kritiske perioder af forsøgene, ligesom prøve præsentation eller forsinkelse faser 25. Dette problem er iboende i go / no-go opgaver, hvor forsøgslederen normalt ikke ved, hvad motivet er laver på no-go forsøg; samme forbehold gælder for både hukommelse opgaver inkorporerer en længere forsinkelse. For at opnå kontrol over flytning af dyrene uden at anvende hoved-fiksering, designede vi en opgave, hvor dyrene er nødt til at udføre den samme handling (nøgle hakke), selv om betingelserne (prøve stimuli) forandring. I vores SIFC paradigme, både visuelt input samt motor output er velkontrollerede og konstant overvåges. Da der kræves dyr at hakke på hver prøve stimulus hele dens præsentation, vi holder motor output konstant, mens dyrene kigger stimuli med forskellige historier læring. Vi er i øjeblikket udforsker methods at opnå en endnu bedre styring af motorens output, såsom at knytte et accelerometer til hovedtrin til kontinuerlig registrering af hovedbevægelser. Desuden er vi ved at udvikle metoder til måling af kraft for hver tast hakke ved hjælp af en mechanoelectric transducer.
Vores paradigme tillader udrede bidrag sensoriske, motoriske og kognitive variable til neurale fyring satser ved at identificere typiske neurale reaktionsmønstre. For eksempel ville en premotor neuron for venstregående reaktioner forventes at øge fyring i prøven fase, når dyret kommer til at gøre en venstregående respons, uanset stimulus identitet. På samme måde ville simple motoriske neuroner forventes at fyre under nøgle hakke eller venstre eller mod højre bevægelse. En neuron repræsenterer belønning forventning, på den anden side ville brand under prøven fase og mere for FS end NS under tidlig erhvervelse (fordi subjektive belønning sandsynlighed er højere på FS end NS trIALS før NS er lært), men dette bør vende senere, når NS er konsekvent klassificeret korrekt (fordi objektiv belønning sandsynlighed er højere på korrekte NS forsøg). Endelig neuroner reagerer på bestemte stimuli funktioner ventes at fyre konsekvent for en af de stimuli prøve uden nogen ændring tværs stadier af læring.
Fordi ekstracellulær enhed optagelse er tilbøjelige til at optage pigge fra flere enheder på et tidspunkt 11,26, inspicere en række af kvalitets målinger er vigtigt at klassificere pigge som hidrørende fra en enkelt eller fra flere neuroner 27. Brug tetrodes stedet for enkelte elektroder ville helt sikkert give en ekstra stigning i sortering kvalitet 11. Dette bør overvejes, når optagelser i hjernen regioner med høj celledensitet (f.eks hippocampus) eller meget høj spontan aktivitet (såsom entopallium) er beregnet til. Men microplugs vi anvender, er kun tilgængelig for op til 18 forbindelser, der for nu udgør en øvre grænse for det samlede antal optagekanaler.
I sum, udviklede vi en opgave af høj kompleksitet til ikke-primater forsøgsdyr. Denne opgave blev skræddersyet til at muliggøre undersøgelse af læring fænomener med enkelt-neuron optagelser, men på samme tid er egnet til at tackle emner såsom kategorisering, beslutningstagning, og belønning kodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra den tyske Research Foundation (DFG) til MCS (FOR 1581 STU 544/1-1) og OL (FOR 1581 SFB 874). Hjemmesiden for DFG er http://www.dfg.de/en/index.jsp. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuscript.The Forfatterne takker Thomas Seidenbecher til at forsyne os med guldbelægning protokol samt Tobias Otto hjælp til opsætning af elektrofysiologiske kontrolapparatet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resistance wire (for use as electrodes) | California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA | Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm) | |
| Microconnectors | Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada | GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage) | |
| Cannulae | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4" | |
| Gold solution for plating | Neuralynx, Bozeman, MT, USA | SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355 | |
| Solution for ultrasonic bath | Alconox, Inc., New York, USA | 1304 | Tergazyme |
| Conductive glue | Henkel Loctite | LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive | |
| Stainless steel screws | J.I. Morris, Southbridge, MA, USA | F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches | |
| Light-curing dental cement | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Omniceram Evo Flow A2 | |
| Light-curing unit | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit) | |
| Filter amplifiers | npi electronic GmbH, Germany | DPA-2FS | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | power 1401 | |
| Spike2 software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Version 7.06a | |
| MATLAB | The Mathworks, Natick, MA, USA | R2012a |
References
- Bingman, V. P., Gasser, B. A., Colombo, M. Responses of pigeon (Columba livia) wulst neurons during acquisition and reversal of a visual discrimination task. Behav Neurosci. 122, 1139-1147 (2008).
- Herry, C., Ciocchi, S., Senn, V., Demmou, L., Müller, C., Lüthi, A. Switching on and off fear by distinct neuronal circuits. Nature. 454, 600-606 (2008).
- Quirk, G. J., Repa, C., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances short-latency auditory responses of lateral amygdala neurons: parallel recordings in the freely behaving rat. Neuron. 15, 1029-1039 (1995).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., Ledoux, J. E. Components of Tone-Evoked Spike Trains in Auditory Cortex and Lateral Amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Maren, S. Auditory fear conditioning increases CS-elicited spike firing in lateral amygdala neurons even after extensive overtraining. Eur J Neurosci. 12, 4047-4054 (2000).
- Milad, M. R., Quirk, G. J. Neurons in medial prefrontal cortex signal memory for fear extinction. Nature. 420, 713-717 (2002).
- Hobin, J. A., Goosens, K. A., Maren, S. Context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala represents fear memories after extinction. J Neurosci. 23, 8410-8416 (2003).
- Maren, S., Hobin, J. A. Hippocampal regulation of context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala. Learn Mem. 14, 318-324 (2007).
- Knapska, E., et al. Differential involvement of the central amygdala in appetitive versus aversive learning. Learn Mem. 13, 192-200 (2006).
- Harloe, J. P., Thorpe, A. J., Lichtman, A. H. Differential endocannabinoid regulation of extinction in appetitive and aversive Barnes maze tasks. Learn Mem. 15, 806-809 (2008).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63, 43-54 (1995).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, (1998).
- Skinner, B. F. 34;Superstition" in the pigeon. J Exp Psychol. 121, 273-274 (1948).
- Herrnstein, R. J. Relative and absolute strength of response as a function of frequency of reinforcement. J Exp Anal Behav. 4, 267-272 (1961).
- Brown, P. L., Jenkins, H. M. Auto-shaping of the pigeon's key-peck. J Exp Anal Behav. 11, 1-8 (1968).
- Epstein, R., Kirshnit, C. E., Lanza, R. P., Rubin, L. C. 34;Insight" in the pigeon: antecedents and determinants of an intelligent performance. Nature. 308, 61-62 (1984).
- Mazur, J. E. Varying initial-link and terminal-link durations in concurrent-chains schedules: a comparison of three models. Behav Processes. 66, 189-200 (2004).
- Herrnstein, R. J., Loveland, D. H. Complex visual concept in the pigeon. Science. 146, 549-551 (1964).
- Stüttgen, M. C., Yildiz, A., Güntürkün, O. Adaptive criterion setting in perceptual decision making. J Exp Anal Behav. 96, 155-176 (2011).
- Stüttgen, M. C., Kasties, N., Lengersdorf, D., Starosta, S., Güntürkün, O., Jäkel, F. Suboptimal criterion setting in a perceptual choice task with asymmetric reinforcement. Behav Processes. 96, 59-70 (2013).
- Rose, J., Otto, T., Dittrich, L. The Biopsychology-Toolbox: a free, open-source Matlab-toolbox for the control of behavioral experiments. J Neurosci Methods. 175, (2008).
- Bilkey, D. K., Muir, G. M. A low cost, high precision subminiature microdrive for extracellular unit recording in behaving animals. J Neurosci Methods. 92, 87-90 (1999).
- Bilkey, D. K., Russell, N., Colombo, M. A lightweight microdrive for single-unit recording in freely moving rats and pigeons. Methods. 30, 152-158 (2003).
- Gallistel, C. R., Gibbon, J. Time, rate, and conditioning. Psychol Rev. 107, 289-344 (1993).
- Starosta, S., Güntürkün, O., Stüttgen, M. C. Stimulus-response-outcome coding in the pigeon nidopallium caudolaterale. PLoS One. 8, (2013).
- McNaughton, B. L., O'Keefe, J., Barnes, C. A. The stereotrode: a new technique for simultaneous isolation of several single units in the central nervous system from multiple unit records. J Neurosci Methods. 8, 391-397 (1983).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. J Neurosci. 31, 8699-8705 (2011).
