Summary
Lære nye stimulus-respons assosiasjoner i inngrep med en rekke nerveprosesser som er til syvende og sist er reflektert i skiftende pigg produksjon av individuelle neuroner. Her beskriver vi en atferds protokoll som åpner for fortløpende registrering av enkeltnervecellen aktivitet mens dyr erverve, slukke, og gjenanskaffe en betinget reaksjon i løpet av en enkelt eksperimentell økt.
Abstract
Mens gjenstand for læring har vakt enorm interesse fra både atferdsmessige og nevrale forskere, har bare relativt få etterforskere observert single-neuron aktivitet mens dyr er å anskaffe en operantly betinget reaksjon, eller når dette svaret er slukket. Men selv i disse tilfellene, observasjonsperioder vanligvis omfatter bare en enkelt scene for læring, dvs. oppkjøp eller utryddelse, men ikke begge (unntakene omfatter protokoller ansette reversering læring, se Bingman et al en for eksempel.). Men, kjøp og utryddelse medfører ulike læringsmekanismer og forventes derfor å være ledsaget av forskjellige typer og / eller loci av nevral plastisitet.
Følgelig har vi utviklet et atferds paradigme som institutter tre stadier av læring i en enkelt atferds sesjon og som er godt egnet for samtidig opptak av enkelt nevroner 'aksjonspotensialer. Dyr enre trent på en enkelt-intervall tvunget valg oppgave som krever kartlegging hver av to mulige valget svar til presentasjon av ulike nye visuelle stimuli (oppkjøp). Etter å ha nådd en forhåndsdefinert kriterium ytelse, en av de to valget svar ikke lenger er forsterket (utryddelse). Etter en viss minsk i prestasjonsnivå, er riktige svar forsterket igjen (reacquisition). Ved hjelp av et nytt sett av stimuli i hver sesjon, kan dyrene gjennomgå oppkjøpet-utryddelse-reacquisition prosessen gjentatte ganger. Fordi alle tre stadier av læring skjer i et enkelt atferds sesjon, er paradigmet ideelt for samtidig observasjon av spiking produksjonen av flere enkeltnerveceller. Vi bruker duer som modellsystemer, men oppgaven kan enkelt tilpasses andre arter som betinget diskriminering læring.
Introduction
Lære nye stimulus-respons-utfallet foreninger engasjerer et bredt spekter av nevrale plastisitet prosesser. Disse prosessene er i siste instans til uttrykk i de skiftende pigg produksjon av individuelle neuroner. Uten tvil, en av de hyppigst anvendt lærings paradigmer er Pavlovian frykt condition utført med gnagere. I denne innstillingen, erverv og utryddelse av en betinget reaksjon skje innen et par dusin forsøk to. Den raske utviklingen av kondisjonert frykt kan være en fordel fordi det gjør det mulig å kjøre et stort antall dyr i løpet av kort tid. Dessuten kan observeres oppkjøp og utdøing innen noen titalls forsøk på en enkelt dag i naive dyr 3,4 eller spredt over 2 til 3 dager 2,5-8. Men den innsikten opparbeidet om endringer av nevral aktivitet under læring i disse forsøkene ikke nødvendigvis gjelde utenfor domenet av frykt condition. For eksempel, målrettet atferd drevet av positive forsterkning er mer tilstrekkelig modellert av operant snarere enn Pavlovian condition prosedyrer, og kan delvis være avhengig av ulike nevrale substrater 9,10. Dessuten utvikler frykt condition så raskt at nevrale responser til CS kun kan observeres for et par dusin studier, plassere alvorlige begrensninger på analyse av endringer av nevral aktivitet under læring.
Dessverre, erverv og utryddelse av operant svarer vanligvis tar mange dager. Dette er skadelig for nevrofysiologiske undersøkelser, fordi det er svært vanskelig å registrere aktiviteten til enkeltceller over mer enn noen få timer. På grunn av den høye likheten av kurvene av ekstracellulært registrert aksjonspotensialer, er det problematisk å hevde at toppene er spilt inn på en dag genereres fra samme celle som pigger med lignende bølgeformer er tatt opp på neste 11,12, spesielt i områder med en høy celletetthet, for eksempel hippocampus.
(Columbia livia forma domestica) er klassiske modellorganismer i eksperimentell psykologi 13-17. Disse fuglene er i stand til å utføre komplekse visuelle diskrimi 18, kan fleksibelt tilpasse atferden til skiftende forsterkningsbetingelser 19,20, og er unikt ivrige arbeidere, utføre 1000 forsøk med minimal mengde av armering. Disse karakteristika gjør dem spesielt egnet for eksperimentene som er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Erklæring
Alle forsøkene ble gjennomført i henhold til de tyske retningslinjer for stell og anvendelse av dyr innen vitenskap. Prosedyrene ble godkjent av en nasjonal etisk komité i delstaten Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Systemoversikt
Operant Testing Chamber
Den operant kammer (Figur 1) måler 34 cm x 34 cm x 50 cm. Tre gjennomskinnelig svartastene (4 cm x 4 cm, som ligger ca 20 cm over gulvet) er innfelt i bakveggen av kammeret. Stimuli er vist gjennom en LCD flatskjerm montert bak svartastene. To 2-watt lyspærer plassert på sideveggene gir dim belysning. Kammeret ligger i en lyd-demping bås å maskere uvedkommende lyder. Høyttalere gi hvit støy til alle tider. Mat (korn) er levert av en mat kasse plassert under senteh nøkkelen. Eksperimentell hardware styres av custom-skrevet MATLAB kode 21. Dyr blir konstant overvåket via et digitalt kamera festet til frontveggen av kammeret.
Custom-bygget Microdrive
Microdrive som huser 16 elektrode ledninger er spesialbygd i vårt laboratorium; designet er basert på arbeid av Bilkey og kolleger 22,23, og leseren blir henvist til disse artiklene for en detaljert beskrivelse. Vi endret sin design for å gi rom for et større antall elektroder (16 i stedet for 8, 25 mikrometer Nichrom ledninger), og vi kobler elektrodetråder via sølv ledende lim til heads kontakten. I tillegg bruker vi gull-plating av elektrode tips for å redusere impedans og for å oppnå bedre signal-til-støy-forhold (gjelder -3 V for ~ 3 sekunder; impedans bør slippe til <100 kW).
Når Microdrive er montert, er elektroder kuttes til ønsket lengde, tips er cleaned i et ultrasonisk bad (Tergazyme i destillert vann) i 20 minutter og skylles ytterligere 20 minutter i destillert vann. Gullplett av elektrodetuppene bør skje umiddelbart før implantasjon. For jording, bruker vi en sølv ball elektrode plassert over den laterale cerebellum. Spesifikasjon av materialer er gitt i Materials tabell som følger denne artikkelen.
Et viktig spørsmål når du arbeider med fritt bevegelige dyr er bevegelse gjenstander. Vi fant ut at bevegelse gjenstander i våre oppsett er i stor grad skyldes a) høy elektrode impedanser (> 500 kohm) og b) dårlig feste av kontakter mellom pluggen (implantat) og kontakten (heads) mens dyret er i bevegelse. En rekke kommersielt tilgjengelige microconnectors utfører ikke tilfredsstillende for opptak fra fritt bevegelige fugler, fordi den mekaniske kontakten mellom støpsel og stikkontakt forverres raskt gjennom kraftige bevegelser av duene (hode-bobbing, key-pecking). Den beste mekanisk forbindelse mellom implantat og heads ble oppnådd med headplug forsamlinger fra Ginder Scientific. Disse plug-socket forsamlinger har 18 kontakter, og er godt festet til hverandre med en ringmutteren.
Elektroopptaksoppsett
Den elektrofysiologi oppsett består av følgende komponenter: 1) en spesialbygd heads med enhet gevinst (operasjonsforsterker) 2) 15 differensial forsterker moduler plassert i to monteringsstativ enheter (DPA-2Fs og EPMS-07, henholdsvis, NPI Electronic GmbH, Tyskland ), 3) en 16-kanals analog-til-digital omformer (power 1401 mark I). Rå signaler forsterkes 1000 x og band-pass filtrert (500-5000 Hz, 1 st ordre filter), digitalisert med en samplingsfrekvens på 16-20 kHz og lagret med Spike2 Versjon 7.06a for offline behandling. Arrangementets tid (som stimulans utbruddet eller individuelle nøkkel skjepper dyret) fanges via et laboratorium-bygget parallellport IO boksen (se Rose, Et al 21) og videresendt til den AD-omformer for oppbevaring sammen med de nevrofysiologiske data (se figur 1).. Offline behandlingen er nærmere beskrevet nedenfor.
Oversikt Figur 1. System. Informasjonsflyt er symbolisert ved fargede pilene. Datamaskin en kontroller maskinvare knyttet til atferds utgang (stimulus-skjerm via flatskjermen, hus lys, mat hopper, mater lys, respons nøkler) og sender hendelsestidsstempler til AD konverter. Computer to butikker nevrofysiologiske signaler innhentet fra A / D-konverter og event tidsstempler mottatt fra datamaskin en. Bildet til venstre viser condition kammer inne i lyd-demping bås. Dens elementer er: 1) Lyd dempende skall, 2-4) respons nøkkelens, 5) mat hopper, 6) mater lys 7) hus lys, 8) Observation Camera.
Single-intervall-Forced-Choice (SIFC) Diskriminering Task
For klarhet, vil vi beskrive den endelige SIFC oppgave her og deretter forklare fremgangsmåten for å trene dyr på denne oppgaven nedenfor.
Den SIFC oppgaven er skissert i figur 2. Etter intertrial intervall (ITI) er utløpt, er den midtre tasten transilluminated grønt for opptil 5 sek ('initialiseringsfasen'). Umiddelbart etter den tredje reaksjon av dyret i løpet av 5 sekunder, er en av flere prøvestimuli presentert på midttasten i 2 sekunder ("sample fase '; eksempel stimuli er vist i den innfelte til figur 2). Etter 2 sek, er den midtre tasten igjen transilluminated grønt, og dyret har å svare en gang til før de to sidetastene er transilluminated ('bekreftelsesfasen'). Avhengig av identiteten til stimulans visti prøven fasen, blir dyret som kreves for å dirigere en enkelt reaksjon på enten den venstre eller den høyre tasten ("valg fase"). Hvis den velger riktig destinasjon, få tilgang til å belønne (korn) gis for 2 sek. Således kjernen av oppgaven består i å reagere på det venstre grepet nøkkel etter presentasjon av en bestemt stimulus på midttasten, og svarer til det riktige valget nøkkel etter presentasjon av en annen stimulans. Grunnen til at prøven fase klammen av en initialisering og en bekreftelse fase er å holde dyrets hode foran midttasten mens prøven stimulus er vist.
Når dyret mestere denne oppgaven for en enkelt par av stimuli (heretter, 'kjente' stimuli, FS), det er presentert med en ny stimulus (NS) par i hver ny økt, og har til å lære hvilke av de to romanen stimuli er for å bli etterfulgt av en reaksjon på venstre eller høyre valget tast. FS paret fortsetter å bli presentert i løpet av those eksperimenter for å tjene som egnet kontrolltilstand. Tilstrekkelig ytelse på den siste oppgaven hengsler avgjørende om dyrenes vilje til å utføre> 1000 studier på samlede forsterkningssannsynlig <0,5. De følgende avsnitt beskriver en treningsprosedyre hvori oppgave kompleksitet blir gradvis inntil dyret når nivået av SIFC; på samme tid, forsterkning sannsynlighet og antall forsøk per sesjon må økes for å sikre konsekvent høy kvalitet på det endelige aktiviteten.
En. Animal Training
- Mat Restriction
- Vei dyrene etter minst to uker med fri tilgang til mat. Ta denne vekten som fri-fôring vekt. Begrense mat adgang løpet av de neste 1-2 uker før dyrene å nå 85% av deres frie foring vekt.
- Det er viktig at duer opprettholde et sunt utseende og normal aktivitet i løpet av varigheten av hele eksperimentet. Åat slutten, nøye overvåke dyrenes utseende og vekt over hele varigheten av atferdstrening og testing. Vei dyr før og etter hver eksperimentell økt for å vurdere daglige matinntak. Supplering av mat hvis det er nødvendig for å hindre ytterligere vekttap. Gi ubegrenset tilgang til mat i løpet av helgen.
- Autoshaping
Autoshaping tjener til å tilvenne dyret til forsøkskammeret og etablerer betinget respons.- Presentere en 5-sek visuelle stimulus (heretter, initialisering stimulans, IS) på midttasten. Umiddelbart etter avslutning av IS eller en enkelt Peck til responsnøkkelen (det som kommer først), slå av tastebelysning og presentere mat belønning (2 sek aktivering av maten hopper).
- Hold ITI betydelig lengre enn prøven presentasjonen tid til å legge til rette for læring 24. Bruk verdier på 120 sek for ITI og kjøre 40 forsøk per dag. Senere gjenbruk ISsom initialisering, bekreftelse og valg nøkkel stimulans i den siste oppgaven (se figur 2). Denne fasen av opplæringen vil ta dyrene ca en uke.
- Når dyret responderer på en pålitelig (i> 85% av forsøkene), redusere ITI trinnvis ned til 10 sekunder, og prøven presentasjonstids ned til 2 sek. På samme tid, øke antall responser som er nødvendige for forsterkning av 3 (fast forhold på 3, FR 3). Dessuten øker det totale antall prøver pr. Velge parametre, slik at dyret blir trent hver dag i omtrent 1 time. Denne fasen av opplæringen vil vare omtrent to uker.
- Gjenta trinn 1.2.1 - 1.2.3 for venstre og høyre respons tastene til fagene pålitelig svare på IS på alle tre tastene. Alternative studier med aktivering av venstre, høyre og sentrum nøkkelen tilfeldig.
- Nå presentere IS først på midten og deretter, betinget av en reaksjon, på en av sidetastene (utelate forsterkning forsentrere tasteresponsen). Alternative aktivert sidetastene tilfeldig fra rettssaken til rettssaken. Avslutt forsøk der motivet ikke reagerer på den midtre tasten etter 5 sek. Gjenta til dyret utfører en pålitelig måte (~ 3 dager).
- Introdusere to nye stimuli som senere vil tjene som FS i den siste oppgaven (se figur 2, innfelt, for eksempler). Gjenta trinn 1.2.1 - 1.2.3 med disse stimuli. Svare vil bli etablert raskere enn med den første stimulus, vanligvis innen fire dager.
Figur 2. Illustrasjon av atferds paradigme. Etter en ITI av 5 sek, er på midttasten transilluminated grønt for opptil 5 sek (initialisering). Hvis dyret reagerer 3x innenfor disse 5 sek, en ut av fire; Prøvestimuli er presentert i den samme posisjonen. Etter en fastsatt prøve presentasjon tid på 2 sekunder under hvilken dyret har til å reagere i det minste en gang, er den sentrale hakker tasten transilluminated grønt igjen (bekreftelse). Etter nok en Peck, er de to sidetastene transilluminated grønt. Faget viser sitt valg ved å svare en gang til en av sidetastene. Ved anskaffelse og reacquisition, er korrekte svar, etterfulgt av 2-sec mat adgang fulgt av aktivering av lys mater, eller aktivering av mate lys alene. Hvis feil, er huset lysene slått av for 3 sek. Under utryddelse, både riktige og feil svar til utryddelse stimulans fortsatt ubetydelig. Inset viser eksempel romanen og kjent stimulans parene.
- Opplæring av en Single-intervall Forced-Choice (SIFC) Oppgave for Familiar Stimuli
- Etablere full sekvens av initialisering, sample, bekreftelse og valg: på hvert forsøk, nåtid fiRST IS (FR 3), og deretter en av de to FS (2-sek fast varighet), og deretter igjen IS (FR 1). Bruk en bedt-valg utforming: i hvert forsøk, transilluminate bare valget nøkkel som er riktig for den gitte FS. Denne fasen av opplæringen bør ta ca en uke.
- Når emnet utfører pålitelig (> 85% svar til de respektive sidetast), innføre gratis valgs studier (både sidetastene transilluminated under valget fase). Hvis dyret responderer på riktig side, gir mat tilgang i 2 sek. Feil svar blir etterfulgt av time-out straff (houselights off for 2 sek). Hvis ingen respons er gitt innen 3 sek, avslutte prøving og re-starte ITI. Dyr vanligvis lære disse underkomponentene av oppgaven innen to uker.
- Gradvis øke andelen av frie valg prøvelser under påfølgende økter fra 20% til 100%.
- Hvis motivet utfører> 90% korrekt i fri-choice prøvelser, redusere belønning sannsynligheten for riktige svar til 0,5mens parallelt øke antall forsøk per økt til 1000. Ikke endre parametrene hver dag / sesjon, men velger dem fleksibelt avhengig av ytelsesnivået i faget om initialisering unnlatelser og prosentandel av riktige svar. Denne fasen av opplæringen vil vare i ca 4 uker.
- Duer tendens til å nekte å svare på ukjente stimuli. Derfor, når dyret pålitelig utfører> 1000 studier, en autofigur svar på et stort sett med visuelle stimuli (se pkt. 1.2). Men ikke preexpose de visuelle stimuli bestemt for senere bruk som nye stimuli i den endelige paradigmet men ensartede fargeskjermer.
- Endelig Single-Intervall Tvunget Valgs oppgave med Novel Stimuli under forskjellige Armerings betingelser
- Warm-up
La motivet utføre 50 studier med bare FS. Sett belønning sannsynligheten for disse stimuli til <1 (si, 0,5 til 0,8) i alle faser for å hindre for tidlig metning, ogderfor, mangel på motivasjon til å svare. - Oppkjøp Stage
Tilfeldig alternative studier med presentasjon av FS og NS. Tildele ulike respons nøkler som riktig for de to NS og forsterke hvert riktig svar. Beregn prosentandelen av riktige svar som en løpende gjennomsnitt over de siste 120 studier. Oppkjøpet anses som fullført når resultatene for hver av de NS overstiger 85%, men ikke før et minimum av 150 studier har blitt utført. - Extinction Stage
Stopp forsterkende riktige og straffe feil svar til en tilfeldig NS (utryddelse stimulus). Begynn reacquisition fase når riktig å svare på utryddelse stimulans faller under 60%, og dyret har opplevd minst 150 forsøk i denne fasen totalt. - Reacquisition scenen
Igjen forsterke riktig og straffe feil svar til utryddelse stimulans, som under oppkjøpet scenen. Avslutt økten når ytelsen for denne stimulans overstiger 85% og animals utføres minst 150 forsøk i denne fasen totalt.
- Warm-up
2. Electrophysiology
- Elektrode Implantasjon
Implantasjon kirurgi skjer etter dyrene flere ganger (3-4x) fullførte hele kjøpet-utryddelse-reacquisition sekvens og er beskrevet i mer detalj et annet sted 25.- Plasser 5-6 rustfritt stål microsrews på skallen for å forankre en dental sement hodet montere inkludert Microdrive.
- Utfør en kraniotomi like over hjernen regionen av interesse; deretter forsiktig dissekere dura og senk elektrodene til ønsket posisjon.
- Før forankring Microdrive til hodet montere, bruke vaselin rundt guiden kanyle; dette vil hindre dental sement fra encasing styrerøret.
- Bruk en isolert sølv ball elektrode plassert under skallen liggende lillehjernen som bakken.
- Gi dyr med smertestillende (Carprofen, 10 mg / kg, injisert to ganger daglig) i tre dager etter kirurgi. Tillater dyrene å komme seg i minst 2 uker.
- Recordings Mens Dyr utføre oppgaven
- Bruk et par nye romanen stimuli for hver økt og forhånd elektroder minst 125 mikrometer (en halv omdreining av drivskruen) før du starter. Hvis ingen aksjonspotensialer av tilstrekkelig signal-til-støy-forhold er observert, avbryte økten, legg hunden i hjemmet buret og prøv igjen neste dag.
- Ordne heads kabelen slik at den ikke forstyrrer dyrets normale hakker og fôring atferd. Dette kan oppnås ved å feste kabelen med flere elastiske stropper til toppen av kondisjoneringskammeret og habituating fuglene til vedlagte kabelen i noen timer.
- Hvis tilgjengelig, gjøre bruk av en kommutatoren å gi ekstra bevegelsesfrihet for fuglene.
- Offline signal analyser
- Band-pass-filter alle kanaler fra 500 til 5000 Hz med bratt roll-offs pålogget bruker Spike2. Pakk pigger med amplitude terskler og sortere dem manuelt ansette prinsipal komponent analyse.
- Undersøke sortering resultater med skredder skrevet MATLAB kode (tilgjengelig på MATLAB Central filutveksling, File ID # 37339). En godt isolert enkelt enhet (figur 3) skal oppfylle alle de følgende kriterier: a) et klart adskilt klynge i prinsipal komponent plass, b) ingen tegn til flere enheter når alle registrerte bølgeformer er kledde og plottet som varmekartet (figur 3A ), c) symmetrisk fordelt peak bølgeformamplitudene (Figur 3B), d) stabil opptak gjennom hele økten som gjenspeiles av uforanderlig pigg amplitude (Figur 3C), e) ingen eller svært få pigg hendelser som oppstår i løpet av den ildfaste periode foregående pigg (fig. 3D), og et signal-til-støy-forhold (SNR) av i det minste to (SNR er her defined som forskjellen mellom minimum og maksimum av den gjennomsnitt spiss bølgeform, delt på den trimmede bredden av støybåndet (2,5 th, og 97,5 th prosent av fordelingen av verdier fra den første hyllen i alle kurvene)). SNR av apparatet vist i figur 3 er 3,9.
- Inspiser rå kanaler offline for bevegelsesrelaterte gjenstander. Kast kanaler når indikert.
- Elektriske gjenstander som oppstår under nøkkel hakker kan i sjeldne tilfeller forveksles med riktig pigg bølgeformer. Test for forurensning av opptakene ved å undersøke den tiden histogram av spike teller i forhold til hver registrerte nøkkel Peck (peri-hakke tid histogram, PPTH, figur 3E). Hakke-indusert gjenstander viser seg som en topp i histogrammet nær (± 50 ms) til tid 0. Som en ekstra sjekk, plotte kurver av alle antatte pigg registrerte hendelser innenfor ± 20 ms av en nøkkel Peck separat og sammenligne det å pigge bølgeformer oppdaget outside dette vinduet (Figur 3F).
Figur 3. Kvalitet beregninger for enhet isolasjon. A) Heat kart over alle bølgeformer 'tid-spenningsverdier. B) Utdeling av maksimum (rød), minimum (grønn), og støy (blå) spenningsverdier av alle bølgeformer. De fordelinger er godt atskilt, noe som indikerer utmerket enhet isolasjon. C) Spontan skuddtakt (rød, beregnet ut fra 2-sek segmenter i alle intertrial intervaller) og pigg amplituder (peak-to-peak) som en funksjon av tid i sesjonen. Begge kurver ble glattet med en lukket godsvogn funksjon (bredde: 50 datapunkter) D) Interspike-intervall distribusjon for denne enheten.. Bin bredde, 10 msek (innfelt: 1 msek). Veldig korte intervaller er nesten fraværende (<0,1% av intervaller under 4 msek). <strong> E) PSTH utløst til viktige pecks. Hendelses teller nær styrings Peck (± 20 msek) er markert rødt. F) Alle 157 kurver registrert innenfor ± 20 msek av nøkkel Peck hendelser. Kurvene sammenligne gunstig til generelle bølgeform formen vist i panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behavior
Fig. 4A viser de atferdsmessige utførelsen av et dyr i et eksempel økt. Ytelsesnivået på dyret når kriteriet for NS 2 innen 180 studier (45 stimulans presentasjoner) og er nær 100% for NS en fra begynnelsen. Denne strategien - først å reagere på samme tast for både nye stimuli, og deretter justere svar for en av de stimuli - er omtrent like ofte observert som innledende tilfeldig å svare på begge NS. I denne sesjonen ble NS to tilfeldig valgt å gjennomgå utryddelse, noe som betyr at alle valgene som følger denne stimulans forbli ubetydelig (overgang mellom læringsstadier er indikert med vertikale svarte stiplede linjer). Under utryddelse, reduserer ytelsen for utryddelse stimulans, men forblir høy for den andre NS. Criterion er nådd i rettssaken 370. Riktige og feil svar er nå forsterket og straffet igjen (reacquisition) og prestasjonsnivået når kriterium i. prøve 402 Effektnivået for FS er gjennomgående høy (> 95%, data ikke vist). b) Gjennomsnittlig antall studier trengs for å fullføre hvert trinn av læring (gjennomsnitt over fem dyr og 44 økter totalt). I gjennomsnitt, dyr trengs ~ 700 forsøk for å svare konsekvent svare riktig. Extinction tok ~ 900 studier, og reacquisition bare ca 60 forsøk, vesentlig mindre enn det opprinnelige kjøpet (Figur 4B).
Eksempel atferds resultater. A) Figur 4. Ett fugle ytelse for de to nye stimuli på tvers av alle tre stadier av læring. Kurver avbilder prosent riktig valg (gjennomsnitt over de siste 120 forsøk, svarende til 30 presentasjoner av de respektive stimulus) som en funksjon av det totale antall prøver, hver for seg for ny stimuloss en, stimulans romanen 2, og i gjennomsnitt over begge stimuli. Resultater for kjente stimuli var konsekvent over 95% riktig (data ikke vist) B) Gjennomsnittlig antall studier trengs for å oppnå kriteriet ytelse i hver av de tre stadier av læring.; feilfelt, SEM.
Neural data
Figur 5 viser responsmønster av to enheter i nidopallium caudolaterale (NCL) registreres mens et dyr utførte de SIFC oppgave. Respons modulasjon under presentasjonen av NS er vist i figur 5A. I ervervet fasen enhetene reagerer sterkt til NS 2 (betegnet for utryddelse), med responser avtagende mot slutten av anskaffelses fase og liten endring i avfyring i løpet av de to andre faser av læring. Det er lite å svare på NS 1 over hele økten. Responsen økning rundt 3-4 sek etter at prøven stimulans utbruddet skyldes belønne levering. Aktivitetsnivåetvedrørende kjente stimuli ble ikke modulert (data ikke vist).
Figur 5B viser reaksjonsmønsteret til en annen NCL enhet registrert under SIFC. Dette nevron reagerer under høyre-men ikke mot venstre bevegelser (øverst til venstre), som kan tyde på sensorimotor koding. Men responsen styrke forandret seg gjennom stadier av læring: de to nederste panelene viser spike tetthetsfunksjoner (SDFs) utløses til høyrevridde valg for en kjent (til venstre) og en roman stimulus (til høyre), delt opp i påfølgende kvartiler for å illustrere utviklingen over den eksperimentelle økten. Svarene var lavere for den kjente stimulans gjennom hele sesjonen, selv om gjennomsnittlig bevegelse tider for de to tiltaks forholdene var svært likt (øverst til høyre). Videre responser under høyre-valg etter fremstilling av den nye, men ikke den kjente stimulus ble redusert i løpet av den eksperimentelle sesjonen (ikke parallelt med en reduksjon i utgangs firing rate). Således, både neuroner redusert avfyring som en spesiell ny stimulus ble stadig mer kjent, med nervecellen i figur 5B som koder for en bestemt bevegelse i tillegg til nyhet av stimulus foregående at bevegelse.
Figur 5. Response mønstre fra to eksempel enheter registrert i løpet av SFIC oppgaven. A) Spike tetthet funksjoner utløst til utbruddet av to romanen stimuli NS 1 og NS 2 (øvre og nedre rad, henholdsvis), delt opp for tre læringsfaser (søyler ), med svar i hver læring fase igjen delt opp i tre like deler (tidlig, midt, sen). NS 2 ble utpekt for utryddelse. PSTHs (bin bredde 1 ms) ble glattet med en eksponentielt modifisert Gaussian kernel (σ = 100 msek og τ = 100 msek). B)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en kompleks atferds oppgave egnet for samtidige enkelt enhet innspillinger. Vi har beskrevet SIFC oppgave for duer, men det kan enkelt tilpasses til gnagere ved å kreve nese kakker eller spaken trykke snarere enn nøkkel pecks, og erstatte visuelle ved olfactory, hørbar, eller taktile stimuli.
Kanskje de mest kritiske trinn under treningen prosedyren er 1) gradvis reduksjon av belønning sannsynlighet og 2) økning i prøvenummer. Angåintermitterende forsterkning for de kjente stimuli, besluttet vi på belønning sannsynlighetene spenner 0,5 til 0,8; disse er høy nok til å gi stabil ytelse, men lav nok til å forhindre for tidlig metning. Når det er sagt, mange fugler er villige til å gjøre det bra for belønning sannsynlighetene ned til 0,2.
Det store antall studier per økt (500-1,500) er nødvendig fordi kjøpet, utryddelse, og reacquisition av betinget reagerer simply krever dette mange prøvelser, og fordi den presise estimering av avfyring priser er vanskelig med mindre enn for eksempel 25 studier, spesielt ved opptak fra nevroner med lave avfyring priser (i NCL, baseline avfyring priser er <1 Hz). Følgelig setter vi minimum antall studier er nødvendige for å fullføre en lærings stadium slik at hver stimulus vises minst 35 ganger.
For en naiv dyr, trening på SIFC oppgaven tar ca 4 måneder, men den eksakte varigheten er svært avhengig av den enkelte. På grunn av de høye kravene til oppgaven, er det ganske sannsynlig at ikke alle dyrene vil ende opp med gode resultater på den endelige paradigmet. Hvis en person fuglen hopper altfor mange prøvelser eller produserer høye feilrater under trening, ikke nøl med å erstatte dette emnet. I vår erfaring, er det overveiende sannsynlig at dette dyret aldri vil utføre skikkelig på den siste oppgaven.
De fleste tidligere studier gjennomføre enkelt enhet opptak ifritt bevegelige duer mislyktes å registrere motoreffekt under opptak. Dette kompliserer tolkningen av nevrale responser i kritiske perioder av forsøkene, som prøve presentasjon eller forsinkelse faser 25. Dette problemet er iboende i go / no-go oppgaver der eksperimentator vanligvis ikke vet hva faget gjør på no-go studier; det samme forbeholdet gjelder å jobbe hukommelsesoppgaver innlemme en langvarig forsinkelse periode. For å oppnå kontroll over bevegelsen av dyrene uten å bruke hode-fiksering, designet vi en oppgave der dyr har til å utføre den samme handlingen (tast hakker), selv om forhold (prøve stimuli) endring. Etter vårt SIFC paradigme, er både visuelle input samt motoreffekt godt kontrollert og kontinuerlig overvåket. Siden dyr er nødvendig å hakke på hver prøve stimulans gjennom sin presentasjon, holder vi motoreffekt konstant mens dyrene ser stimuli med ulike læringshistorier. Vi er for tiden utforsker methods for å oppnå enda bedre kontroll av motorutgang, slik som å feste et akselerometer til heads for kontinuerlig registrering av hodebevegelser. Vi er også å utvikle metoder for måling av kraften av hver tast Peck ved hjelp av en mekanoelektrisk transduser.
Vår paradigmet gjør løsrive bidrag fra sensoriske, motoriske og kognitive variabler til nevrale avfyring priser ved å identifisere typiske nevrale reaksjonsmønster. For eksempel vil en premotor nevron for mot venstre svar kan forventes å øke avfyring under prøvefasen når dyret kommer til å gjøre en mot venstre respons, uavhengig av stimulus identitet. Tilsvarende ville enkle motoriske nerveceller forventes å fyre under nøkkel hakker, eller venstre-eller høyrerettet bevegelse. En neuron representerer belønning forventning, på den annen side, ville brann i løpet av prøvefase, og mer for FS enn NS under tidlig kjøp (fordi subjektive belønning sannsynligheten er høyere på FS enn NS trials før NS er lært), men dette bør reversere senere når NS er konsekvent klassifisert riktig (fordi objektiv belønning sannsynligheten er høyere på riktige NS forsøk). Endelig er nerveceller som reagerer på bestemte stimuli funksjoner forventes å fyre konsekvent for et av prøve stimuli uten noen endring på tvers stadier av læring.
Fordi ekstracellulære enhet innspillingen er utsatt for rekord toppene fra flere enheter på en gang 11,26, inspisere en rekke kvalitets beregninger er viktig å riktig klassifisere pigger som stammer fra en enkelt eller fra flere nevroner 27. Bruke tetrodes i stedet for enkeltelektroder vil sikkert gi en ytterligere økning i sortering kvalitet 11. Dette bør tas i betraktning når opptak i hjernen regioner med høy celletetthet (for eksempel hippocampus) eller svært høy spontan aktivitet (for eksempel entopallium) er ment. Men de microplugs vi bruker er bare tilgjengelig for opp til 18 tilkoblinger som for nå utgjør en øvre grense på det totale antall registreringskanaler.
I sum, utviklet vi en oppgave av høy kompleksitet for non-primate forsøksdyr. Denne oppgaven ble skreddersydd for å muliggjøre etterforskningen av læring fenomener med single-Nevron opptak, men samtidig er egnet til å takle fag som kategorisering, beslutningstaking, og belønning koding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra den tyske Research Foundation (DFG) til MCS (FOR 1581, STU 544/1-1) og OG (FOR 1581, SFB 874). Nettsiden til DFG er http://www.dfg.de/en/index.jsp. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuscript.The Forfatterne takker Thomas Seidenbecher for å gi oss med gull-plating protokoll samt Tobias Otto for hjelp med å sette opp den elektrofysiologisk opptaksutstyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resistance wire (for use as electrodes) | California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA | Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm) | |
| Microconnectors | Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada | GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage) | |
| Cannulae | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4" | |
| Gold solution for plating | Neuralynx, Bozeman, MT, USA | SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355 | |
| Solution for ultrasonic bath | Alconox, Inc., New York, USA | 1304 | Tergazyme |
| Conductive glue | Henkel Loctite | LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive | |
| Stainless steel screws | J.I. Morris, Southbridge, MA, USA | F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches | |
| Light-curing dental cement | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Omniceram Evo Flow A2 | |
| Light-curing unit | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit) | |
| Filter amplifiers | npi electronic GmbH, Germany | DPA-2FS | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | power 1401 | |
| Spike2 software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Version 7.06a | |
| MATLAB | The Mathworks, Natick, MA, USA | R2012a |
References
- Bingman, V. P., Gasser, B. A., Colombo, M. Responses of pigeon (Columba livia) wulst neurons during acquisition and reversal of a visual discrimination task. Behav Neurosci. 122, 1139-1147 (2008).
- Herry, C., Ciocchi, S., Senn, V., Demmou, L., Müller, C., Lüthi, A. Switching on and off fear by distinct neuronal circuits. Nature. 454, 600-606 (2008).
- Quirk, G. J., Repa, C., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances short-latency auditory responses of lateral amygdala neurons: parallel recordings in the freely behaving rat. Neuron. 15, 1029-1039 (1995).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., Ledoux, J. E. Components of Tone-Evoked Spike Trains in Auditory Cortex and Lateral Amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Maren, S. Auditory fear conditioning increases CS-elicited spike firing in lateral amygdala neurons even after extensive overtraining. Eur J Neurosci. 12, 4047-4054 (2000).
- Milad, M. R., Quirk, G. J. Neurons in medial prefrontal cortex signal memory for fear extinction. Nature. 420, 713-717 (2002).
- Hobin, J. A., Goosens, K. A., Maren, S. Context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala represents fear memories after extinction. J Neurosci. 23, 8410-8416 (2003).
- Maren, S., Hobin, J. A. Hippocampal regulation of context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala. Learn Mem. 14, 318-324 (2007).
- Knapska, E., et al. Differential involvement of the central amygdala in appetitive versus aversive learning. Learn Mem. 13, 192-200 (2006).
- Harloe, J. P., Thorpe, A. J., Lichtman, A. H. Differential endocannabinoid regulation of extinction in appetitive and aversive Barnes maze tasks. Learn Mem. 15, 806-809 (2008).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63, 43-54 (1995).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, (1998).
- Skinner, B. F. 34;Superstition" in the pigeon. J Exp Psychol. 121, 273-274 (1948).
- Herrnstein, R. J. Relative and absolute strength of response as a function of frequency of reinforcement. J Exp Anal Behav. 4, 267-272 (1961).
- Brown, P. L., Jenkins, H. M. Auto-shaping of the pigeon's key-peck. J Exp Anal Behav. 11, 1-8 (1968).
- Epstein, R., Kirshnit, C. E., Lanza, R. P., Rubin, L. C. 34;Insight" in the pigeon: antecedents and determinants of an intelligent performance. Nature. 308, 61-62 (1984).
- Mazur, J. E. Varying initial-link and terminal-link durations in concurrent-chains schedules: a comparison of three models. Behav Processes. 66, 189-200 (2004).
- Herrnstein, R. J., Loveland, D. H. Complex visual concept in the pigeon. Science. 146, 549-551 (1964).
- Stüttgen, M. C., Yildiz, A., Güntürkün, O. Adaptive criterion setting in perceptual decision making. J Exp Anal Behav. 96, 155-176 (2011).
- Stüttgen, M. C., Kasties, N., Lengersdorf, D., Starosta, S., Güntürkün, O., Jäkel, F. Suboptimal criterion setting in a perceptual choice task with asymmetric reinforcement. Behav Processes. 96, 59-70 (2013).
- Rose, J., Otto, T., Dittrich, L. The Biopsychology-Toolbox: a free, open-source Matlab-toolbox for the control of behavioral experiments. J Neurosci Methods. 175, (2008).
- Bilkey, D. K., Muir, G. M. A low cost, high precision subminiature microdrive for extracellular unit recording in behaving animals. J Neurosci Methods. 92, 87-90 (1999).
- Bilkey, D. K., Russell, N., Colombo, M. A lightweight microdrive for single-unit recording in freely moving rats and pigeons. Methods. 30, 152-158 (2003).
- Gallistel, C. R., Gibbon, J. Time, rate, and conditioning. Psychol Rev. 107, 289-344 (1993).
- Starosta, S., Güntürkün, O., Stüttgen, M. C. Stimulus-response-outcome coding in the pigeon nidopallium caudolaterale. PLoS One. 8, (2013).
- McNaughton, B. L., O'Keefe, J., Barnes, C. A. The stereotrode: a new technique for simultaneous isolation of several single units in the central nervous system from multiple unit records. J Neurosci Methods. 8, 391-397 (1983).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. J Neurosci. 31, 8699-8705 (2011).
