Summary
樹状細胞（DC）は、ニゲリシンとNLRP3ソーム活性化に続いて、合成プリン、R848のTLR8認識に応答してIL-1βを分泌し、したがって、IL-1βはNLRP3ソーム活性を測定するために使用することができる。細胞内サイトカイン染色、イムノブロッティング、およびELISAを正確にIL-1βの発現を介してNLRP3ソームプライミングおよび活性化を測定するために使用される。
Abstract
インターロイキン（IL）の分泌によって生じる炎症過程-1ファミリーのサイトカインの免疫細胞による組織リモデリングおよび修復、局所または全身性炎症につながる、とウイルス学的コントロール1、2。インターロイキン-1βは、自然免疫応答の重要な要素であり、持続感染1-5の確立を防止しながら、侵入する病原体を排除するために貢献しています。
ソームは1変換酵素（ICEまたはカスパーゼ1）、インターロイキンの活性化のための重要なシグナル伝達プラットフォームである。 NLRP3ソームは、IL-1β分泌6を起こしたDCに少なくとも2つの信号を必要とする。プロIL-1βタンパク質の発現は、休止細胞に限定される;従ってプライミング信号がIL-1βの転写およびタンパク質発現のために必要とされる。多タンパク質NLRP3ソームの形成にNLRP3結果によって感知された第二の信号。責任への樹状細胞の能力IL-1βの分泌に必要な信号をDが細菌毒素とNLRP3ソームの活性化に続いて首相細胞への樹状細胞（のMoDC）を誘導されたヒト単球にTLR8によって感知される合成プリン、R848を用いて試験することができ、カリウムイオ、ナイジェリシン。
単球由来DCは簡単に培養中に生産され、精製されたヒト骨髄性樹状細胞よりもはるかに多くの細胞を提供している。それは代わりにマウス由来の、樹状細胞は、このように人間の病気や感染症におけるソームの研究を可能にし、in vitroでヒトにおいて使用することをここで紹介する方法は、他のソームアッセイとは異なります。
Introduction
先天性免疫系の活性化は、感染、疾患、およびワクチン接種7の間に適応免疫応答を操縦する必要がある。樹状細胞は、自然免疫系の細胞に提示する最も強力な抗原であり;これらは、抗原の取り込み、リンパ節への移行、およびナイーブCD4 +およびCD8 +細胞溶解性T細胞の活性化を8-10に特化されている。迅速な病原体の検出を可能にするために、自然免疫系は、保存病原体に由来するモチーフまたは細胞ストレスおよび損傷のホスト派生マーカーを認識し、多数の生殖細胞系列符号化されたパターン認識受容体（PRR）を利用する。受容体（TLR）Toll様は、特定の細胞外貪食病原体関連分子パターン（PAMP）と危険の関連分子パターン（減衰）を認識膜結合パターン認識受容体である。受容体（NLRs）のようなコントラストのNODによって細胞質ゾルであり、のPAMPおよび減衰の多様な範囲に対応しています。受容体が再うなずく細胞表面とエンドサイトーシスPRRSを回避病原体に対する防御の2行を提示する。由来の病原体、または関連する「危険性」の相互作用は、TLRとNLR配位子を有する因子は、他の免疫細胞とT細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化11の推進と増加したDCとの相互作用を生じるDC成熟の状態に至る。
インターロイキン-1βは、感染に対する宿主防御の重要なコンポーネントです。微生物の認識に、高度に炎症性サイトカインIL-1βは、分泌され、化学誘引し、自然免疫と獲得免疫細胞の活性化因子として機能する。 インビボ IL-1βは、発熱や炎症性サイトカインなどの急性期反応の主な原因である合成12。
最もNLRsリガンドセンシング、IMPO中央ヌクレオチド結合ドメイン（NACHT）において機能すると考えられるC末端ロイシンリッチリピート領域を含有するNLRP3のオリゴマー化のためのrtant、およびタンパク質タンパク質相互作用を介して下流の標的へのシグナル伝達を媒介するN末端エフェクタードメイン（NLRP3でPYD）。 NLRP3タンパク質は、最も熱心に研究ソーム複合体を定義しています。このタンパク質は、NLRファミリーのメンバーであり、NLRP3（また、ASCとしても知られる）アダプタータンパク質PYCARD、及びICEの多層高分子タンパク質複合体を形成する能力を有する。ソーム活性化の際にPYCARDはNLRP3 N末端ドメインに結合し、カスパーゼ活性化および動員ドメイン（CARD）ドメインを介して氷を募集しています。インターロイキン-1変換酵素は、最初に、そのN末端CARDモチーフを含む酵素前駆体として生成される。彼らの自己触媒活性化を誘導するのに十分近い2 ICE分子を持って来ることでソーム形成の結果。ソーム複合体は、サイトカイン成熟細胞質プロIL-1βを変換することができ、従ってICEを活性化するために必要である。
イリノイ州の正常な分泌-1βDCにおける、2つの異なる独立した危険信号の検出を必要とします。まず、のPAMP、DAMPS、またはサイトカインシグナル伝達（TNFα又はIL-1β）のTLRの検出は、細胞質プロIL-1βタンパク質発現のアップレギュレーションを引き起こす。第二に、多くの場合、異なる信号を、氷の成熟の上流ソーム複合体形成に必要である。シグナルを刺激するいくつかのソーム（例えばナイジェリシンなど）の毒素、リソソーム撹乱（例えば尿酸一ナトリウム結晶として、MSU）結晶、および細胞外ATPを形成する細菌の膜の孔があります。これらの多様な活性化因子でNLRP3ソームの活性化をもたらす上流メカニズムは不明である。ソーム形成のシグナル伝達の上流を調査研究では、低カリウム血症の誘導や活性酸素種（ROS）のような細胞内イベントは、間接的にソーム13-28を活性化することを提案している。
NLRP3ソームの異なるウイルスの活性化剤の中でBを提供し、インフルエンザ、ですIL-1βの分泌3、29-33のために必要な一次および二次信号をOTH。 NLRP3ノックアウトマウスモデルを用いてそれがDCにおけるIL-1βの分泌が32 NLRP3依存することが見出された。さらに、NLRP3ノックアウトマウスは、感染部位に少ない白血球を集め、より高い死亡率2、5を経験した。二つの最近の論文は、インフルエンザウイルス感染時のNLRP3ソームの活性化のためのメカニズムを示唆している。第一、第二シグナルが続く細胞質プロIL-1β発現を誘導するTLR7またはTLR8（応答細胞のTLR発現に依存する）によって、または他のTLRによる共生細菌の検出を通じてウイルスRNA、NLRP3の活性化の認識を通じてプライミングトランスゴルジ網33、34上のウイルスのイオンチャネルタンパク質M2でソームの形成。後者のステップでは、NLRP3ソームのトリガーは、細胞内のイオンの妨害することによって達成される<EM>ソームを形成するための信号としてNLPR3によって感知され、単純に、あるROS産生につながる環境。しかし、インフルエンザ感染時のICE活動の上流ソーム活性化の正確なメカニズムは依然として不明のままである。
この作品は良くによってソームの活性化に続いてR848とTLR8ライゲーションに応じて、DCベースのIL-1β分泌の基礎となる経路のさらなる調査のための基礎として使用することができ、人間のMoDCにNLRP3ソームを研究するための貴重な技術が記載されているNLRP3の既知の活性化、ナイジェリシン。この方法のバリエーションには、他の細胞型で使用されるが、これらに限定されないことができる：単球、マクロファージ、他のDCサブセット、および上皮細胞。
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Protocol
倫理声明：研究試料を得て、ドナーの同意を得て、研究のために保存されています。全てのサンプルは、符号化され、又は使用前に匿名化されるべきである。このプロトコルは、我々の施設内倫理委員会のガイドラインに従っています。
1。単球由来樹状細胞にヒト末梢血単核細胞の分化。
注：ヒトバフィーコートは、ヒト末梢血細胞（PBMC）のソースとして機能し、ニューヨーク血液センター（ニューヨーク、NY）から入手した。献血者は、健康なボランティアです。 5日間の手順は、組織培養フラスコ35,36上にヒト末梢血単核細胞（PBMC）のメッキで始まる。公開されたプロトコルからの顕著な違いは次のとおりです。
- 代わりに、10cmのポリスチレン組織培養プレートのフラスコあたり2×10 8 PBMCの合計を接着する225センチメートルのフィルターキャップ付き2非発熱性ポリスチレン組織培養フラスコを使用して、秒（59 cm 2）とする（ステップ1）。
- 5％のプールしたヒト血清（PHS; 30ml）で培地を調製500mlのRPMI-1640 + L-グルタミン5mlの1 M HEPES緩衝液、および1.4 mlの50 mg / mlのゲンタマイシン（5％PHS培地）を濾過、続いて貫通20μmのフィルター。 225センチメートル2の組織培養フラスコあたり50ミリリットル、5％のPHSメディアの合計を追加します。
- 25ミリリットルの新鮮なRPMI-1640で接着した細胞を3回洗浄します。各洗浄中に5秒間激しく振ると非付着性細胞（ステップ4）を吸引除去する。
- 、0日目にフラスコあたり100 IU /μlのGM-CSFの400 IU /μL、IL-4および380μLの190μL（ステップ3）を追加2、および4。日のPBMCを、当初の工程でめっきするように0日が定義されている1（ステップ8）。
- 1×10 6細胞/ ml（ステップ15）の濃度の収穫5日目のMoDC。
- その静止状態ですぐにたMoDCを使用しています。ステップ17から22が実行されることはありません。注意：サンプルは最良の結果を得るために、採取後できるだけ速やかに処理する必要がある。
- 濃度のアリコートのMoDC実験のために96ウェル丸底プレート（ウェスタンブロット、ELISA、FACS）またはポリ-L-リジン治療chamberslide（顕微鏡）の上ではよく2×10 5細胞/（1×10 6細胞/ mlの200μl/ウェル）のたTiON 。注：完全に刺激されていない（陰性対照）の活性化に続いてのみ、唯一の活性化、およびプライミングプライミング、少なくとも4条件があります。条件は、必要に応じて希釈R848用コントロールおよびニゲリシンを含むように拡張することができる。ダウンストリームアッセイがICSの場合は、重複はアイソタイプコントロールのために必要である。
2ソームプライミング - シグナル1
- メーカーの指示に従って、DMSO中で凍結乾燥R848を再構成。 RPMI-1640で、RTで作業用ストックを希釈する。
- 18時間適切なウェルに10μMの最終濃度でR848を追加します。場所37℃でインキュベーター中で細胞を、5％CO 2。
3 NLRP3ソームのアクティブ化 - 信号2
- メーカーの指示に従って、エタノール中で凍結乾燥さナイジェリシンを再構成。適切な条件に加える前に、RPMI-1640で、RTで作業用ストックを希釈する。
- 20μM最終濃度でニゲリシン載せて、37℃でインキュベーターに戻し、5％CO 2で6時間。いいえ洗浄工程をプライミングの間で活性化中に発生しない。注：IL-1βの分泌はA、モネンシン、ジニトロフェノール、又はカルボニルシアニドクロロフェニル37,38ブレフェルジン、カルシウムイオノフォアの存在により増加する。ソームプライミングまたは活性を分析する際には、IL-1βの分泌が変更されますので、そのため、これらの分泌阻害剤の添加が推奨されていません。
4、IL-1βのサンプルコレクション
- 3分間974×gで細胞と上清でプレートを遠心分離する。
- 細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引し、などへの転送eparateラウンド清からのサイトカイン分泌を測定するためにプレート底。注：上清を一時的に-20℃で保存することができる-80又は長期保存のため°C。
- 細胞試料から任意の外IL-1βを取り除くために3分間974×gで1×PBS200μlで携帯ペレットを3回洗浄します。注：96ウェルプレートから細胞ペレットを洗浄する場合、サンプルを乱さないように、収集容器に迅速なプレート反転による洗浄を削除します。
5。細胞および上清サンプルからのIL-1βの測定
- 細胞内サイトカイン染色（ICS）は：ICSプロトコルは39,40について説明する。注意：ダウンストリームアッセイは顕微鏡であれば細胞を懸濁しないでください。全ての洗浄や願望が（ダウンストリームアッセイに応じて）細胞層/ペレットを乱すことなく行う必要があります。
- 適切なウェルに5％のPHS100μlの培地を追加します。加えるで10分間の細胞またはアイソタイプコントロール、適切なボリューム（約1μl/2x105細胞、または/ウェル1μL）の蛍光標識されたα-CD11cのα-CD14（クローンB-LY6とMφP9、それぞれの表現型マーカー）暗闇の中でのRT。
- 3分間974×gで1×PBSで3回洗浄する。
- 暗闇の中で、室温で20分間、4％PFA100μlを加えることにより細胞を固定します。
- ポイントを一時停止：1X PBS中で4℃、CO / Nで3分間、店舗用に974×gで100μlの1×PBSで洗浄します。
- 30分間、細胞に透過処理緩衝液100μlを加える。注：透過化緩衝液は、0.3％トリトンX-100で1×PBSで構成され、1％ウシ血清アルブミン（BSA）のために透過処理される。下流のアッセイは、顕微鏡の場合に付着細胞を乱さないようにしてください。
- 適切なα-IL-1β-FITCの量（約62のNG antibody/2x10 5細胞、約2.5μL/ウェル）（クローン8516）またはアイソタイプコントロールを追加します37℃のインキュベーターで2時間
- 暗闇の中で3分間974×gで透過化緩衝液200μlで細胞を3回洗浄する。
- オプション：DAPIで染色は、封入を追加し、スライドガラスの上に静かにカバースリップを配置。封入は、O / N顕微鏡画像を撮影する前に硬化させる。
- FACをや顕微鏡によってデータを取得する。注意：FACをや顕微鏡によって分析し、適切な染色を条件ごとにアイソタイプを比較してください。
- 沿磁：一度に1サンプルを収集。 MODC人口プロIL-1β染色を分析する前に、細胞-のCD11c + CD14でゲーティングが続き、生細胞上のFSC / SSCゲートを設定します。
- 顕微鏡：陽性染色試料を用いて露光時間を設定する - R848は、処理した。プロIL-1β発現したMoDCを+の割合を決定するために- 、DAPI +プロIL-1β+とDAPI +プロIL-1βを使用してください。
- SDS-ページ：イムノはプロIL-1βを検出するために行われる。注意：以下に説明する技術は、標準的な免疫ブロット法、勾配4〜20％ポリアクリルアミドゲル、および蛍光または化学発光検出41、42を組み合わせたものです。
- 溶解緩衝液（細胞溶解緩衝液で1:1に希釈し、続いて5μlのβ-mercaptoethanol/950μlのLaemmli試料緩衝液）10μlの変性における直接細胞を溶解。 1.5ミリリットルエッペンドルフチューブにライセートを移します。
- 100℃で10分間乾燥板に熱溶解物
- 液量を濃縮するために1分間minicentrifugeに20,800×gで溶解液を紡ぐ。ポイントを一時停止：サンプルは、短期保存のために-20℃で凍結することができる。
- ポリアクリルアミドゲルに全量をロードします。色素の先端がゲルの底から実行されるまで、約1時間、またはのためのゲルボックスから140 Vを実行します。
- PVDFイモビロン-FLのmembr上にポリアクリルアミドゲルからタンパク質を転送する100 V.ブロックトリス緩衝生理食塩水に5％のBSAを有する膜/ 0.1％のTween-20（TBS-T）で1時間90分間オクタン。注意：PVDFイモビロン-FLは、蛍光検出で使用するために最適です。他の検出技術は、シグナル対バックグラウンド比を向上させるために異なる組成を有する膜が推奨されます。
- 5％BSA / TBS-Tを10mlの一次および二次抗体を希釈する。振とうしながら室温で1時間二次抗体を振りながら4℃のCO / Nで、一次抗体インキュベーションを行う。
- 一次および二次抗体インキュベーションし、再び二次インキュベーションと画像の間に振動させながら5分間TBS-Tで膜を3回洗浄します。注：バンドは、蛍光または化学発光検出を用いて検出することができる。検出のため、メーカーの指示に従ってください。
- ELISA：凍結保存されているサンプルは、分析前に室温に平衡にする必要があります。上澄みCONDENSを統合する遠心分離機でサンプルをスピンダウンATION。 IL-1βの測定のため、メーカーの指示に従ってください。注意：このプロトコルでは、IL-1βが具体的に測定する。しかし、TNFα、IL-6、および免疫調節性サイトカインIL-10の同時測定は、適切な条件を確実にプライミングした。
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Representative Results
これらの技術は、R848でプライミングTLR8を測定します。のCD11c +たMoDC -プロIL-1βのための細胞内サイトカイン染色は、CD14から顕微鏡およびFACS読み出しが可能になります。両方の技術は、非プライミング、又は休止、電池制御ならびにアイソタイプ対照（ 図1および2）と比較して定量することができる。プロIL-1β+染色細胞の割合は中央値蛍光強度（MFI）を提供するために、この集団の幾何学的中央値が乗算される。 MFIは陽性染色細胞に存在するプロIL-1βの量に匹敵する。
次に、β-チューブリンまたはβ-アクチンなどの内部細胞制御、（ 図3）と比較して定量化される細胞溶解物からの免疫ブロッティング対策プロIL-1β。ナイジェリシン処理した細胞中のプロIL-1βのための免疫ブロッティングは、プロIL-1βの減少を明らかにしなければならない。これによって補完されているELISAにより測定し、上清中のIL-1βでの同時増加は、R848のみでナイジェリシン条件（ 図3及び図4）が続く。他のすべての条件はありません外IL-1βの存在をもたらすべきである。例えば、TNFα、IL-10、およびIL-6などの他の炎症性サイトカインの同時測定値、すなわちニゲリシンは、IL-1βの分泌を引き起こすのに特異的であることを確認してください。プライミングのレベルが時間（ 図3）および用量（ 図4）に依存し、応答がR848プライムし外IL-1β（だけでなく、TNFα、IL-10の細胞内プロIL-1βの程度に反映され、すべてR848におけるIL-6）の分泌（ 図4）の条件を処理した。
図1。細胞質プロIL-1βはFで検出される低フローサイトメトリー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。細胞質プロIL-1βは、顕微鏡で検出されています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3：細胞質プロIL-1βは、SDS-PAGEによって検出される。res.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。分泌されたIL-1βをELISAにより検出される。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
炎症性サイトカインは、ウイルス感染と戦うために、先天性および適応免疫応答を操縦中に一体化されている。分泌されたIL-1βは、インフルエンザ感染症3、43、44の間に増加することが示されている。これらのサイトカインは、ヒト樹状細胞におけるウイルスの認識に応答して処理される正確なメカニズムは完全に理解されていない。骨髄性DC単離キットは、高価で時間がかかる。離キットとFACソートが意図せずに、細胞をストレスや活性化することができる。さらに、実験のための単離された細胞の不十分な量が頻繁にあります。幸いなことに、人間のMoDCの生物学は密接にモデル試験管 45、46 の主要なヒト骨髄DCのこと。両方の細胞型は、成熟IL-1βの分泌を達成するために、2つの信号TLRプライミングとNLRP3活性化を必要とする。したがって、たMoDCは提供と手頃な価格とシンプルなDCモデル細胞研究するタイプと賭けTERは、人間の健康と病気におけるNLRP3ソームの関連性や役割を理解しています。
IL-1βは、ここで説明した方法を利用することの検出は、ウイルスRNAの感染を含む炎症に関連する病理、との病気を研究するために様々な、シンプルで効果的な免疫測定法を提供します。具体的には、どのようにR848に応答して、刺激ニゲリシン、種々の方法でIL-1βを測定した。 （例えば、ポリ（Iとして得た：C）およびLPS）他のTLRアゴニスト及び（例えば、ATPおよびMSUなど）NLRP3ソーム活性化剤は、他の疾患の病理との関連での刺激の際に、この活性を測定するために使用することができ;しかしながら、刺激時間および条件を調整する必要があり得る。試薬露光時間および濃度は、他の細胞型および種における使用のためにこのプロトコルを変更するときに調整する必要があろう。
すべての条件を三連で実行する必要があり、応答は品質管理の目的のために慎重に検討;のが一般的です存在するのに最適なドナーの変動。単球由来DCは、細胞型、しない細胞株であり、異質MODC培養物内に存在する。
プライミングは、プロIL-1βおよびR848プライムした状態に休息たMoDCを比較するため、ICSで確認できます。休んでたMoDCは陽性染色の結果ではありません。プライミングもプロIL-1βの発現について免疫ブロッティングによって確認することができる。炎症誘発性サイトカインTNFα、IL-6の分泌、およびIL-1βの分泌が最小限と免疫調節性サイトカインIL-10で成功R848プライミングをもたらす。ソーム活性化された細胞はさらに、TNFα、IL-6の増加、およびIL-10の分泌が表示されないはずですが、活性化されていない細胞と比較して分泌されるIL-1β濃度の上昇を持つことになります。
プロIL-1βは、受動的に従って生物学的利用能アッセイは、関心があるかもしれない壊死性細胞死の間に放出されてもよい。別の方法として、免疫ブロッティングはsupernatan上で実行することができます活性IL-1βは分泌されるサイトカインの形態であることを保証するために、分泌されたIL-1βの分子量を決定するためのts;成熟IL-1β前駆体は31 kDaで、一方17 kDaである。清からのIL-1βを測定するために、細胞濃度は、検出限界を超える陽性シグナルを達成するために調整されなければならない。カスパーゼ-1活性化はまた、インフラマソームの活性化を決定するために、種々の方法によって測定することができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは、特別の利害関係はありません。
Acknowledgments
著者は、彼らのサポートとフィードバックのためにオリビエManches博士は、Davor Frleta、博士、ミーガン·オブライエン、MDを承認したいと思います。この研究は、アレルギー感染症研究所によってサポートされ、NIHは、健康関連の研究（AI089030）とRO1（AI081848の多様性を促進するために個々の博士号を取得する前のフェローシップ（F31）用ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞を付与からの資金の完了した）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12 well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12% polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| Human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
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