Summary
Dendritik hücreler (DC'ler) ile nigerisin ile birlikte NLRP3 inflammasome aktivasyonu takiben, sentetik purin, R848 ve TLR8 tanınması, tepki olarak IL-1β salgılar, bu nedenle, IL-1β NLRP3 inflammasome aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Hücre içi sitokin boyama, immunoblotting ve ELISA doğru IL-1β ekspresyonu üzerinden NLRP3 emişli inflammasome ve aktivasyonunu ölçmek için kullanılır.
Abstract
İnterlökin salgılanması (IL) elde edilen enflamatuar süreçler -1 bağışıklık hücreleri tarafından sitokin aile lokal ya da sistemik iltihaplanma, doku yeniden modelleme ve onarım ve virolojik kontrolü, 1, 2 yol açar. Interleukin-1β doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin temel bir unsurudur ve inatçı enfeksiyon 1-5 kurulmasını önlerken istilacı patojenlere ortadan katkıda bulunur.
Inflammasomes 1 dönüştürücü enzim (ICE veya Caspase-1), interlökin aktivasyonu için önemli bir sinyal bir platform bulunmaktadır. NLRP3 inflammasome IL-1β salgılanması 6 neden olmak için DH'ler en az iki sahip sinyaller gerektirir. Pro-IL-1β protein sentezleme hücreleri dinlenme sınırlıdır; bu nedenle astar sinyal IL-1β transkripsiyonu ve protein ekspresyonu için gereklidir. Çoklu-protein NLRP3 inflammasome oluşumuna NLRP3 sonuçları tarafından algılanan ikinci bir sinyal. Sorumluluk gibi dendritik hücrelerin yeteneğiIL-1β salgılanması için gerekli sinyallerin d bakteriyel toksin olan NLRP3 inflammasome aktivasyonu takiben asal hücreleri dendritik hücreleri (moDCs) türetilmiş insan monosit TLR8 tarafından algılanan bir sentetik purin, R848, kullanılarak test edilebilir ve potasyum iyonofor, nigericin.
Monosit türevi DH'ler kolayca kültürde üretilmiş ve saflaştırılmış insan myeloid DCler önemli ölçüde daha fazla hücre sağlamaktadır. Bunun yerine elde edilen fare, DCler dolayısıyla insan hastalık ve enfeksiyon inflammasome çalışma sağlayan, in vitro insan kullandığı Burada sunulan yöntem, diğer inflammasome deneyleri farklıdır.
Introduction
Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin aktivasyonu, enfeksiyon, hastalık ve aşılama sırasında 7 adaptif bağışıklık tepkileri yönlendirmek için gereklidir. Dendritik hücreler doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri sunan en güçlü antijen; Bu antijenlerin alımından, lenf düğümlerine göç ve naif CD4 + ve CD8 + sitolitik T-hücrelerinin aktivasyonu, 8-10 için özel olan. Hızlı patojen algılamasını etkinleştirmek için doğuştan gelen bağışıklık sistemi korunmuş patojen kaynaklı motifleri veya hücre stres ve hasar ev sahibi türetilmiş işaretleri tanıması çok sayıda germlıne kodlanmış örüntü tanıma reseptörleri (PRR) kullanır. Reseptörler (TLR) Toll benzeri bazı dışı fagosite patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) ve tehlike ilişkili moleküler desenleri (DAMPS) tanımak membran bağlı örüntü tanıma reseptörleri vardır. Reseptörleri (NLR) gibi kontrast selam tarafından sitozolik ve PAMPs ve DAMPS çeşitli bir yelpazede cevap. Reseptörleri tekrar gibi Nodhücre yüzeyi ve endositik PRRS kaçmasına patojenlere karşı savunma ikinci bir çizgi mevcut. Elde edilen patojen ya da "tehlike" etkileşimi, ilişkili TLR ve NLR ligandlarla faktörler, diğer bağışıklık hücreleri ve T hücre ve doğal öldürücü hücre aktivasyonu 11 tanıtımı ile artmıştır DC etkileşim ile sonuçlanan DC olgunlaşmasının bir duruma yol açar.
İnterlökin-1β enfeksiyona karşı konak savunmasının önemli bir bileşenidir. Bir mikroorganizma tanınması üzerine, son derece pro-enflamatuar sitokin IL-1β, salgılanan ve bir kemo cezbedici ve doğal ve adaptif bağışıklık hücrelerinin aktivatör olarak görev yapar. In vivo, IL-1β ateş ve enflamatuar sitokin da dahil olmak üzere, akut faz tepkisi boyunca büyük ölçüde sorumludur sentezi 12.
En NLR ligand algılama, impo olan merkezi bir nükleotid bağlayıcı alan (NACHT) işlev olduğu düşünülen bir C terminali lösin açısından zengin tekrar içerir alanıNLRP3 oligomerizasyonu ve protein protein etkileşimleri ile alt hedef sinyal transdüksiyonunu aracılık eden bir N-terminal efektör alanı (NLRP3 in PYD) için rtant. NLRP3 protein en yoğun çalışılan inflammasome kompleksi tanımlamaktadır. Bu protein NLR ailesinin bir üyesidir ve NLRP3, (aynı zamanda ASC olarak da bilinir), adaptör protein PYCARD ve ICE müteşekkil bir çok moleküler protein kompleksi oluşturmak üzere yeteneğine sahiptir. Inflammasome aktivasyon üzerine PYCARD NLRP3 N-terminal etki bağlanır ve kaspaz aktivasyonu ve işe etki (KART) etki aracılığı ICE acemi. Interleukin-1 dönüştürücü enzim başlangıçta N-terminalinde bir kart motifi ihtiva eden bir zimogen olarak oluşturulur. İki ICE moleküller getirerek Inflammasome oluşumu sonuçları yeterince yakın kendi Otokatalitik aktivasyonunu uyarmak için. Inflammasome kompleksi sitokin olgunlaşması için sitoplazmik pro-IL-1β dönüştürmek için izin vererek, ICE yi aktive etmek için gereklidir.
IL başarılı bir şekilde salgılanması-1β DC'lerin iki farklı ve bağımsız tehlike sinyalleri algılama gerektirir. İlk olarak, PAMPs, DAMPS, veya sitokin sinyal (TNFa ya da IL-1β) içinde TLR algılama sitoplazmik pro-IL-1β protein ekspresyonunda bir artma olur. Bir ikinci, genellikle farklı sinyal ICE olgunlaşma üst inflammasome kompleks oluşumu için gereklidir. Uyarıcı sinyaller birkaç inflammasome bakteri zar gözenek (örneğin nigerisin gibi) oluşturulması toksinler (örneğin, monosodyum ürat kristaller, MSU gibi) lızozomal bozan kristalleri, hücre dışı ve ATP içerir. Bu farklı aktivatörler ile inflammasome aktivasyonu NLRP3 yol açan üst mekanizma açık değildir. Inflammasome oluşumu sinyalizasyon membasında araştıran çalışmalar böyle hipokalemi indüksiyon veya reaktif oksijen türlerinin (ROS) gibi hücre içi olayları, dolaylı inflammasome 13-28 aktive önerir.
NLRP3 inflammasome farklı viral etkinleştiriciler arasında influenza b içerir, olupIL-1β salgılanması 3, 29-33 için gerekli olan birinci ve ikinci sinyal oth. Fare NLRP3 nakavt modeller kullanılarak bu DCler, IL-1β salgılama 32 NLRP3 bağlı olduğu bulunmuştur. Ayrıca, NLRP3 nakavt fareler enfeksiyon siteye az lökositlerin çekti ve daha yüksek mortalite 2, 5 yaşadı. İki yeni kağıtları İnfluenza virüsü enfeksiyonu sırasında NLRP3 inflammasome aktivasyonu için bir mekanizma öneririz; Birinci, ikinci sinyali takip sitoplazmik pro-IL-1β ekspresyonunu başlatmak için TLR7 veya TLR8 (yanıt veren hücrenin TLR ifade bağlı olarak) ya da başka TLR ile ortakçı bakteri algılama yoluyla viral RNA, NLRP3 aktivasyon tanınması yoluyla emişli trans Golgi ağı 33, 34 viral iyon kanal proteini M2 tarafından inflammasome oluşumu. İkinci aşamada, NLRP3 inflammasome tetiklenmesi hücre içi iyonik ortaya çıkması ile gerçekleştirilir <em> inflammasome oluşturmak için bir sinyal olarak NLPR3 tarafından hissedilen, basitçe, bir ROS üretimine yol açan ortam. Ancak, grip enfeksiyonu sırasında ICE aktivitesinin inflammasome aktivasyon membaında kesin mekanizması hala belirsizliğini koruyor.
Bu çalışma, iyi ile inflammasome aktivasyonu takiben R848 ile TLR8 ligasyon yanıt olarak temel DC temel yolunun, IL-1β salgılama ve daha ileri araştırmalar için bir temel olarak kullanılabilir insan moDCs en NLRP3 inflammasome araştırılması için değerli bir yöntem açıklanır NLRP3 bilinen aktifleştirici nigericin. Bu yöntemin varyasyonları dahil olmak üzere, diğer hücre tipleri ile kullanılabilir, bunlarla sınırlı olmamakla birlikte: monositler, makrofajlar, diğer alt-DC ve epitel hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Açıklama: Araştırma örnekleri alındı ve bağış onayı ile araştırma için saklanır. Tüm numuneler kodlu veya kullanım öncesinde anonim olmalıdır. Bu protokol bizim Kurumsal Değerlendirme Kurulu kuralları takip eder.
1.. Monosit türevli dendritik hücreler içine İnsan periferal kan monositleri Türevi.
Not: İnsan ince beyaz kat insan periferik kan hücrelerinden (PBMC'ler) kaynağı olarak hizmet etmek ve New York Blood Center (New York, NY) elde edilmiştir. Kan bağışçıların sağlıklı gönüllüler. 5 günlük bir süreci, doku kültürü üzerine insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ve kaplama ile başlar 35,36 şişeleri. Yayınlanmış protokoller dikkate değer farklılıklar aşağıdaki gibidir:
- 10 cm polistiren doku kültürü plaka şişesi başına 2x10 8 PBMC'lerin toplam uymak yerine bir filtre kapağı ile 225 cm 2 apirojen polistiren doku kültürü şişeleri kullanıns (58 cm 2) (aşama 1) hazırlandı.
- % 5 toplanmış insan serumu (PHS, 30 mi) ile ortam hazırlanması 500 ml RPMI-1640 + L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES tamponu ve 1.4 mi 50 mg / ml Gentamisin (% 5 PHS media) ve ardından filtrasyonu yoluyla 20 mcM Filtre. 50 mi% 5 PHS ortamı 225 cm başına 2 doku kültürü şişesi içinde, toplam ekleyin.
- 25 ml taze RPMI-1640 ile yapıştırılır hücreleri üç kez yıkayın. Her bir yıkama sırasında 5 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve yapışkan olmayan hücreler (aşama 4) aspire.
- Günün PBMC'ler ilk Aşama kaplama olarak 100 IU / ml, 0, 2, bir şişeye (aşama 3) GM-CSF, ve 4. Gün 0, 400 IU / ml IL-4 ve 380 ul 190 ul ekle tanımlanmaktadır 1 (Aşama 8).
- 6 1x10 hücre / ml (aşama 15) 'lik bir konsantrasyonda Harvest gün 5 moDCs.
- Onların dinlenme durumunda derhal moDCs kullanın. Adımlar 17-22 yapılmaktadır asla. Not: Numuneler en iyi sonuçlar için en kısa sürede toplandıktan sonra işlenmelidir.
- Bir konsantrasyonda tümbölen moDCs2x10 5 hücre tion / oyuk, 96 gözlü yuvarlak dipli levha (western blot, ELISA, FACS) ya da bir poli-L-lisin muamele chamberslide (mikroskopisi) üzerine deney için de (1x10 6 hücre / ml 200 ul / kuyucuk) . Not: Tamamen uyarılmamış (negatif kontrol) aktivasyonu takip yalnızca, sadece aktivasyonu ve emişli astar,: En az 4 koşullar vardır. Koşullar istenirse seyreltici R848 için kontroller ve nigericin kapsayacak şekilde genişletilebilir. Alt deney ICS ise, çiftleri izotip kontrolleri için gereklidir.
. 2. Inflammasome Astar - Sinyal 1
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak DMSO içinde liyofilize R848 sulandırın. RPMI-1640 ile, oda sıcaklığında çalışma stokları seyreltin.
- 18 saat uygun gözlerine, 10 uM nihai konsantrasyonda R848 ekleyin. Sıra 37 ° C'de bir inkübatör içinde hücre ve% 5 CO2.
3 NLRP3 Inflammasome etkinleştirme -. Sinyal2
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak etanol içinde liyofilize nigericin sulandırın. Uygun koşullara eklemeden önce RPMI-1640 ile, oda sıcaklığında çalışan stok seyreltin.
- 20 uM son konsantrasyonda nigericin ilave edin ve 37 ° C'de kuluçka makinesine geri dönün ve% 5 CO2 6 saat karıştırıldı. Resim yıkama basamağı, astar ile aktivasyonu sırasında ortaya çıkar. Not: IL-1β salgılanması A, monensin, dinitrofenol, ya da karbonil siyanür klorofenilhidrazon 37, 38 Brefeldin, kalsiyum ionofor varlığı ile artar. IL-1β salgılanmasını değiştirecektir Başlangıcı inflammasome hazırlanmasını veya aktivitesi analiz, bu nedenle, bu salgılama inhibitörlerinin eklenmesi tavsiye edilmez.
4. IL-1ß Örnek Toplama
- 3 dakika boyunca 974 x g hücreleri ve süpernatantlar ile plaka santrifüjleyin.
- Hücre topaklarını bozmadan süpernatan aspire ve şu şekilde aktarmakkolay kurulum yuvarlak süpernatanlarından sitokin salgılanmasını ölçmek üzere plakayı dipli. Not: Yüzer maddeler geçici olarak -20 ° C'de muhafaza edilebilir veya -80, uzun süreli depolama için ° C.
- Hücresel örneklerden herhangi bir hücre-dışı IL-1β çıkarmak için 3 dakika boyunca 974 x g 'de 1 x PBS içinde 200 ul hücre topaklar üç kez yıkayın. Not: 96 oyuklu bir plakadan hücre pelletleri yıkarken örnek rahatsız etmeyecek şekilde, bir toplama kutusu içine hızlı plakaların ters çevrilmesi ile yıkama çıkarın.
5.. Hücresel ve Supernatant Örneklerinden IL-1SS Ölçme
- Hücre içi Sitokin Boyama (ICS): ICS protokol 39, 40 aşağıda tarif edilmektedir. Not: alt tahlil mikroskobu ise, hücrelerin süspansiyonu yoktur. Bütün yıkamalar ve özlemleri (aşağı deneye bağlı) hücre tabakası / pelet bozmadan yapılmalıdır.
- Uygun kuyulara% 5 PHS ortam 100 ul ekle. EklemekUygun miktarda (yaklaşık olarak 1 μl/2x10 5 hücreleri ya da 1 ul / kuyucuk) floresan α-CD11c ve α-etiketli CD14 (fenotip belirteçleri, klon B-LY6 ve MφP9, sırasıyla) ve izotip kontrol olarak 10 dakika boyunca, hücrelere Karanlıkta RT.
- 3 dakika boyunca 974 x g 'de 1 x üç kez PBS ile yıkayın.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 PFA içinde 100 ul ekleyerek hücreleri sabitleyin.
- Nokta Pause: 1x PBS içinde 4 ° CO / N 3 dakika ve mağaza için 974 xg 100 ul 1x PBS ile yıkayın.
- 30 dakika boyunca hücreler permeabilizasyon tampon 100 ul ekleyin. Not: permeabilizasyon tampon maddesi% 0.3 Triton X-100 ile 1x PBS oluşur ve% 1 sığır serum albümini (BSA) nüfuziyet edilir. Aşağı tahlil mikroskopi olduğunda yapışık hücrelerin rahatsız etmeyin.
- Uygun α-IL-1β-FITC hacmi (yaklaşık 62 ng antibody/2x10 5 hücreleri, yaklaşık 2.5 ya da ul / kuyucuk) (klon 8516) ya da ekleme için izotip kontrolü37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde 2 hr
- Karanlıkta 3 dakika boyunca 974 x g'de permeabilizasyon tampon 200 ul hücreler üç kez yıkayın.
- İsteğe bağlı: DAPI ile Leke, mountant eklemek ve bir cam slayt üstüne hafifçe lamel yerleştirin. Mikroskopi görüntüleri yakalamak önce, O / N tedavi mountant bekleyin.
- FACS ya da mikroskop ile veri elde. Not: FACS veya mikroskopi ile analiz uygun lekelenmeye karşı her bir durum için izotipini karşılaştırın.
- FACs: Bir seferinde bir örnek edinin. MoDC nüfus pro-IL-1β boyanma analiz öncesi hücreler - CD11c'nin + CD14 üzerinde yolluk ardından canlı hücreler üzerinde FSC / SSC kapısı ayarlayın.
- Mikroskopi: pozitif boyama örneği kullanarak pozlama süresini ayarlayın - R848 tedavi. Pro-IL-1β ifade moDCs + yüzdesini belirlemek - DAPI + pro-IL-1β + ve DAPI + pro-IL-1β kullanın.
- SDS-Page: Immunoblotting pro-IL-1β tespit etmek için gerçekleştirilir. Not: Aşağıda tarif edilen teknik standart immunoblotting tekniği, eğimli,% 4-20 poliakrilamit jel ve flüoresan veya kemilüminesan algılama 41, 42 bir araya getirir.
- Doğrudan lizis tamponu (5 ul hücre parçalama tamponu ile 1:01 inceltilir, ardından β-mercaptoethanol/950 ul Laemmli örnek tamponu) denatüre 10 ul Hücreleri,. 1.5 ml Eppendorf tüplerine lizat aktarın.
- 100 ° C'de 10 dakika boyunca kuru bir plaka ısı lisatı
- Sıvı hacmi konsantre 1 dakika boyunca minisantrifüj üzerinde, 20800 x g lizat Spin. Pause noktası: Numuneler kısa süreli depolama için -20 ° C de dondurulabilir.
- Poliakrilamid jel üzerine toplam hacmi yükleyin. Boyanın önü jelin alt kapalı çalışır kadar, yaklaşık 1 saat, ya da jel için kutusundan 140 V çalıştırın.
- Bir PVDF Immobilon-FL Membr üzerine poliakrilamid jelinden protein transferBlok 100 V. Tris Tamponlu Salin içinde% 5 BSA ile membran /% 0.1 Tween-20 (TBS-T) 1 saat boyunca 90 dakika için ane. Not: PVDF Immobilon-FL floresan algılama ile kullanılmak için iyi mi. Diğer tespit teknikleri de arka plan sinyal oranını artırmak için farklı bir bileşime sahip bir zar tavsiye edilir.
- % 5 BSA / TBS-T, 10 ml birincil ve ikincil antikorlar seyreltin. Çalkalarken 1 saat OS'da çalkalanarak ve ikinci antikor ise 4 ° CO / N primer antikor inkübasyonlar yapın.
- Primer ve sekonder antikor inkubasyon ve tekrar ikinci inkubasyon ve görüntüleme arasında var Çalkalarken 5 dakika boyunca TBS-T ile, membran 3 kez yıkayın. Not: Gruplar floresan veya kemilüminesan algılama kullanılarak tespit edilebilir. Tespiti için üreticinin yönergelerini izleyin.
- ELISA: depolama için dondurulur Örnekler analiz edilmeden önce oda sıcaklığına dengelenmesi gerekmektedir. Süpernatant CONDENS pekiştirmek için bir santrifüj örnekleri aşağı Spintirme. IL-1β ölçümü için üreticinin yönergelerini izleyin. Not: Bu protokol, IL-1β, özellikle ölçülür; Bununla birlikte, TNFa, IL-6 ve bağışıklık sitokin IL-10 aynı anda ölçüm, uygun koşullar prime edildi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu teknikler R848 ile prime TLR8 ölçün. CD11c + moDCs - pro-IL-1β için hücre içi sitokin boyama CD14 mikroskopi ve FACs okumalar sağlar. Her iki teknik, bir astarlanmış olmayan ya da dinlenme, hücre kontrol hem de bir izotip kontrol (Şekiller 1 ve 2) göre belirlenebilir. Pro-IL-1β + lekeleme hücrelerinin yüzdesi ortalama floresan yoğunluğu (MFI) temin etmek üzere, bu nüfus geometrik medyan ile çarpılır. MFI pozitif boyanma hücrelerde mevcut pro-IL-1β miktarı ile karşılaştırılabilir.
Daha sonra, β-tübülin ya da β-aktin hücre gibi bir iç kontrol, (Şekil 3) göre ölçülür hücre lizatı, imünolekeleme önlemler pro-IL-1β. Nigericin muamele edilmiş hücrelerde pro-IL-1β imünolekeleme için pro-IL-1β bir azalma ortaya gerekir. Bu bir tarafından tamamlanmaktadırELISA ile ölçülen yüzey maddelerinde IL-1β, eş zamanlı artış sadece R848 in nigericin koşullar takip (Şekiller 3 ve 4). Diğer tüm koşullar herhangi bir hücre-dışı IL-1β mevcut sonuçlanmalıdır. Örneğin TNFa, IL-10 ve IL-6 gibi diğer enflamatuar sitokinlerin, aynı anda ölçmek, bu nigericin IL-1β salgılanmasını neden özel olduğundan emin olun. Astarlama seviyesi zaman (Şekil 3) ve doz (Şekil 4) bağlı olarak, astar R848 in hücre içi pro-IL-1β ve hücre dışı IL-1β (yanı sıra, TNFa, IL-10 derecesi yansıyan bir cevaptır ve her R848, IL-6) salgılanması (Şekil 4) koşulları işlemden geçirildi.
Şekil 1. Sitoplazmik pro-IL-1β f ile saptanır düşük sitometri. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2.. Sitoplazmik pro-IL-1β mikroskobu ile tespit edilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3,. Sitoplazmik pro-IL-1β SDS-PAGE ile tespit edilir.res.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Salgılanmış IL-1β ELISA ile tespit edilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inflamatuvar sitokinler viral enfeksiyonla savaşmak için doğal ve adaptif immün yanıtı direksiyon ayrılmaz bir bütündür. Salgılanan IL-1β grip enfeksiyonu 3, 43, 44 boyunca artış gösterilmiştir. Bu sitokinler, insan dendritik hücrelerinde viral algılamalarına tepki olarak işlendikleri tarafından kesin mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Miyeloid DC izolasyon kitleri pahalı ve zaman alıcıdır. İzolasyon kitleri ve FAC sıralama istemeden olabilir stres veya hücreleri aktive. Ayrıca, deney için izole edilmiş hücrelerin yeterli miktarda sıklıkla bulunmaktadır. Neyse ki, insan moDCs biyoloji yakından modeller in vitro 45, 46 birincil insan miyeloid DH'lerinin. Her iki hücre tipi, olgun IL-1β salgılanmasını elde etmek için, iki sinyal, TLR astar ve NLRP3 Telefon kilitlemeyi gerektirir. Bu nedenle, moDCs sağlamak ve uygun fiyatlı ve basit DC modeli hücre tipi çalışma ve bahis içinter, insan sağlığı ve hastalık NLRP3 inflammasome alaka ve rolünü anlamak.
IL-1β, burada açıklanan yöntemler kullanılarak algılama RNA viral enfeksiyon dahil olmak üzere inflamatuar ilişkili patolojileri olan hastalıkların incelemek için çeşitli basit ve etkili bir immün sağlar; özel olarak ise, R848 nasıl tepki olarak ve stimülasyon nigericin çeşitli şekillerde IL-1β ölçmek. (Örneğin, Poli (I kadar: C) ve LPS) Diğer TLR agonistleri (örneğin ATP ve MSU gibi) NLRP3 inflammasome aktivatörlerinin diğer hastalık patolojilerin bağlamında stimülasyonu üzerine bu aktivitesinin ölçülmesi için de kullanılabilir; Bununla birlikte, uyarılma süreleri ve koşullarının ayarlanması gerekebilir. Reaktif pozlama süreleri ve konsantrasyonları da diğer hücre tipleri ve türleri kullanmak için bu protokolü değiştirirken ayarlanması gerekir.
Tüm koşullar, üç kopya halinde çalıştırılmalıdır ve tepki kalite kontrol amaçları için dikkatli bir şekilde tartılır; için ortakbiri için büyük verici değişkenlik. Monosit türetilmiş DC'ler bir hücre tipi değil, bir hücre hattı, ve heterojen bir MoDC kültürü içinde var.
Astar pro-IL-1β ve R848-astarlanmış durumuna dinlenme moDCs karşılaştırmak için ICS ile teyit edilebilir. İstirahat moDCs pozitif boyanma neden olmamalıdır. Astar da pro-IL-1β ekspresyonu için immünolojik işaretleme ile geçerli olabilir. Proinflamatuar sitokinlerin TNFa, IL-6 salgılanmasını ve IL-1β minimum salgılanması ile bağışıklık sitokin IL-10 başarılı R848 priming ile sonuçlanır. Inflammasome aktive edilmiş hücreler, bundan başka, TNFa, IL-6 artış ve IL-10 salgılanması göstermez gerekir, ancak aktive edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında, salgılanan IL-1β konsantrasyonlarında bir artış olacaktır.
Pro-IL-1β pasif nekrotik hücre ölümü sırasında serbest olabilir bu nedenle biyoyararlanım deneyleri ilgi çekici olabilir. Seçenek olarak ise, immunoblotting supernatan gerçekleştirilebilirAktif IL-1β salgılanan sitokin şekilde olmasını sağlamak için, salgılanan IL-1β moleküler ağırlığı belirlemek için ts; ön-madde 31 kDa iken, olgun IL-1β 17 kDa arasındadır. Süpernatanlarından IL-1β ölçmek için, hücre konsantrasyonu saptama sınırının üzerinde pozitif bir sinyal elde etmek için ayarlanabilir gerekecektir. Kaspaz-1 aktivasyonu da inflammasome aktivasyonunu belirlemek için çeşitli yöntemler yolu ile ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar destek ve geribildirim için Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., ve Meagan O'Brien, MD kabul etmek istiyorum. Bu araştırma, Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen ve NIH Sağlık-İlgili Araştırma (AI089030) ve RO1'e (AI081848 Diversity Destekleme Bireysel predoctoral Bursu (F31) için Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü hibe fon ile tamamlandı .)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12 well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12% polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| Human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
