Molekylär signalering genom både östrogen och mikroRNA är avgörande för bröstcancerutveckling och tillväxt. Östrogen aktiverar östrogenreceptorer, som är transkriptionsfaktorer. Många transkriptionsfaktorer kan reglera uttrycket av microRNAs, och östrogenreglerade microRNAsna kan profileras med användning av olika storskaliga tekniker.
Östrogen spelar viktiga roller i bröstkörtel utveckling och bröstcancer progression. Det medierar sin funktion genom att binda till och aktivera östrogenreceptorerna (ERS), ERa och ERp. ERa ofta uppregleras i bröstcancer och driver spridningen av bröstcancerceller. ERS fungerar som transkriptionsfaktorer och reglera genuttrycket. Av följande skäl ERa reglering av protein-kodande gener är väl etablerad, är dess reglering av icke-kodande mikro-RNA (miRNA) mindre utforskade. miRNA spelar en viktig roll i den posttranskriptionella regleringen av gener, hämma deras översättning eller förnedrande deras mRNA. miRNA kan fungera såsom onkogener eller tumörsuppressorer och är också lovande biomarkörer. Bland de miRNA analyser finns tillgängliga, har mikroarray och kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (qPCR) i stor utsträckning använts för att detektera och kvantifiera miRNA nivåer. För att identifiera miRNA regleras av östrogen signalering i bröstcancer, thEIR uttryck i ERa-positiva bröstcancercellinjer jämfördes före och efter östrogen-aktivering med hjälp av både μParaflo-mikroflödes microarrays och Dual märkta prober-låg densitet arrayer. Resultaten validerades med specifika qPCR analyser, tillämpa både cyaninfärgämnet baserat och Dual-märkta prober-baserad kemi. Vidare har en tid-punkt-analys användas för att identifiera regler över tiden. Fördelar med miRNA-analys metod som används i denna studie är att det möjliggör en snabb genomgång av mogna miRNA regler i många prov, även med begränsade mängder prov. Layouten, inbegripet de särskilda villkoren för cellodling och östrogenbehandling, biologiska och tekniska replikat, och storskalig screening följt av bekräftelser på djupet med hjälp av olika tekniker, säkerställer en robust detektering av miRNA förordningar, och eliminerar falska positiva och andra artefakter. Men muterade eller okända miRNA, eller förordningar i den primära och gångare avskrift level, inte kommer att upptäckas. Den metod som presenteras här utgör en grundlig utredning av östrogen-medierad miRNA reglering.
Östrogen är ett hormon som är viktigt under bröstkörtelutveckling. Östrogen spelar också viktiga roller i utvecklingen, underhåll, risk och behandling av bröstcancer 1. Östrogen utövar sin funktion genom att binda till ERS, som är transkriptionsfaktorer och reglerar specifika mål gener. Av de två receptorvarianter, är ERa väsentliga för östrogenberoende proliferation av bröstcancerceller. De flesta bröstcancer är ERa-positiva och är beroende av östrogen för tillväxt. Detta har gjort östrogen signalering och ERa ett mål för behandling vid hormonreceptorpositiv bröstcancer. Att förstå den bakomliggande mekanismen av ERa är viktigt att förbättra behandlingsutfallet, övervinna motstånd till behandling, och förstå hur bröstcancer utvecklas.
miRNA spelar avgörande roller i cellfunktioner på grund av deras stora genomslag i posttranskriptionell genreglering. miRNA är 19-24 nukleotider korta, enkelsträngade, Icke-kodande RNA som först transkriberas av RNA-polymeras II i primära miRNA avskrifter (pri-miRNA). De bearbetas i kärnan av Drosha i kort hårnål prekursor-miRNA (pre-miRNA) och sedan bearbetas av Dicer och separeras till enkelsträngar för att bilda mogna miRNA i cytoplasman. De enkelsträngade mogna miRNA överförs till Argonaute proteiner för att bilda RISC komplex. Sedan kan de miRNA hybridisera till 3'-otranslaterade regioner (3'-UTR) av ett mål-mRNA, vilket leder till post-transkriptionell reglering, genom att blockera translation eller försämra mål-mRNA-2.
På grund av den viktiga roll som både östrogen och miRNA spelar i tumörprogression, identifiera miRNA i samband med normal eller störs östrogen signalering är viktigt för att öka vår förståelse av utvecklingen och förbättra behandlingen av bröstcancer. Även om det finns en god förståelse för hur ERa reglerar protein-kodande gener, förlängningoch uppgifter om icke-kodande RNA-regler återstår att undersökas grundligt. Initiala studier som syftar till att belysa ERa reglering av miRNA i bröstcancer cellinjer har gett motstridiga resultat, även om samma cellinje har analyserats 3-6. Detta kan vara ett resultat av olika behandlingar, biologiska variationer, användning av olika tekniker, och det faktum att den lilla storleken av miRNA göra dem utmanande att analysera. Här är ett protokoll som kontrollerar för variationer och metod artefakter beskrivs.
För att identifiera vilken miRNA regleras av östrogen, är profilering av en väldefinierad bröst modell av ERa aktivitet cancer ett första steg. Flera cellinjer har genererats från ERa-positiva bröstcancertumörer mänskliga, som är beroende av östrogen som liknar de flesta kliniska bröstcancer. De molekylära egenskaperna hos två av dessa cellinjer, T47D och MCF7, inklusive expression av ERa och dess nedströms mål,progesteron hormonreceptor (PR), en frånvaro av uttryck av membranreceptor HER2, tillsammans med uttryck av östrogen-lyhörd och luminal-epitelial differentiering gener, gör dem lämpliga som modeller för den luminala subtyp av brösttumörer 7-10. 17β-östradiol (E2) är den dominerande formen av östrogen, och koncentrationerna och tids poäng för optimal transkriptionsaktivering av ERa har präglats av flera studier. I detta protokoll 10 nM E2 behandling för 24 timmar används och T47D och MCF7 som modeller för ERa aktivitet i bröstcancerceller 1. Dessutom kan tidsberoende miRNA föreskrifter vara specifikt analyseras i ett tidsintervall på t ex 1 till 72 timmar.
För det andra har att analysera miRNA separata utmaningar, delvis på grund av deras korta storlekar. miRNA är inte väl kvar i den totala RNA-preparatet när vanliga Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA utfällningar utförs, eller när stAndard kolumn reningar används. Särskilda försiktighetsåtgärder måste vidtas för att bibehålla eller anrika för den mindre fraktionen av RNA. Genom att öka volymen av isopropanol, sänka temperaturen innan centrifugering (-80 ° C) och med utelämnande av tvättning i 70% etanol, kan ökas den kvarhållande av miRNA från nederbörd. Eller, kan specifika kolumner och buffertar för en hög kvalitet och robust beredning av miRNA-innehållande totalt RNA användas. Även för själva analysen, deras korta storlekar skapar utmaningar. För genomet hela miRNA screening, det finns tre vanliga miRNA profilering tekniker att välja mellan: microarrays, qPCR och nästa generations sekvensering. Varje teknik kan utföras med hjälp av flera olika plattformar, och olika provpreparat erfordras, var och en med olika risker för att införa förvrängningar. I miRNA microarray är en bild fläckig eller syntetiseras med tusentals oligonukleotider. Dessa oligonukleotider används som prober, och var och en av probens är utformad för att hybridisera till en särskild miRNA sekvens. Den provberedning för microarrays, som utförts i denna studie, berikar först för miRNA och sedan introducerar Cy5 och Cy3 märkning på de miRNA. Microarray ger möjlighet att observera de relativa expressionsnivåer av ett stort antal gener samtidigt, är snabb och lämpar sig för screening av stort antal prover, men kan bara analysera sekvenserna finns på microarray och kommer till exempel inte upptäcka förändringar i okända eller muterade miRNA. Microarray analys som utförs i detta protokoll kräver också relativt stora mängder, ca 5 mikrogram, av total RNA per prov för analys. Low-density qPCR miRNA profilering kräver mindre material (700 ng / prov och replikera), och gör det möjligt att upptäcka och kvantifiera miRNA. Transkriptnivåer kan fastställas, och mängden kan vara en absolut mängd eller en relativ mängd. qPCR analys kräver först omvandling av miRNA till cDNA, här genom en slingprimer för varje specifika miRNA säkerställer analysen av endast mogna miRNA. Detta genererar en längre mall som kan amplifieras med användning av en miRNA-specifik framåtriktad primer och en universell omvänd primer komplementär till den slingsekvensen och kan hamnen inkluderandet av en Dual märkta proben för specificitet. qPCR kan användas i en låg densitet format där hundratals miRNA kan detekteras parallellt med användning av en eller flera 384-brunnsplattor med enskilda primerparen i varje brunn 11. Nästa generations sekvensering, å andra sidan, är den enda av dessa tekniker som möjliggör upptäckten av nya, muterade eller redigerade miRNA, eftersom alla RNA-molekyler i ett prov kan sekvenseras 11. Denna teknik erfordrar emellertid multipla steg för att berika små RNA och producera ett litet RNA-bibliotek med användning av flera steg av linker-ligeringar och reningar med påföljande förbättrade riskerna för att modulera deras relativa expressionsnivåer mellan proverna. Det kräver också betydande bioinformatics analys. Med tanke på de olika teknikerna för miRNA profilering, den lämpligaste tekniken beror på ansökningarna. Microarrays är mest lämplig när materialet är relativt riklig och intresset är att fastställa differentierade uttryck av redan kända miRNA. Low-density qPCR arrayer är mest lämpliga när en begränsad mängd prov finns tillgänglig och en hög känslighet Ande uttrycks miRNA krävs. Sekvense är mest lämplig när det krävs en analys av okända miRNA, muterade eller olika isoformer av en miRNA.
I studien av östrogenreglerade miRNA i bröstcancer, är två modell cellinjer som används, T47D och MCF7, där stora mängder RNA är lätt tillgängliga. Varje cellinje analyserades i replikerade cellodlingar med användning av olika kanaler, vardera i tekniska replikat av behandling. Detta gör det möjligt för robust upptäcka reproducerbart, ERa-reglerade miRNA. Relativa miRNA expressionsnivåer jämfördes med både miRNA microarray ochDubbla märkta prober – låg densitet arrayer (DLP-LDA) och validerat resultaten med särskild qPCR använda både cyaninfärgämnet och DLP kemier. miRNA föreskrifter analyserades därefter ytterligare i tidsserier för att fastställa deras exakta reglering över tiden, vilket kan bidra till att skilja slumpmässiga eller dygnsrytm variationer från östrogen-inducerad regler, och ange primära effekter från sekundära effekter. Bioinformatiska jämförelser med kromatin bindande studier av ERa kan ytterligare stöd i differentiering av primär kontra sekundära effekter. Analysen resulterade i en tillförlitlig bedömning av miRNA föreskrifter där det kan fastställas att efter 24 timmar E2 behandling protein-kodande avskrifter var klart reglerade men mogna miRNA påverkades inte 1. Det är emellertid möjligt att miRNA regleras vid senare tidpunkter, vilket visas i tidsserieanalys av utvalda miRNA 1. Detaljerna behöver utforskas ytterligare och det protokoll som presenteras här ger en Robust sätt att studera hormonell reglering av mogna miRNA i bröstcancercellinjer.
Fastställande av mekanismen för hormonell reglering av miRNA i bröstcancerceller kan ge en plattform för att förstå denna sjukdom och kan ge potentiell behandling för bröstcancer. Odling av dessa celler för att tillhandahålla det optimala villkoret för hormonverkan är mycket viktig. Här har ett protokoll som gör att hormonet av intresse (östrogen) uteslöts före behandling och att en optimal dos av E2 användes under en lämplig tid under behandlingen beskrivits. Andra hormonella och tillväxtfaktor effekter minimeras genom att gradvis sänka serumnivåerna och använda DCC-FBS, vilket är FBS som har berövats det mesta av sitt hormon, cytokiner och tillväxtfaktorer. Fenolrött fria media vidare används för att minimera andra nonhormonal effekter, eftersom fenolrött har rapporterats att ha östrogen aktivitet och påverkar vissa funktioner i cellinjer 20,21. Tiden för exponering av cellerna för hormonet är av stor betydelse. För östrogen-associerad reglering av gener, har det tidigare visat att 24-hrexposure producerar signifikant respons på direkta mål gener i bröstcancerceller 1,18. Sedan miRNA transkriberas av RNA-polymeras II, som mRNA, är det tänkbart att det är en lämplig tidpunkt för att detektera direkt reglering även av miRNA. Det är ännu inte fastställt om och hur dessa miRNA påverkar uttrycket av dessa kända ER mål i bröstcancerceller.
miRNA uttryck profilering kan vara en utmaning på grund av den relativt begränsade storleken på miRNA, det faktum att den mogna miRNA sekvensen finns även i den pri-miRNA och pre-miRNA, och på grund av heterogenitet i sin GC innehåll 22. Flera profileringstekniker och kemier har använts för att övervinna denna svårighet. Bland dessa finns olika metoder för microarray-och qPCR analys (Figur 2). Även microarray är allmänt accepterat för hela genom anallys, kan det ge falskt negativa resultat och det finns skillnader mellan de tillgängliga plattformar, allt från kemi till den tryckteknik 23. Även normaliseringsprocessen är en utmaning när man analyserar de relativt få miRNA gener, som är inräknade i tusental jämfört med de tiotusentals mRNA-transkript. qPCR, å andra sidan, är mer känsliga, och är bättre tillämpas när färre gener är att betrakta. Men när de utförs i stora 384-hålsplattor, med endast en teknisk replikera per platta, flera plåtar behöver analyseras för varje prov som gör analysen dyrt. Också i våra händer, många fler falska negativa resultat erhållits med DLP-LDA analysen jämfört med microarray. Med tanke på att det mogna miRNA-sekvensen är närvarande i den pri-miRNA och pre-miRNA sekvenser, är det av intresse att skilja mellan dessa transkript med användning av PCR-tekniker 24. DLP sonder finns även för pre-miRNA, och specific primers kan också utformas för att utesluta annan mogen eller prekursor varianter använder cyaninfärgämne qPCR teknik.
qPCR är en gyllene standard för validering av differentiellt uttryck från profilering resultat. Effektiviteten av qPCR dock beror på flera parametrar, bland annat RNA-extraktion, RNA integritet (kvalitet), cDNA-syntes, primer design, detektionsmetod (kemi), och referensgenen för data normalisering 1,22,25. Alternativen för primer design för miRNA analys är mycket begränsad, eftersom den korta miRNA sekvenslängden inte ger utrymme för mycket alternativ primer design, och endast en primer kan hyste i denna korta sekvens. Följaktligen är behovet av alternativa manipulationer såsom illustreras i figur 2. Tekniska replikat är viktigt att validera robusthet amplifieringsmetoden och processen används. Biologiska replikat erfordras för en representation av den allmänna biologiska Variation, inklusive varierande svar till ligand behandling, och för att visa att effekter i en cell är reproducerbar. Baserat på vår erfarenhet, kan variationer i miRNA uttryck mellan cellkulturer uppstår. Vanligtvis dessa skillnader är mindre än 1,3-faldigt, och genomsnittet av värden och motsvarande SD vilken fysisk och teknisk variation. Denna variation kan bero på olika faktorer, inklusive, celltäthet och det faktum att cellfunktioner kan ändras från passage till passage. För att identifiera statistiskt signifikanta uttryck som härrör från ligand behandling, är en allmänt accepterad betydelse då p-värdet är mindre än 0,05. Här har en students t-test på de biologiska och tekniska replikat med hjälp av tvåsidiga fördelningen och två prov ojämlika variansparametrar använts. Andra t-testparametrar existerar, och valet beror på den experimentella uppställningen 26.
Ett detaljerat protokoll för att utvärdera hormonella föreskrifter mogna miRNA i bröstcancerceller har lämnats. Viktig teknik och kemi i profilering och validera dessa miRNA uttryck har tydligt förklarat. Den teknik som väljs för studier av miRNA i bröstcancerceller beror ytterst på vad exakt utreds.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma till Dr Xiaolian Gao, University of Houston, för att ge råd till LC Sciences miRNA microarray-plattform, med dr Karin Edvardsson, Karolinska Institutet, Sverige, och Dr Eylem Aydogdu, University of Houston, för att dela deras miRNA expertis . Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute i National Institutes of Health enligt Award Number R01CA172437. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health. Detta arbete stöddes också med bidrag från Texas Emerging Technology Fund, enligt avtal nr. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |