एस्ट्रोजन और microRNAs दोनों के माध्यम से संकेत आण्विक स्तन कैंसर के विकास और विकास में महत्वपूर्ण हैं. एस्ट्रोजन प्रतिलेखन कारक हैं जो एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स को सक्रिय करता है. कई प्रतिलेखन कारक microRNAs की अभिव्यक्ति को नियंत्रित कर सकते हैं, और एस्ट्रोजन विनियमित microRNAs विभिन्न बड़े पैमाने पर तकनीक का उपयोग कर profiled किया जा सकता है.
एस्ट्रोजन स्तन ग्रंथि विकास और स्तन कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. यह करने के लिए बाध्य है और एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स (नेताओं), ERα, और ERβ को सक्रिय करने के द्वारा अपने कार्य मध्यस्थता करता है. ERα अक्सर स्तन कैंसर में upregulated और स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रसार को ड्राइव है. नेताओं प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित. प्रोटीन जीन कोडिंग की ERα के नियमन अच्छी तरह से स्थापित है, जबकि microRNA (miRNA) noncoding के अपने विनियमन कम का पता लगाया है. miRNAs उनके अनुवाद बाधा या उनके mRNA अपमानजनक, जीन के बाद transcriptional विनियमन में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. miRNAs ओंकोजीन या ट्यूमर शामक के रूप में कार्य कर सकते हैं और भी बायोमार्कर का वादा कर रहे हैं. उपलब्ध miRNA assays के अलावा, माइक्रोएरे और मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) बड़े पैमाने पर miRNA के स्तर का पता लगाने और यों इस्तेमाल किया गया है. स्तन कैंसर, वीं में एस्ट्रोजन संकेतन द्वारा विनियमित miRNAs की पहचान करने के लिएERα पॉजिटिव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में EIR अभिव्यक्ति की तुलना में थे पहले और बाद में जांच कम घनत्व सरणियों लेबल μParaflo-microfluidic प्रोटीन और दोहरी दोनों का उपयोग कर एस्ट्रोजन सक्रियण. परिणाम जांच आधारित रसायन शास्त्र लेबल जाती डाई आधारित और दोहरी दोनों को लागू करने, विशिष्ट qPCR assays का उपयोग मान्य किया गया. इसके अलावा, एक समय बिंदु परख समय के साथ नियमों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस अध्ययन में इस्तेमाल miRNA परख दृष्टिकोण के लाभ यह भी सीमित नमूना मात्रा के साथ, कई नमूनों में परिपक्व miRNA नियमों की एक तेजी से स्क्रीनिंग के लिए सक्षम बनाता है. विशेष सेल संस्कृति के लिए स्थितियां और एस्ट्रोजन उपचार, जैविक और तकनीकी replicates, और बड़े पैमाने पर प्रदर्शन सहित लेआउट, अलग तकनीक का उपयोग कर में गहराई पुष्टियों द्वारा पीछा किया, miRNA नियमों का एक मजबूत पता लगाने सुनिश्चित करता है, और झूठी सकारात्मक और अन्य कलाकृतियों को समाप्त. प्राथमिक और अग्रदूत प्रतिलेख छुट्टी पर हालांकि, उत्परिवर्तित या अज्ञात miRNAs, या विनियमोंएल, पता नहीं होगा. यहाँ प्रस्तुत विधि एस्ट्रोजन की मध्यस्थता miRNA विनियमन की पूरी जांच का प्रतिनिधित्व करता है.
एस्ट्रोजन स्तन ग्रंथि के विकास के दौरान महत्वपूर्ण है कि एक हार्मोन है. एस्ट्रोजन भी स्तन कैंसर 1 के विकास, रखरखाव, जोखिम, और उपचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. एस्ट्रोजन प्रतिलेखन कारक हैं और विशिष्ट लक्ष्य जीन को नियंत्रित जो नेताओं के बंधन से अपने कार्य डाल रही है. दो रिसेप्टर वेरिएंट की, ERα स्तन कैंसर की कोशिकाओं का एस्ट्रोजन निर्भर प्रसार के लिए आवश्यक है. अधिकांश स्तन कैंसर ERα पॉजिटिव हैं और विकास के लिए एस्ट्रोजन पर निर्भर करता है. इस एस्ट्रोजन संकेतन बनाया और हार्मोन रिसेप्टर पॉजिटिव स्तन कैंसर में उपचार के लिए एक लक्ष्य ERα गया है. ERα की अंतर्निहित तंत्र को समझना, उपचार परिणामों में सुधार उपचार के लिए प्रतिरोध पर काबू पाने, और स्तन कैंसर विकसित कैसे समझने के लिए महत्वपूर्ण है.
miRNAs की वजह से बाद transcriptional जीन विनियमन में उनके प्रमुख प्रभाव के लिए सेल कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. miRNAs 19-24 nucleotides कम कर रहे हैं, एकल असहाय, पहले प्राथमिक miRNA टेप (प्राथमिक miRNA) में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित रहे हैं कि RNAs noncoding. वे कम बाल के लिये कांटा अग्रदूत-miRNAs (पूर्व miRNA) में Drosha द्वारा नाभिक में कार्रवाई की और फिर पासा खेलनेवाला द्वारा संसाधित और cytoplasm में परिपक्व miRNAs के लिए फार्म एक किस्में में विभाजित हैं. एकल असहाय परिपक्व miRNAs RISC जटिल प्रपत्र Argonaute प्रोटीन के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. फिर, miRNAs अनुवाद अवरुद्ध या लक्ष्य mRNA 2 अपमानजनक द्वारा बाद transcriptional विनियमन के लिए अग्रणी, एक लक्ष्य mRNA की 3'-untranslated क्षेत्र (3'-UTR) को संकरण कर सकते हैं.
कारण एस्ट्रोजन और miRNAs दोनों सामान्य या बाधित एस्ट्रोजन संकेत के साथ जुड़े miRNAs की पहचान, ट्यूमर प्रगति में खेलना महत्वपूर्ण भूमिका है कि करने के लिए विकास की हमारी समझ को बढ़ाने और स्तन कैंसर के इलाज को बेहतर बनाने के क्रम में महत्वपूर्ण है. ERα प्रोटीन जीन कोडिंग को नियंत्रित करता है की एक अच्छी समझ है, विस्तार जबकि वहाँऔर शाही सेना के नियमों noncoding का विवरण अच्छी तरह से जांच की बात है. स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में miRNA के ERα विनियमन को स्पष्ट करने के लिए लक्ष्य प्रारंभिक पढ़ाई एक ही सेल लाइन 3-6 विश्लेषण किया गया है, तब भी जब परस्पर विरोधी परिणाम सामने आए. यह अलग उपचार, जैविक विविधताओं, विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हैं, और miRNAs की छोटे आकार का विश्लेषण करने के लिए उन्हें चुनौतीपूर्ण बनाने तथ्य यह है कि एक परिणाम हो सकता है. इधर, विविधताओं और विधि कलाकृतियों के लिए नियंत्रित करता है कि एक प्रोटोकॉल में वर्णित है.
MiRNAs एस्ट्रोजन द्वारा विनियमित रहे हैं जो की पहचान करने के लिए, ERα गतिविधि की एक अच्छी तरह से परिभाषित स्तन कैंसर मॉडल की रूपरेखा एक पहला कदम है. कई सेल लाइनों अस्पताल में स्तन कैंसर के बहुमत के लिए इसी तरह एस्ट्रोजन पर निर्भर हैं जो मानव ERα पॉजिटिव स्तन कैंसर के ट्यूमर से उत्पन्न किया गया है. ERα और इसके नीचे की ओर लक्ष्य की अभिव्यक्ति सहित इन सेल लाइनों के दो, T47D और MCF7, आणविक गुण,प्रोजेस्टेरोन हार्मोन रिसेप्टर (पीआर), एस्ट्रोजन उत्तरदायी और luminal उपकला भेदभाव जीनों की अभिव्यक्ति के साथ झिल्ली रिसेप्टर HER2 की अभिव्यक्ति की कमी, स्तन ट्यूमर 7-10 की luminal उप के लिए मॉडल के रूप में उन्हें उपयुक्त बनाते हैं. 17β-estradiol (E2) एस्ट्रोजन का प्रमुख रूप है, और ERα का इष्टतम transcriptional सक्रियण के लिए सांद्रता और समय अंक कई अध्ययनों में लक्षण वर्णन किया गया है. 24 घंटे के लिए इस प्रोटोकॉल 10 एनएम E2 इलाज में स्तन कैंसर की कोशिकाओं 1 में ERα गतिविधि के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया और T47D और MCF7 है. इसके अलावा, समय पर निर्भर miRNA नियमों विशेष रूप से जैसे 1-72 घंटे का समय अंतराल में विश्लेषण किया जा सकता है.
दूसरे, विश्लेषण करने miRNA के कारण उनके छोटे आकार की वजह से भाग में, अलग चुनौतियों का सामना किया. नियमित Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol आरएनए precipitations प्रदर्शन किया, या जब कर रहे हैं जब miRNAs अच्छी तरह से कुल शाही सेना तैयार करने में बनाए रखा नहीं कर रहे हैं सेंटandard स्तंभ purifications उपयोग किया जाता है. विशेष सावधानियों को बनाए रखने या RNAs के छोटे अंश के लिए समृद्ध करने के लिए उठाए जाने की जरूरत है. Centrifugation (-80 डिग्री सेल्सियस) से पहले तापमान को कम करने, isopropanol की मात्रा बढ़ रही है, और 70% इथेनॉल में वाशिंग omitting द्वारा, miRNAs की बनाए रखने की वर्षा के दौरान बढ़ाया जा सकता है. या, miRNA युक्त कुल शाही सेना के एक उच्च गुणवत्ता और मजबूत तैयारी के लिए विशिष्ट स्तंभ और buffers इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा विश्लेषण के लिए ही, उनके छोटे आकार चुनौतियों का बना. प्रोटीन, qPCR, और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण: जीनोम चौड़ा miRNA स्क्रीनिंग के लिए, तीन सामान्य से चुनने के लिए तकनीक की रूपरेखा miRNA कर रहे हैं. प्रत्येक तकनीक कलाकृतियों शुरू करने की अलग जोखिम के साथ एक, कई विभिन्न प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है, और विभिन्न नमूना तैयारी के लिए आवश्यक हैं. MiRNA माइक्रोएरे में, एक स्लाइड देखा है या oligonucleotides के हजारों के साथ संश्लेषित. ये oligonucleotides जांच के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और जांच के प्रत्येकएक विशेष miRNA अनुक्रम को संकरण बनाया गया है. इस अध्ययन में प्रदर्शन के रूप में प्रोटीन के लिए नमूना तैयार करने, पहले miRNAs के लिए समृद्ध और फिर miRNAs पर Cy5 और Cy3 लेबलिंग का परिचय. माइक्रोएरे, एक साथ जीन की एक बड़ी संख्या के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर का पालन करने का अवसर देता है तेजी से और नमूनों की बड़ी संख्या की जांच के लिए उपयुक्त है, लेकिन केवल माइक्रोएरे पर दृश्यों उपस्थित विश्लेषण कर सकते हैं और जैसे में परिवर्तन का पता लगाने नहीं देंगे अज्ञात या उत्परिवर्तित miRNAs. इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के रूप में माइक्रोएरे विश्लेषण भी विश्लेषण के लिए नमूना प्रति कुल शाही सेना की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में, के बारे में 5 ग्राम, की आवश्यकता है. कम घनत्व qPCR miRNA रूपरेखा कम सामग्री (700 एनजी / नमूना और दोहराने) की आवश्यकता है, और miRNAs का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. ट्रांसक्रिप्ट का स्तर निर्धारित किया जा सकता है, और मात्रा एक निरपेक्ष राशि या एक रिश्तेदार राशि हो सकता है. qPCR विश्लेषण पहले एक looped का उपयोग करके यहाँ, सीडीएनए में miRNA के रूपांतरण की आवश्यकताकेवल miRNA परिपक्व का विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक विशिष्ट miRNA के लिए प्राइमर. यह एक miRNA विशिष्ट आगे प्राइमर और looped अनुक्रम को पूरक एक यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर का उपयोग परिलक्षित किया जा सकता है कि एक लंबे समय तक टेम्पलेट उत्पन्न करता है, और विशिष्टता के लिए एक दोहरी लेबल जांच का समावेश कर सकते हैं बंदरगाह. qPCR miRNAs के सैकड़ों प्रत्येक अच्छी तरह से 11 में व्यक्तिगत प्राइमर जोड़े के साथ एक या कई 384 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग समानांतर में पता लगाया जा सकता है, जहां एक कम घनत्व प्रारूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक नमूने में सभी RNAs 11 अनुक्रम किया जा सकता के रूप में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, दूसरे हाथ पर,, उपन्यास, उत्परिवर्तित या संपादित miRNAs की खोज के लिए अनुमति देता है कि इन तकनीकों का ही है. इस तकनीक, हालांकि, छोटे RNAs को समृद्ध और नमूने के बीच उनके रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर नियमन करने के बाद बढ़ाया जोखिम के साथ linker ligations और purifications के कई चरणों का उपयोग कर एक छोटे आरएनए पुस्तकालय का उत्पादन करने के लिए कई कदम की आवश्यकता है. यह भी महत्वपूर्ण bioinformati आवश्यकतासीएस विश्लेषण. MiRNA रूपरेखा के लिए विभिन्न तकनीकों को देखते हुए सबसे उपयुक्त तकनीक आवेदन पर निर्भर करता है. सामग्री अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में है और ब्याज पहले से ही जाना जाता है miRNAs के अंतर अभिव्यक्ति को परिभाषित करने के लिए है जब डीएनए सबसे उपयुक्त हैं. नमूने के एक सीमित मात्रा में उपलब्ध है और कम व्यक्त miRNAs की एक उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता है जब कम घनत्व qPCR सरणियों सबसे उपयुक्त हैं. अनुक्रमण उत्परिवर्तित अज्ञात miRNAs, या एक miRNA के विभिन्न isoforms के विश्लेषण की आवश्यकता है जब सबसे उपयुक्त है.
स्तन कैंसर में एस्ट्रोजन विनियमित miRNAs के अध्ययन में, दो मॉडल कोशिकाओं लाइनों, शाही सेना की बड़ी मात्रा में आसानी से उपलब्ध हैं जहां T47D और MCF7, उपयोग किया जाता है. प्रत्येक कोशिका लाइन उपचार के तकनीकी replicates में अलग मार्ग, प्रत्येक का उपयोग कर दोहराया सेल संस्कृतियों में विश्लेषण किया गया था. इस reproducibly, ERα विनियमित miRNAs की मजबूत पता लगाने के लिए अनुमति देता है. रिश्तेदार miRNA अभिव्यक्ति के स्तर miRNA माइक्रोएरे और दोनों का उपयोग की तुलना में थेदोहरी लेबल जांच – कम घनत्व सरणियों (डीएलपी-झील प्राधिकरण) और जाती डाई और DLP chemistries दोनों का उपयोग कर विशिष्ट qPCR के साथ परिणाम मान्य. miRNA नियमों फिर आगे एस्ट्रोजन प्रेरित नियमों से यादृच्छिक या circadian विविधताओं अंतर करने में मदद, और माध्यमिक प्रभाव से प्राथमिक प्रभाव का संकेत कर सकते हैं जो समय के साथ अपनी सटीक विनियमन, परिभाषित करने के लिए समय श्रृंखला में विश्लेषण किया गया. ERα की chromatin बाध्यकारी पढ़ाई के साथ Bioinformatical तुलना माध्यमिक प्रभाव बनाम प्राथमिक के भेदभाव में सहायता को आगे कर सकते हैं. परख यह 24 घंटा E2 उपचार प्रोटीन कोडिंग टेप के बाद तत्काल विनियमित रहे थे लेकिन परिपक्व miRNAs 1 प्रभावित नहीं थे कि स्थापित किया जा सकता है, जहां miRNA नियमों का एक विश्वसनीय आकलन में हुई. हालांकि, यह चयनित miRNAs 1 के समय श्रृंखला विश्लेषण में प्रदर्शन के रूप miRNAs, बाद में समय बिंदुओं पर विनियमित रहे हैं कि संभव है. विवरण आगे का पता लगाया जा करने की जरूरत है और यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक robus प्रदान करता हैस्तन कैंसर कोशिका लाइनों में परिपक्व miRNAs की हार्मोनल विनियमन का अध्ययन करने के लिए टी रास्ता.
स्तन कैंसर की कोशिकाओं में miRNA के हार्मोनल विनियमन के लिए तंत्र का निर्धारण इस रोग को समझने के लिए एक मंच प्रदान कर सकते हैं और स्तन कैंसर के लिए संभावित उपचार प्रदान कर सकते हैं. हार्मोन कार्रवाई के लिए इष्टतम स्थिति प्रदान करने के लिए इन कोशिकाओं संवर्धन बहुत महत्वपूर्ण है. इधर, E2 के एक इष्टतम खुराक इलाज के दौरान एक उपयुक्त समय के लिए इस्तेमाल किया गया था इलाज से पहले और कहा कि ब्याज (एस्ट्रोजेन) के हार्मोन बाहर रखा गया था कि यह सुनिश्चित करता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. अन्य हार्मोनल और वृद्धि कारक प्रभाव धीरे – धीरे सीरम का स्तर कम करने और अपने हार्मोन, साइटोकिन्स, और वृद्धि कारकों के अधिकांश के छीन लिया गया है कि FBS है जो डीसीसी-FBS, का उपयोग करके एक न्यूनतम पर रखा गया था. Phenol लाल मुक्त मीडिया आगे फिनोल लाल estrogenic गतिविधि है और सेल लाइनों 20,21 में कुछ कार्यों को प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है, यह देखते हुए अन्य nonhormonal प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हार्मोन के लिए कोशिकाओं के जोखिम के समय बहुत महत्व है. जीन की एस्ट्रोजन जुड़े नियमन के लिए, यह पहले से 24 hrexposure स्तन कैंसर की कोशिकाओं 1,18 में प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन की महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया है कि उत्पादन दिखाया गया है. MiRNAs शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित रहे हैं, mRNAs की तरह, यह यह भी miRNAs की प्रत्यक्ष विनियमन पता लगाने के लिए एक उपयुक्त समय मुद्दा यह है कि कल्पना है. यह इन miRNAs स्तन कैंसर की कोशिकाओं में इन ज्ञात ईआर लक्ष्य की अभिव्यक्ति को कैसे प्रभावित करते हैं और अगर अभी तक निर्धारित किया है.
miRNA अभिव्यक्ति की रूपरेखा क्योंकि miRNA, परिपक्व miRNA अनुक्रम प्राथमिक miRNA और पूर्व miRNA में भी पाया जा सकता है कि इस तथ्य के रिश्तेदार छोटे आकार का चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और क्योंकि उनके जीसी सामग्री 22 में विविधता के कर सकते हैं. कई तकनीकों और chemistries इस कठिनाई को दूर करने के लिए नियोजित किया गया है. इनमें माइक्रोएरे और qPCR विश्लेषण के लिए अलग अलग दृष्टिकोण (चित्रा 2) हैं. माइक्रोएरे व्यापक रूप से पूरे जीनोम गुदा के लिए स्वीकार कर लिया है हालांकिysis, यह झूठी नकारात्मक प्रदान कर सकते हैं और रसायन विज्ञान से मुद्रण प्रौद्योगिकी 23 से लेकर उपलब्ध प्लेटफार्मों के बीच मतभेद मौजूद हैं. MRNA टेप के हजारों की तुलना में हजारों की संख्या में गिने जाते हैं जो अपेक्षाकृत कुछ miRNA जीन, विश्लेषण करते समय भी सामान्य बनाने की प्रक्रिया एक चुनौती प्रस्तुत करता है. qPCR, दूसरी ओर, अधिक संवेदनशील है, और कम जीनों माना जाना हो तो बेहतर लागू किया जाता है. थाली में केवल एक तकनीकी दोहराने के साथ, बड़ी 384 अच्छी तरह प्लेटें में प्रदर्शन किया हालांकि, जब कई प्लेटें विश्लेषण महंगा बना देता है जो प्रत्येक नमूने के लिए विश्लेषण करने की आवश्यकता है. इसके अलावा, हमारे हाथ में, बहुत अधिक गलत नकारात्मक परिणाम माइक्रोएरे की तुलना DLP-LDA विश्लेषण का उपयोग कर प्राप्त किया गया. परिपक्व miRNA अनुक्रम प्राथमिक miRNA और पूर्व miRNA दृश्यों में मौजूद है को देखते हुए, यह पीसीआर तकनीक 24 का उपयोग कर इन टेप के बीच अंतर करने के लिए ब्याज की है. डीएलपी जांच पूर्व miRNAs, और सपा के लिए भी उपलब्ध हैंecific प्राइमरों भी जाती डाई qPCR प्रौद्योगिकी का उपयोग वेरिएंट विभिन्न परिपक्व या अग्रदूत को छोड़ने के लिए तैयार किया जा सकता है.
qPCR परिणाम की रूपरेखा से अंतर अभिव्यक्ति की मान्यता के लिए एक सुनहरा मानक है. qPCR की प्रभावशीलता, तथापि, शाही सेना निकासी, आरएनए अखंडता (गुणवत्ता), सीडीएनए संश्लेषण, प्रथम डिजाइन, पहचान पद्धति (रसायन विज्ञान), और डेटा सामान्य बनाने 1,22,25 के लिए संदर्भ जीन सहित कई मापदंडों पर निर्भर करता है. कम miRNA अनुक्रम की लंबाई ज्यादा विकल्प प्राइमर डिजाइन के लिए कमरा नहीं देता है के बाद से miRNA विश्लेषण के लिए प्रथम डिजाइन के लिए विकल्प बहुत सीमित है, और केवल एक प्राइमर इस छोटे से दृश्य में harbored किया जा सकता है. अत: वैकल्पिक जोड़तोड़ के लिए की जरूरत चित्रा 2 में सचित्र के रूप में. तकनीकी replicates प्रवर्धन विधि की मजबूती और नियोजित प्रक्रिया को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. जैविक प्रतिकृति सामान्य जैविक variatio के एक प्रतिनिधित्व के लिए आवश्यक हैंएन, उपचार ligand के लिए, और एक सेल में देखा प्रभाव प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं दिखाने के लिए कि चर प्रतिक्रिया भी शामिल है. हमारे अनुभव के आधार पर, सेल संस्कृतियों के बीच miRNA अभिव्यक्ति में बदलाव हो सकता है. आमतौर पर इन मतभेदों को 1.3 गुना से कम नहीं हैं, और मूल्यों के औसत और इसी एसडी प्राकृतिक और तकनीकी भिन्नता को पहचानती है. इस बदलाव सेल घनत्व और सेल कार्यों पारित करने के लिए पारित होने से बदल सकता है तथ्य यह है कि, सहित विभिन्न कारकों से परिणाम सकता है. पी मूल्य 0.05 से कम है जब ligand उपचार से उत्पन्न सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए, एक व्यापक रूप से स्वीकार महत्व है. इधर, दो पूंछ वितरण और दो नमूना असमान विचरण मापदंडों का उपयोग जैविक और तकनीकी replicates पर एक छात्र के टी परीक्षण का इस्तेमाल किया गया है. अन्य T-परीक्षण मापदंडों मौजूद हैं, और चुनाव प्रयोगात्मक सेटअप 26 पर निर्भर करता है.
परिपक्व मीर के हार्मोनल नियमों के मूल्यांकन में एक विस्तृत प्रोटोकॉलस्तन कैंसर की कोशिकाओं में एनए प्रदान की गई है. रूपरेखा में और इन miRNA अभिव्यक्ति मान्य के महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों और रसायन शास्त्र स्पष्ट रूप से समझाया गया है. स्तन कैंसर की कोशिकाओं में miRNA के अध्ययन के लिए चुना प्रौद्योगिकी अंत में वास्तव में जांच की जा रही है पर निर्भर करता है.
The authors have nothing to disclose.
हम उनके miRNA विशेषज्ञता को साझा करने के लिए डा. कैरिन Edvardsson, कारोलिंस्का संस्थान, स्वीडन, और डॉ. Eylem Aydogdu, ह्यूस्टन विश्वविद्यालय, के लिए, नियंत्रण रेखा विज्ञान miRNA माइक्रोएरे मंच करने के लिए सलाह प्रदान करने के लिए, डॉ. Xiaolian गाओ, ह्यूस्टन विश्वविद्यालय के आभारी हैं . इस प्रकाशन में सूचना दी अनुसंधान पुरस्कार संख्या R01CA172437 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. यह काम भी समझौते के तहत टेक्सास उभरते प्रौद्योगिकी कोष, कोई से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |