Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

التنميط من MicroRNAs الاستروجين التنظيم في خلايا سرطان الثدي

doi: 10.3791/51285 Published: February 21, 2014

Summary

الجزيئي يشير من خلال كل من الاستروجين وmicroRNAs حاسمة في تطوير سرطان الثدي والنمو. الاستروجين ينشط مستقبلات هرمون الاستروجين، والتي هي عوامل النسخ. يمكن أن العديد من عوامل النسخ تنظيم التعبير عن microRNAs، وmicroRNAs التنظيم الاستروجين يمكن لمحة باستخدام تقنيات مختلفة واسعة النطاق.

Abstract

هرمون الاستروجين يلعب دورا حيويا في التنمية الغدة الثديية وتطور سرطان الثدي. انها تتوسط ظيفتها ملزمة لوتفعيل مستقبلات هرمون الاستروجين (المتطلبات البيئية)، ERα، وERβ. وكثيرا ما upregulated ERα في سرطان الثدي ويدفع انتشار خلايا سرطان الثدي. يعمل المتطلبات البيئية بوصفها عوامل النسخ وتنظيم التعبير الجيني. في حين تم تأسيس التنظيم ERα من الجينات الترميز البروتين بشكل جيد، وتنظيمها من غير المكودة الرنا الميكروي (ميرنا) هو أقل استكشافها. miRNAs تلعب دورا رئيسيا في تنظيم مرحلة ما بعد النسخي من الجينات، مما يعوق ترجمتها أو المهينة مرنا بهم. يمكن miRNAs تعمل كما المسرطنة أو المكثفات ورم واعدة أيضا المؤشرات الحيوية. بين المقايسات ميرنا المتاحة، ميكروأري والكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (QPCR) وقد استخدمت على نطاق واسع لكشف وتحديد مستويات ميرنا. لتحديد miRNAs ينظمها هرمون الاستروجين في سرطان الثدي إشارات، الوتمت مقارنة التعبير EIR في خطوط خلايا سرطان الثدي ERα إيجابية قبل وبعد الاستروجين التنشيط باستخدام كل من ميكروأرس μParaflo-ميكروفلويديك ومزدوجة وصفت تحقيقات منخفض الكثافة صفائف. تم التحقق من صحة النتائج باستخدام فحوصات QPCR محددة، وتطبيق كل من Cyanine قائم على الأصباغ ومزدوجة وصفت الكيمياء أساس تحقيقات. وعلاوة على ذلك، تم استخدام مقايسة الوقت نقطة لتحديد الأنظمة مع مرور الوقت. مزايا النهج فحص ميرنا المستخدمة في هذه الدراسة هو أنه تمكن الفحص السريع للأنظمة ميرنا ناضجة في عينات عديدة، حتى مع كميات عينة محدودة. التخطيط، بما في ذلك شروط محددة لزراعة الخلايا وعلاج هرمون الاستروجين، ومكررات البيولوجية والتقنية، وفحص واسعة النطاق تليها في العمق تأكيد باستخدام تقنيات منفصلة، ​​يضمن الكشف عن لوائح قوية ميرنا، ويلغي ايجابيات كاذبة وغيرها من الأعمال الفنية. ومع ذلك، miRNAs تحور أو غير معروفة، أو لوائح في LEVE نص الابتدائية والسلائفل، لن يتم الكشف عنها. طريقة المقدمة هنا يمثل تحقيق شامل بوساطة الاستروجين التنظيم ميرنا.

Introduction

هرمون الاستروجين هو الهرمون الذي هو مهمة خلال التنمية الغدة الثديية. هرمون الاستروجين يلعب أيضا دورا هاما في تطوير وصيانة، والمخاطر، والعلاج من سرطان الثدي 1. الاستروجين تمارس وظيفتها عن طريق الربط بين المتطلبات البيئية، والتي هي عوامل النسخ وتنظيم الجينات المستهدفة المحددة. اثنين من المتغيرات مستقبلات، ERα أمر ضروري لانتشار تعتمد على هرمون الاستروجين من خلايا سرطان الثدي. معظم سرطانات الثدي هي ERα إيجابية ويعتمد على هرمون الاستروجين للنمو. جعلت هذه إشارات هرمون الاستروجين وERα هدفا للعلاج في هرمون مستقبلات سرطان الثدي إيجابية. فهم الآلية الكامنة وراء ERα المهم لتحسين نتائج العلاج، والتغلب على مقاومة العلاج، وفهم كيفية تطور سرطان الثدي.

miRNAs تلعب أدوارا حاسمة في وظائف الخلية وذلك بسبب تأثير كبير في تنظيم الجينات في مرحلة ما بعد النسخي. miRNAs هي 19-24 النيوكليوتيدات قصيرة، الذين تقطعت بهم السبل واحد، غير المكودة الرنا التي يتم نسخها أول من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني في النصوص ميرنا الابتدائي (الحزب الثوري المؤسسي ميرنا). يتم معالجتها في النواة عن طريق دروشة حيز miRNAs السلائف القصير دبوس (ما قبل ميرنا) ومن ثم معالجتها بواسطة المقامر وفصلها إلى خيوط واحد لتشكيل miRNAs ناضجة في السيتوبلازم. يتم نقل miRNAs ناضجة واحد الذين تقطعت بهم السبل على البروتينات Argonaute لتشكيل معقدة RISC. ثم، يمكن للهجن miRNAs إلى المناطق 3'-غير مترجمة (3'-UTR) من مرنا الهدف، مما يؤدي إلى تنظيم مرحلة ما بعد النسخي من خلال منع ترجمة أو المهينة مرنا الهدف 2.

نظرا للدور الهام الذي يقوم به كل من الاستروجين وmiRNAs في تطور الورم، وتحديد miRNAs المرتبطة العادي أو تعطلت إشارات هرمون الاستروجين مهم من أجل تعزيز فهمنا لتطوير وتحسين العلاج من سرطان الثدي. في حين أن هناك فهم جيد لكيفية ينظم ERα الجينات ترميز البروتين، وتمديدوتفاصيل غير المكودة اللوائح RNA يبقى أن تحقيق شامل. وقد أسفرت الدراسات الأولية التي تهدف إلى توضيح اللوائح ERα من ميرنا في خطوط الخلايا سرطان الثدي نتائج متضاربة، حتى عندما يكون خط الخلية نفسها تم تحليلها 3-6. وهذا قد يكون نتيجة لعلاجات مختلفة، والاختلافات البيولوجية، واستخدام تقنيات مختلفة، وحقيقة أن صغر حجم لل miRNAs جعلها تحديا لتحليلها. هنا، يوصف بروتوكول الذي يتحكم عن الاختلافات والتحف الأسلوب.

لتحديد أي وينظم miRNAs بواسطة هرمون الاستروجين، والتنميط من الثدي نموذج سرطان محددة جيدا من النشاط ERα هو الخطوة الأولى. وقد ولدت العديد من خطوط الخلايا من الأورام سرطان الثدي ERα إيجابية الإنسان، التي تعتمد على هرمون الاستروجين مماثلة لغالبية سرطانات الثدي السريري. الخصائص الجزيئية لاثنين من هذه خطوط الخلايا، T47D وMCF7، بما في ذلك التعبير عن ERα وهدفه المصب،هرمون مستقبلات هرمون البروجسترون (PR)، والافتقار إلى التعبير عن مستقبلات HER2 الغشاء، جنبا إلى جنب مع التعبير عن الجينات التي تستجيب للتمايز الاستروجين واللمعية الظهارية، وجعلها مناسبة كنماذج للسلالة اللمعية من أورام الثدي 7-10. 17β استراديول (E2) هو الشكل السائد من هرمون الاستروجين، واتسمت تركيزات والنقاط الزمنية لتفعيل النسخي الأمثل للERα في دراسات متعددة. في هذا البروتوكول 10 نانومتر E2 العلاج لمدة 24 ساعة ويستخدم T47D وMCF7 كنماذج للنشاط ERα في خلايا سرطان الثدي 1. بالإضافة إلى ذلك، لوائح ميرنا تعتمد على الوقت يمكن تحليلها على وجه التحديد في فترة زمنية من مثل 1-72 ساعة.

ثانيا، تحليل ميرنا يواجه تحديات منفصلة، ​​ويرجع ذلك جزئيا إلى أحجامها قصيرة. لا يتم الاحتفاظ miRNAs جيدا في إجمالي إعداد الحمض النووي الريبي عند تنفيذ Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol الأمطار RNA العادية، أو عندما الحادي ووتستخدم التنقيات العمود ANDARD. يجب أن تؤخذ للحفاظ على إثراء أو لجزء أصغر من الرنا احتياطات خاصة. عن طريق زيادة حجم الأيزوبروبانول، وتخفيض درجة الحرارة قبل الطرد المركزي (-80 ° C)، وإهمال الغسيل في الايثانول 70٪، يمكن تعزيز الاحتفاظ لل miRNAs أثناء هطول الأمطار. أو، يمكن أن تستخدم الأعمدة ومخازن محددة لذات جودة عالية وقوية إعداد الحمض النووي الريبي مجموع المحتوية ميرنا. أيضا لتحليل نفسها، أحجامها قصيرة إنشاء التحديات. لالجينوم على نطاق ميرنا الفرز، وهناك ثلاث تقنيات التنميط ميرنا المشتركة للاختيار من بينها: ميكروأرس، QPCR، والجيل القادم التسلسل. كل تقنية يمكن القيام بها باستخدام منصات مختلفة متعددة، ويطلب من الاستعدادات عينة مختلفة، مع كل المخاطر المختلفة لإدخال الأعمال الفنية. ميرنا في ميكروأري، ورصدت شريحة أو توليفها مع الآلاف من أليغنوكليوتيد]. وتستخدم هذه أليغنوكليوتيد] وتحقيقات، ولكل من لجنة التحقيقتم تصميم و لهجن لتسلسل ميرنا معينة. إعداد نموذج لميكروأرس، كما أجريت في هذه الدراسة، يثري الأول لmiRNAs ثم يدخل Cy5 وCY3 وضع العلامات على miRNAs. ميكروأري يعطي الفرصة لمراقبة مستويات التعبير النسبية لعدد كبير من الجينات في وقت واحد، هو سريع ومناسب لفحص عدد كبير من العينات، ولكن يمكن تحليل متواليات فقط موجودة على ميكروأري وسوف لا يكشف مثل التغيرات في غير معروف أو تحور miRNAs. تحليل ميكروأري كما أجريت في هذا البروتوكول يتطلب أيضا كميات كبيرة نسبيا، حوالي 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لكل عينة لتحليلها. منخفض الكثافة QPCR ميرنا التنميط يتطلب مواد أقل (700 نانوغرام / عينة وتكرار)، ويسمح للكشف والقياس الكمي لل miRNAs. يمكن تحديد مستويات النص، والكمية التي يمكن أن تكون القيمة المطلقة أو كمية نسبية. يتطلب تحليل QPCR الأولى تحويل ميرنا في [كدنا]، وهنا باستخدام يحلقالتمهيدي لكل ميرنا محددة ضمان تحليل فقط ناضجة ميرنا. هذا يولد قالب أطول التي يمكن تضخيمها باستخدام التمهيدي إلى الأمام ميرنا محددة والتمهيدي عكس عالمية مكملة لتسلسل يحلق، ويمكن أن تؤوي إدراج دقق المزدوج إعتبر للخصوصية. QPCR يمكن استخدامها في شكل منخفض الكثافة حيث يمكن الكشف عن مئات لل miRNAs بالتوازي باستخدام واحد أو عدة لوحات 384 جيدا مع أزواج التمهيدي الفردية في كل بئر 11. الجيل القادم التسلسل، من ناحية أخرى، هو فقط من هذه التقنيات التي تسمح لاكتشاف الرواية، miRNAs تحور أو تحريرها، وجميع الرنا في عينة يمكن أن تكون متسلسلة 11. هذه التقنية، ولكن يتطلب خطوات متعددة لإثراء الرنا الصغيرة وانتاج مكتبة الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام عدة خطوات عملية ربط رابط والتنقيات مع المخاطر المعززة اللاحقة من تحوير مستويات التعبير النسبية بين العينات. فإنه يتطلب أيضا bioinformati كبيرةتحليل خدمات العملاء. نظرا للتقنيات مختلفة لميرنا التنميط، والتقنية الأنسب يعتمد على التطبيقات. ميكروأرس هي الأكثر مناسبة عندما المواد وفيرة نسبيا والفائدة لتحديد التعبير التفاضلية لل miRNAs معروفة بالفعل. منخفض الكثافة صفائف QPCR هي الأكثر مناسبة عندما كمية محدودة من عينة متاحة ومطلوب حساسية عالية لل miRNAs المنخفضة التي أعرب عنها. التسلسل هو الأكثر ملاءمة عندما يكون مطلوبا تحليل لل miRNAs المجهول، أو تحور الأشكال الإسوية مختلفة من ميرنا.

في دراسة لل miRNAs التنظيم هرمون الاستروجين في سرطان الثدي، وتستخدم اثنين من خطوط الخلايا نموذج، T47D وMCF7، حيث كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي متاحة بسهولة. تم تحليل كل سطر الخلية في مزارع الخلايا المنسوخة باستخدام مقاطع مختلفة، كل في مكررات التقنية من العلاج. وهذا يسمح للكشف قوية من بتكاثر، miRNAs ERα التنظيم. وتمت مقارنة مستويات التعبير النسبية ميرنا باستخدام كل من ميرنا ميكروأري وتحقيقات مزدوجة إعتبر - صفائف منخفض الكثافة (DLP-LDA) والتحقق من صحة النتائج مع QPCR محددة باستخدام كل cyanine الصبغة وكيمياء DLP. ثم تم تحليل أنظمة ميرنا أخرى في السلاسل الزمنية لتحديد التنظيم الدقيق على مر الزمن، والتي يمكن أن تساعد في التفريق الاختلافات عشوائي أو الإيقاعية من اللوائح التي يسببها هرمون الاستروجين، وتشير الآثار الأولية من الآثار الثانوية. يمكن مقارنات مع Bioinformatical الدراسات ملزم لونين من ERα المزيد من المساعدات في التفريق بين الابتدائي مقابل الآثار الثانوية. أسفر الفحص في تقييم يعول عليه لوائح ميرنا حيث يمكن ثبت أن بعد 24 ساعة العلاج E2 النصوص البروتين الترميز تم تنظيمها بسهولة ولكن تم miRNAs ناضجة لا تتأثر 1. ومع ذلك، فمن الممكن أن miRNAs تنظم في وقت لاحق نقاط الوقت، كما هو موضح في تحليل السلاسل الزمنية المحددة لل miRNAs 1. التفاصيل تحتاج إلى مزيد من استكشاف وبروتوكول المعروضة هنا يوفر robusر وسيلة لدراسة التنظيم الهرموني لل miRNAs ناضجة في خطوط خلايا سرطان الثدي.

Protocol

1. إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام

  1. لT47D سائل الإعلام والثقافة خط الخلية:
    1. خلط 500 مل تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) مع 500 مل F12 [DMEM/F12 (1:1)] في تعقيمها 1 L زجاجة.
    2. إضافة 50 مل من مصل بقري جنيني (وهذا يجعل 5٪ FBS)، ثم 10 مل من البنسلين الستربتوميسين (وهذا يجعل 1٪ من الآفات). خلط محتويات تماما.
    3. تخزين عند 4 درجات مئوية.
  2. لMCF7 سائل الإعلام والثقافة خط الخلية:
    1. خلط 500 مل DMEM مع 25 مل من FBS (5٪ FBS)، ومن ثم 5 مل من البنسلين الستربتوميسين (1٪ الآفات).
    2. تخزين عند 4 درجات مئوية.
    3. لخفض المصل سائل الإعلام والثقافة:
      1. لT47D: اخلطي 500 مل الفينول الحمراء الخالية DMEM مع 500 مل F12 (1:1) في 1 لتر زجاجة تعقيمها، وإضافة 50 مل من ديكستران المغلفة المعالجة الفحم (DCC) FBS لمدة 5٪ DCC-FBS. جعل زجاجة منفصلة مع 5 مل FBS-DCC 0.5٪ DCC-FBS. ثم، إضافة 10 مل من الحشرات (1٪ PEST) لكل زجاجة. خلط محتويات تماما، ستوره في 4 درجات مئوية.
      2. لMCF7: اخلطي 500 مل الفينول الحمراء الخالية DMEM مع 5 مل من L-100X الجلوتامين (200 ملي تركيز النهائي). إضافة 25 مل من DCC-FBS (5٪ DCC-FBS). جعل زجاجة منفصلة مع 2.5 مل DCC-FBS (0.5٪ DCC-FBS). ثم، إضافة 5 مل من الحشرات (1٪ PEST) لكل زجاجة. خلط محتويات تماما، المحل في 4 درجات مئوية.
    4. لالمالحة (PBS) حل الفوسفات مخزنة:
      1. ملء زجاجة 1 لتر تعقيمها بالماء أو الماء المقطر عالى النقاء.
      2. إضافة قرص واحد PBS ويهز أحيانا حتى يذوب قرص.
      3. الأوتوكلاف PBS الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    5. إعداد الأسهم يجند:
      1. إعداد محلول المخزون 100 ملي من E2 عن طريق إذابة 2.72 ملغ من 17β استراديول في 100 ميكرولتر الإيثانول أو DMSO في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتخلط محتويات بلطف. تدور لفترة وجيزة وجعل التخفيفات التسلسلي (1:10) لانتاج 10 ملم، 1 ملم، و 0.1 ملي الأسهم concentrations باستخدام المذيبات. تخزين جميع الحلول الأسهم E2 في -20 درجة مئوية.
      2. إعداد 100 ملي محلول المخزون من العهد الدولي مع العراق عن طريق إذابة 6.07 ملغ من ICI 182780 في 100 ميكرولتر ETOH أو DMSO في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتخلط محتويات بلطف. تدور لفترة وجيزة وجعل التخفيفات التسلسلي (1:10) لانتاج 10 ملم، 1 ملم، 0.1 ملم تركيزات الأسهم باستخدام المذيبات. تخزين جميع الحلول الأسهم ICI في -20 درجة مئوية.
      3. السيارة هو مذيب (الايثانول أو DMSO). وضع 0.5-1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ أو DMSO في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. الثقافة الخلية والعلاج

تنفيذ كل معاملة في لوحات مزدوجة أو ثلاث نسخ للمكررات التقنية. تكرار الإجراء خلية ثقافة والعلاج باستخدام ممر مختلفة من خط الخلية نفسها، والتي ستكون بمثابة تكرار البيولوجية لهذا الخط الخلية. كرر الإجراء مع خط مختلفة من الخلايا لREPLicate النتائج في خط أكثر من خلية واحدة. يجب أن يتم تنفيذ جميع التقنيات ثقافة الخلية تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي.

  1. ثقافة الخلية بدء التشغيل
    1. الحارة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء دافئ العقيمة.
    2. ذوبان الجليد قارورة من الخلايا المجمدة T47D أو MCF7.
    3. تنظيف السطح الخارجي للقارورة وزجاجة سائل الاعلام مع الايثانول 70٪، ومن ثم وضع كل من القارورة وزجاجة معقمة في غطاء تدفق الصفحي.
    4. تسمية العقيمة T-75 قارورة وفقا لذلك (في هود).
    5. إضافة 12-15 مل من وسائل الإعلام المناسبة في القارورة باستخدام ماصة معقمة المصلية (ضمان أن يتم تغطية السطح تماما مع وسائل الإعلام).
    6. نقل الخلايا من القارورة إلى القارورة، والمزيج بلطف.
    7. وضع القارورة في الحاضنة 37 درجة مئوية، المتوفرة مع 5٪ CO 2.
  2. إعداد الخلايا لتلقي العلاج
    1. تأخذ الخلايا من الحاضنة ومراقبة تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي 80٪ على الأقل المشتركnfluent. هذا هو ضمان أن تكون هناك خلايا كافية للتجربة. نقل إلى قارورة غطاء العقيمة.
    2. إزالة وسائل الاعلام من القارورة باستخدام ماصة باستور العقيمة متصلة فراغ. بلطف غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني المرفقة.
    3. إضافة 1 مل من التربسين الدافئ-EDTA إلى القارورة، ووضع القارورة في الحاضنة لمدة 2 دقيقة. هذا هو لجعل فصل الخلايا من القارورة.
    4. إضافة حوالي 3-4 مل من وسائل الإعلام الدافئة الملائمة لالقارورة ويسحن الخلايا منفصلة باستخدام 5 مل ماصة المصلية. يسحن عن طريق تناول الخلايا في ماصة المصلية والافراج عن الخلايا مع غيض من ماصة وضعت ضد الجزء السفلي من القارورة لزيادة الضغط. هذا هو لكسر الخلايا إلى خلايا عدا واحدة.
    5. عد الخلايا، على سبيل المثال باستخدام عداد الخلية، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    6. تسمية 100 ملم لوحات (حسب الحاجة) وإضافة حوالي 10 مل وسائل الاعلام لوحات. لوحة عن 2.0 × 10 6 خلية / لوحة. توزيع الخلايا عن طريق شركة جنرال الكتريكيحوم ntle لوحات.
    7. احتضان الخلايا لمدة 24-48 ساعة، حتى ما يقرب من 80٪ متموجة.
    8. في 80٪ confluency، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 5٪ وسائل الإعلام DCC-FBS المناسبة. ثم، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.
    9. بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 0.5٪ وسائل الإعلام DCC-FBS المناسبة. ثم، واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية.
  3. العلاج بالخلايا
    1. بعد 48 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. تأكد من إزالة أكبر قدر من PBS ممكن.
    2. في أنبوب 15 مل المخروطية، إضافة 10 مل من 0.5٪ وسائل الإعلام DCC-FBS المناسبة. ثم، إضافة 1 ميكرولتر من الأسهم يجند 0.1 ملي (E2 أو ICI) لتركيز النهائي من 10 نانومتر. أيضا، إضافة 1 ميكرولتر من السيارة إلى 10 مل وسائل الاعلام في أنبوب منفصل للتجربة السيطرة.
    3. خلط محتويات الأنبوب بلطف وإضافة إلى الخلايا في لوحة. هذا ينبغي أن يكون يجند واحدة لكل لوحة.
    4. احتضان الخلايا لنقطة الوقت المختار (0-72 ساعة).
<ع الطبقة = "jove_title"> 3. استخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. بعد انتهاء العلاج لفترة من الوقت المطلوب، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم يضاف حوالي 1-2 مل Guanidinium ثيوسيانات الفينول حل للخلايا في طبق من ذهب. تنبيه: Guanidinium حل ثيوسيانات الفينول السامة عن طريق ملامسة الجلد أو العينين، عن طريق الاستنشاق، أو إذا ما ابتلع. ارتداء ملابس واقية مناسبة، والقفازات، وحماية العين / الوجه، واستخدام غطاء الدخان.
    2. تأكد من أن حجم الخلايا ليست أكثر من 10٪ من حجم Guanidinium حل ثيوسيانات فينول، والتي تتناول اللوحة مع الحل والسماح للجلوس لمدة 1 دقيقة. ثم، وتتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة مطاطية ونقل إلى أنبوب microcentrifuge. ويمكن تخزين الخلايا في هذا الحل في -80 درجة مئوية لمدة أسابيع.
    3. استخراج وتنقية الحمض النووي الريبي مجموع من كل معاملة باستخدام guanidinium طريقة ثيوسيانات الفينول كلوروفورم تليها تدور العمود تنقية والدنازأنا الحمض النووي طريقة لتدهور الخلايا الحيوانية.
    4. بعد الاستخراج، ومزال الخلايا في 60 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية المياه. قسامة 1-2 ميكرولتر الحمض النووي الريبي للتحليل الكمي وتخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
    5. قياس تركيزات الحمض النووي الريبي باستخدام 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي وaspectrophotometer. ضمان أن هناك فارغة اتخاذها قبل إجراء أي قياس. أيضا، ويمسح تماما في الوقت متناول اليد طيفي يتم أخذ القياس. وتظهر عادة في تركيزات نانوغرام / ميكرولتر. حفظ النتائج تظهر تركيزات الحمض النووي الريبي.
  2. مراقبة الجودة RNA
    1. يستغرق حوالي 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل عينة ومكان في أنبوب microcentrifuge.
    2. قياس سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام bioanalyzer. عادة يمكن تشغيل 12 عينة في وقت واحد في bioanalyzer. تشغيل عادة ما يستغرق حوالي 25 دقيقة.
    3. مقارنة النتائج مع سلم الحمض النووي الريبي للتأكد من أن الحمض النووي الريبي هو جيد للتجربة. حفظ ونتائج الطباعة.

4. تأكيدا لعلاجمنة: QPCR من الجينات الترميز البروتين

  1. التوليف [كدنا]
    1. تأخذ 500 نانوغرام أو 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع (من كل عينة) وضعت في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تبرزي حجم كل أنبوب يصل إلى 10 ميكرولتر باستخدام ريبونوكلياز خالية من المياه.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من 50 ميكرومتر الاشعال مسدوس عشوائية وأنابيب الحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    3. نقل الأنابيب إلى جليد ل 5min.
    4. لكل عينة، إضافة 4 ميكرولتر من 5X العازلة حبلا الأولى، 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT، 1 ميكرولتر من 10 ملي dNTPs، 0.5 ميكرولتر من مرتفع الثالث، و 1.5 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية المياه.
    5. أنابيب مكان في 25 درجة مئوية كتلة الحرارة أو حمام الماء لمدة 10 دقيقة.
    6. أنابيب نقل إلى 46 درجة مئوية كتلة الحرارة لمدة 1 ساعة. ثم، وأنابيب نقل إلى 70 درجة مئوية كتلة الحرارة لمدة 15 دقيقة لوقف رد الفعل.
    7. تمييع [كدنا] إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر الأسهم (محسوبة باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع المدخلات) باستخدام ريبونوكلياز خالية من المياه لالتخفيفات وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. QPCR
    1. الحصول الاشعال للجينات الجينات الفائدة والمرجعية. ويمكن بسهولة أن تصمم الاشعال باستخدام أداة تصميم التمهيدي حول البرنامج التمهيدي للانفجار NCBI في 12. هذا عادة ما يولد التمهيدي إلى الأمام وعكس كل الجينات في المصالح. وينبغي أن يكون الاشعال 18-22 غليان في الطول، لديها درجة حرارة انصهار 52-58 درجة مئوية، ويكون لها مضمون GC من 40-60٪، وطول AMPLICON من 100-180 سنة مضت.
    2. لكل رد فعل QPCR جيدا، إضافة 10 نانوغرام [كدنا] (2 ميكرولتر من تركيز الأسهم من الخطوة 4.1.7)، 1 بمول كل من الأمام والاشعال من الجينات في المصالح عكس (من الخطوة 4.2.1)، و 5 ميكرولتر من 2X Cyanine صبغ PCR مزيج الرئيسي. يجب أن يكون رد فعل لكل بئر 10 ميكرولتر حجم رد الفعل النهائي.
    3. ضمان عدم وجود الآبار ثلاث نسخ لكل عينة لكل الجين (لمكررات التقنية). صفيحة رد فعل 96 جيدا يمكن استخدامها.
    4. على برنامج نظام QRT-PCR، تعيين مراسل والهدف، أدخل حجم رد الفعل، وحدد المقارنةطريقة دورة عتبة (ΔΔCt)، وتحديد الآبار العينة.
    5. تأكد من إجراء تحليل منحنى ذوبان لجميع أشواط Cyanine صبغ لتأكيد التضخيم من جزء واحد محدد. تشغيل لوحات باستخدام الإعدادات الافتراضية للتشغيل.
    6. حفظ النتائج بعد المدى، وتصدير البيانات (وخاصة القيم المقطعية لمايكروسوفت إكسل).
  3. تحليل البيانات QPCR باستخدام الصيغة ΔΔCT
    ويمكن حساب التغير النسبي في التعبير مرنا مثل تغير أضعاف النسبية للسيطرة على Excel لكل عينة باستخدام الخطوات التالية:
    1. يجب أن يكون جميع نتائج المصدرة من QPCR أعلاه تضمنت القيم ط. حساب قيمة ΔCT باستخدام الصيغة التالية:
      • ΔCT = CT (الجين المستهدف) - CT (الجين المرجعية)
      وينبغي أن يتم ذلك لكل عينة. الهدف هو الجين أو ميرنا من الفائدة.
    2. المقبل، وحساب مجموع الانحراف المعياري (SD) لكل عينة. حساب الأولوالتنمية المستدامة لهذا الجين المرجعية وثم حساب SD لهذا الجين المستهدف (وهذا يمكن أن يتم ذلك على التفوق باستخدام وظيفة STD DEV على القيم CT). ثم حساب مجموع SD لكل عينة باستخدام هذه الصيغة:
      • مجموع SD = (SD2 (الهدف) + SD2 (مرجع)) 1/2
    3. حساب ΔΔCT من كل عينة داخل الجين (الهدف) من خلال:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (تعامل عينة / اختبار) - ΔΔCT (السيطرة / عينة تدريج)
      العينة تدريج هو عينة غير المعالجة.
    4. أخيرا، وحساب أضعاف التغيير (FC) القيم من كل عينة باستخدام الصيغة:
      • FC-2 = ΔΔCT
      قيمة أضعاف تغيير كل عينة يعطي التعبير النسبية للجينات / ميرنا التي تم تطبيع لهذا الجين المرجعية والعينة الضابطة.
    5. اختبار t الطالب يمكن استخدامها لأغراض التحليل الإحصائي باستخدام التوزيع ثنائي الطرف واثنين من عينة الفرق غير متكافئةالمعلمات: (P <0.001 (***)، P <0.01 (**)، وP <0.05 (*)). لا يمكن أن يتحقق هذا على اكسل. تأكد من أن العلاج أدى إلى تنظيم الأهداف المعروفة قبل الشروع في التنميط ميرنا.

5. ميرنا تحليل التنميط

  1. ميرنا ميكروأري
    1. تأخذ 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا المعالجة مع أي مركبة أو يجند، ووضعت في أنبوب microcentrifuge. ضبط مستوى الصوت في أنبوب إلى 20 ميكرولتر. يجب أن يتم تنفيذ كل مقارنة في التكرارات أو يثلث.
    2. أداء ميكروأري ميرنا باستخدام عينات الحمض النووي الريبي أعلاه. وينبغي أن تحدد ملامح التعبير ميرنا ميكروأري باستخدام ميكروأري ميرنا الإنسان ثنائي اللون عينة بواسطة مجموعة μParaflo ميكروفلويديك بيوشيب التكنولوجيا (سانجر miRBase الإصدار 14.0) 13.
    3. ينبغي أن تظهر النتائج miRNAs أعرب تفاضلي. النظر في التعبيرات ميرنا كبيرة عندما ع <0.05.p القيمة <0.10 ويمكن أيضا أن ينظر لمزيد من التعاونتحليل nfirmatory باستخدام QPCR. حفظ هذه القائمة لمزيد من التحقق من صحة ميرنا مع QPCR.
  2. التنميط ميرنا: DLP-LDA
    1. وينبغي تحليل كل عينة في مكررة أو يثلث. تأخذ 700 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المعالجة مع أي مركبة أو يجند، ووضع في أنبوب microcentrifuge. ضبط مستوى الصوت في أنبوب إلى 3 ميكرولتر.
    2. أداء التوليف [كدنا] باستخدام ثنائي وصفت تحقيقات ميرنا طريقة الفحص و10X الاشعال RT. وينبغي أن تكون السعة الإجمالية لكل رد فعل 7.5 ميكرولتر.
    3. وضع أنبوب رد فعل في النظام Thermocycler PCR، وتعيين إلى المعلمات أوصت كما هو مبين في ثنائي وصفت تحقيقات ميرنا طريقة الفحص. بدء التشغيل. وهذا توليد [كدنا]. لاحظ أن كدنا] يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 1 على الأقل في الأسبوع.
    4. أثناء تشغيل رد فعل RT، واخراج لوحات DLP-LDA والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة. كل لوحة تحتوي على 384 مجموعة الآبار التي تحتوي على الاشعال ميرنا فريدة من نوعها والاشعال السيطرة.
    5. يستغرق 6 ميكرولتر من [كدنا] (من 5.2.3) ووضعت في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 450 ميكرولتر من مزيج ماجستير المسابر 2X العالمي PCR المزدوج إعتبر وإضافة 444 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية المياه.
    6. عكس أنبوب حوالي ست مرات لخلط محتويات، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
    7. عندما وصلت إلى لوحة DLP-LDA درجة حرارة الغرفة، وتحميل 100 ميكرولتر في كل من الثمانية 'املأ ميناء' من لوحة. ثم، أجهزة الطرد المركزي لوحة صفيف.
    8. فتح نظام QRT-PCR وتحقق من أن كتلة هو أن لوحة 384 جيدا. إعداد التشغيل باستخدام برنامج SDS. حدد الكمي النسبي (ط)، حدد عدد جيد ونوع المصفوفة، وأدخل وصف العينة لتحديد الآبار.
    9. تشغيل مجموعة باستخدام الظروف الدراجات الحرارية الافتراضي. عندما يتم الانتهاء من التشغيل، لإنقاذ نتائج والتصدير إلى MS Excel و حفظ لمزيد من التحليل باستخدام الصيغة ΔΔCT (الخطوة 4.3).

6. تأكيدا لوائح ميرنا باستخدام منفصلةتحليل QPCR

  1. Cyanine صبغ تحليل QPCR
    1. الاشعال تصميم لتحليل ميرنا المطلوب. تسلسل ميرنا ناضجة، وهو ما يعادل التمهيدي إلى الأمام، ويمكن الحصول عليها من mirbase.org 14. تحويل جميع 'U' إلى 'T'.
    2. إعداد [كدنا]: خذ 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع ومكان في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي. اتبع الإرشادات لبوليا المخلفات والتوليف [كدنا] حبلا الأول من ميرنا من بروتوكول التجميعي [كدنا] وQRT-PCR ميرنا أول حبلا. تمييع الناتجة [كدنا] (1:10) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    3. الحصول على واحد لوحة رد فعل جيدا 96.
    4. لكل رد فعل ميرنا QPCR جيدا، إضافة 16 نانوغرام من بوليا [كدنا] (من الخطوة 6.1.2)، 2 بمول كل من التمهيدي إلى الأمام محددة (من الخطوة 6.1.1) والتمهيدي العالمي (من عدة من الخطوة 6.1.2 )، و 5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي 2X QPCR. حجم رد الفعل النهائي هو 10 ميكرولتر / جيد.
    5. ضمان عدم وجود الآبار ثلاث نسخ لكل عينة لكل ميرنا (لمكررات التقنية). أيضا، تأكد من أن الجين إشارة (عادة U6 snRNA) يتم تضمين.
    6. على برنامج نظام QRT-PCR، تعيين مراسل والهدف، أدخل حجم رد الفعل، حدد دورة عتبة المقارنة (ΔΔCT) الأسلوب، وتحديد الآبار العينة.
    7. تشغيل لوحات باستخدام الإعدادات الافتراضية للتشغيل. تأكد من إجراء تحليل منحنى ذوبان لجميع أشواط Cyanine الصبغة. كل منحنى ذوبان يجب أن يظهر واحد فقط ذروة معينة للتأكد من التضخيم من جزء واحد محدد. إذا لوحظ الذروة أكثر من واحد أو أي ذروة واضحة، الاشعال ليست محددة ولا يمكن استخدام البيانات.
    8. حفظ النتائج بعد المدى، وتصدير البيانات (وخاصة القيم المقطعية لمايكروسوفت إكسل).
  2. إعتبر المزدوج تحليل المسابر QPCR
    1. يستغرق 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع كل، كل في حجم 5 ميكرولتر ومكان في 0.2 مل أنبوب microcentrifuge.
    2. اتبع تعليمات من البروتوكول على أداء النسخ العكسي (RT) باستخدام مجسات مايكرو المزدوج إعتبرRNA الناسخ العكسي كيت 15. يجب أن يكون كل حجم رد الفعل الكلي 15 ميكرولتر. نلاحظ أن لردود الفعل المسابر RT المزدوج المسمى، هناك الاشعال محددة لكل ميرنا لدراستها.
    3. مكان أنبوب رد فعل في النظام thermocycler PCR، وتعيين المعلمات وفقا لبروتوكول مبين في الخطوة 6.2.2 أعلاه. بدء التشغيل. ينبغي أن يستغرق حوالي 70-80 دقيقة.
    4. بعد رد الفعل RT، يخفف من عينة [كدنا] في نسبة 01:05، وتخزين جميع كدنا] في الظلام عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    5. الحصول على واحد لوحة رد فعل جيدا 96.
    6. لكل رد فعل ميرنا QPCR جيدا، إضافة ما يلي: 10 ميكرولتر من المجسات المزدوجة إعتبر 2X العالمي ميكس ماجستير PCR (نفس كاشف كخطوة 5.2.5)، 7.67 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه، 1 ميكرولتر من 20 × الوقت الحقيقي الفحص التمهيدي (محددة لكل ميرنا)، و 1.33 ميكرولتر من [كدنا] من الخطوة 6.2.4 أعلاه. هذا ينبغي أن يكون 20 ميكرولتر حجم رد الفعل النهائي. خلط محتويات بلطف، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
    7. ضمان أن اليحرث هي الآبار ثلاث نسخ لكل عينة لكل ميرنا (لمكررات التقنية). أيضا، تأكد من أن الجين إشارة (عادة U6 snRNA) يتم تضمين.
    8. على برنامج نظام QRT-PCR، تعيين مراسل (FAM) وفاكهه تقضي (NFQ-MGB) لكل ميرنا (الهدف) من الفائدة، أدخل حجم رد الفعل، حدد دورة عتبة المقارنة (ΔΔCt) الأسلوب، وتحديد الآبار العينة.
    9. اتبع الإرشادات لإعداد المعلمات للQPCR تشغيل من بروتوكول فحص مجسات الرنا الميكروي المزدوج المسمى. ثم، بدء التشغيل. حفظ النتائج بعد المدى، وتصدير البيانات (وخاصة القيم المقطعية لمايكروسوفت إكسل).

Representative Results

ويقدم لمحة عامة عن النهج في الشكل 1 وتصور المقارنة بين مختلف التحضيرات والتعديلات عينة الحمض النووي المطلوبة لكل تقنية في الشكل 2.

حالة البيئة والخلايا قبل العلاج مع هرمون مهم في تحديد الآثار الفعلية للهرمون 16. بعض المتوسطة ومصل يحتوي على عوامل النمو التي قد تؤثر على النتائج، لذلك هي خلايا الدم المتعطشة للتأكد من أن جميع التأثيرات الهرمونية قد انخفضت إلى أدنى حد ممكن. وبالتالي، عند علاج مع E2، هناك قدرا أكبر من اليقين أن الآثار الملاحظة ترتبط E2. عامل مهم هو confluency من الخلايا، مما يؤثر اتصال خلية خلية والسلوكيات مثل إشارات خلية خلية والانتشار. سمح الخلايا لتكون 80٪ متموجة (الشكل 3A) والمرفقة جيدا للسماح للنمو وتجنب فقدان الخلايا أثناء الغسيل لاحقة وسائل الإعلام الفصلآنج.

الظروف أثناء استخراج الحمض النووي الريبي والتخزين مهمة لنوعية الحمض النووي الريبي وتحليلها لاحقا. وكما هو معروف أن عدد الخلايا، وطريقة الاستخراج، والمحتوى GC من ميرنا يمكن أن تؤثر على المحصول ونوعية كل من mRNAs وmiRNAs 17. وبالتالي، فمن الضروري إجراء استخراج الحمض النووي الريبي خلال ظروف ريبونوكلياز خالية وللتحقق من نوعية الحمض النووي الريبي قبل الشروع في التجارب. بعد الاستخراج، الكمي من الحمض النووي الريبي يقدم معلومات عن تركيز الحمض النووي الريبي مجموع (تحتوي على كل من mRNAs وmiRNAs)، والتي تمكن الملاحظة من الغلة. كما يوفر التمثيل البياني للنتائج كما رأينا في الشكل 3B، وهذا يسمح لمراقبة نقاء العينة (وعادة ما أشار ذروة واحدة، لوحة أعلى). سيكون العائد الفقراء من الحمض النووي الريبي لا تنتج الامتصاص النوعي في 260 نانومتر (الشكل 3B، اللوحة السفلية). لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الريبي هو من نوعية عالية، RNAوقد تم قياس النزاهة. عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من بين 9-10 يضمن أن الحمض النووي الريبي ليست متدهورة، وهو من نوعية الأمثل. أيضا، ينبغي مراعاة تمثيل رسومي من الحمض النووي الريبي، ويجب أن يكون 18S 28S الريباسي قمم وكما هو مبين في الشكل (4) (لوحة المتوسطة). مقارنة مع سلم (الشكل 4، اللوحة العلوية) ويحدد حجم القمم. ومن شأن الحمض النووي الريبي المتدهورة لها قمم أقل وضوحا وكمية النسبية خفضت من 18S 28S الرنا الريباسي و(الشكل 4، اللوحة السفلية). يمكن زيادة ضمان جزء من الرنا صغيرة باستخدام الحمض النووي الريبي اجيلنت الصغيرة كيت. فمن المستحسن للتحقق من صحة استجابة هرمون الاستروجين بعد العلاج، تحت ظروف تجريبية محددة، قبل الانتقال إلى ميرنا الفرز. A QPCR لا يمكن أن يؤديها على الجين المعروف ER المستهدفة مثل PS2 أو SPINK4 18، وذلك باستخدام قالب [كدنا]. وعادة ما تكون مثل هذه upregulated الجينات داخل 1-24 ساعة بعد العلاج E2. مرة واحدة على نوعية الحمض النووي الريبي واستجابة هرمون الاستروجينوقد تم تقييم، ويمكن إجراء مزيد من التجربة.

ميكروأري لا يزال أسلوب يستخدم على نطاق واسع لفحص واسعة النطاق لميرنا التعبير في الخلايا. على سبيل المثال، ميكروأري ميرنا تستخدم مرة واحدة الواردة 894 miRNAs ناضجة و50 ضوابط تحقيقات فريدة من نوعها في تواءم 1. أجريت التهجين في التكرارات مع إجراء المبادلة الصبغة. وعادة ما تكون النتائج ميكروأري ميرنا تمثيلها بيانيا بواسطة خرائط الحرارة. يبين الشكل 5A خريطة الحرارة، وتمثيل البيانات من المقارنة ميكروأري ميرنا بين السيارة وعينات معاملة E2. أحمر يشير إلى أن ميرنا وupregulated في العينة E2 المعاملة (أعلى التعبير)، في حين أشارت الأخضر downregulation من ميرنا (أقل تعبير). اختيار ميرنا عادة ما يعتمد على أهميتها في التعبير، ويعتبر عادة تكون قيمة ف أقل من 0.05 كبيرة. وmiRNAs التي اشارت الى أن أعرب تفاضلي ينبغي مواصلة التحقق من صحة ثإيث QPCR، لتمييزها عن ايجابيات كاذبة.

مجموعة DLP-LDA، من ناحية أخرى، يستخدم أسلوب يستند QPCR-للكشف عن miRNAs ينظم في شكل 384 جيدا. عادة ما يتم توفير اثنين من لوحات 384 جيدا (بطاقات)، وحمامات سباحة ألف وباء وعادة ما يحتوي على أفضل وأكثر تتميز أعرب غاية miRNAs من B. تجمع ويتم تحديد المستوى النسبي لكل ميرنا من قبل QPCR، حيث يتم تحليل واحد لكل ميرنا كذلك (الشكل 5B). A ط م أعلى قيمة يشير التعبير ميرنا أقل. مثل الكثير من ميكروأري ميرنا، النتائج المحققة من DLP-LDA بحاجة إلى مزيد من التحقق من صحة لضمان الدقة.

التصديقات يمكن القيام بها باستخدام QPCR. هنا، توصف اثنين QPCR طرق الكشف لمنع التحيز وطريقة للسماح للتأكيد شامل والتحقيق لوائح ميرنا. وCyanine قائم على الأصباغ كشف الكيمياء يعمل مختلفة من DLP أن التنميط DLP-LDA يستند، ومناسبة لتأكيدأغراض أوجه. يمكن أن يكون أقل تحديدا لأنه يكشف عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل تضخيمها، ولكن تجانس العينة يمكن تقييمها عن طريق إجراء تحليل منحنى ذوبان. 6A الشكل (اللوحة اليسرى) ويبين تحليل منحنى ذوبان من ميرنا، و ويمكن رؤية محددة بوضوح الذروة موحدة. سيكون لاحظ قمم متعددة إذا التمهيدي هو كميات غير محددة أو كبيرة من التمهيدي ديمر يتم تشكيل (الشكل 6A، اللوحة اليمنى). المقايسات DLP ميرنا من ناحية أخرى، هو أكثر تحديدا كما التضخيم فقط من الهدف يتم الكشف ميرنا. ويمكن ملاحظة المؤامرات التضخيم من كل هدف ميرنا، كما يتضح في الشكل 6B. الخيار للسيطرة على وقوع منتجات التضخيم متعددة باستخدام تحليل منحنى ذوبان هو، ومع ذلك، لا تتوفر مع هذه الكيمياء وCyanine صبغ QPCR هو أقل تكلفة. يمكن cyanine الصبغة وDLP QPCR المقايسات ولدت في بعض الأحيان نتائج مختلفة قليلا. على حد سواء المقايسات QPCR، بالمقارنة مع refeمطلوب RENCE الجينات لتحديد التعبير النسبية للجينات بين اثنين من العينات. الجين المرجعية، كما يشار إلى الجينات التدبير المنزلي، ينبغي أن تكون الجينات التي التعبير لا تتغير والتي يعبر عنها عند مستويات مماثلة لهذا الجين من الفائدة. مثال على الجين إشارة مناسبة في هذه السطور خلية سرطان الثدي هو ARHGDIA، وهو رو الناتج المحلي الإجمالي التفكك المانع الذي يعمل ردود الفعل الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP من البروتينات رو. كما لوحظ في الشكل 6C (أعلى)، لا يتم تغيير مستوى مرنا من ARHGDIA بين السيارة والعينات المعالجة يجند. يمكن أيضا أن تستخدم 18S الرنا الريباسي، وإن كان التعبير العالية يتطلب 1:500 التخفيف منفصلة من الاسهم [كدنا] وبالتالي فهو أقل ملائمة. لتحليل ميرنا، لا يزال هناك نقاش حول الجينات مرجعية واضحة المعالم. حتى الآن، وU6 snRNA هو جين المرجعية التي تم قبولها على نطاق واسع لتحليل ميرنا. U6 snRNA هو 110 ~ النوكليوتيدات طويلة، غير المكودة الحمض النووي الريبي النووي الصغيرة التي تعمل في النووي قبل مرنا الاسكتلنديالجليد 19. كما لوحظ في الشكل 6C (القاع)، ومستويات التعبير U6 هي عن نفسها عبر جميع العينات المعروضة، وبالتالي السماح لإجراء العمليات الحسابية لمستويات متغير من ميرنا. ويمكن ملاحظة الشكل البياني للنتيجة ميرنا QPCR للمقارنة بين المركبات والخلايا E2 المعاملة التي تم تطبيع إلى U6 المرجعية في الشكل 6D. هذا يوضح ميرنا التي تم الكشف عن nonregulated بعد العلاج 24 ساعة E2، ولكن الذي يؤوي ER مواقع ملزم لونين على مقربة من موقعها الجيني، وحددت تحليل السلاسل الزمنية تنظيم كبير 72 ساعة بعد تلقي العلاج.

الشكل 1
الشكل 1. لمحة عامة عن النهج المستخدمة للكشف عن التنظيم الهرموني من ميرنا في خلايا سرطان الثدي.

الرقم 2
الشكل 2. مقارنة بين مختلف الاستعدادات والتلاعب عينة الحمض النووي لكل تقنية كشف ميرنا. (A) ميرنا ميكروأري باستخدام طريقة التكنولوجيا μParaflo يشمل التخصيب، وبولي-A المخلفات ووضع العلامات ربط. (B) تقنية DLP عينة إعداد وطريقة الكشف يتضمن [كدنا] يحلق التوليف التمهيدي الذي يمتد بعد خطوة تمسخ ويوفر جزء يعد إيواء إعداد نموذج التمهيدي وتسلسل التحقيق عكس (C) التكنولوجيا Cyanine صبغويتضمن طريقة الكشف بولي A-المخلفات، والتوليف [كدنا] مع الاشعال بنسبة ضئيلة من DT بما في ذلك سلسلة عالمية 5 '.

الرقم 3
الرقم 3. زراعة الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي. (أ) الخلايا مثقف لتوضيح 80٪ confluency اللازمة قبل العلاج مع يجند. (B) التمثيل البياني للتركيز الحمض النووي الريبي والنقاء بعد الاستخراج. يمثل كل ذروة عينة وعملية استخراج الحمض النووي الريبي ناجحة تعطي النقي (اللوحة العلوية). ويظهر الحمض النووي الريبي المستخرج سيئة لا ذروة الامتصاص واضحة في 260 نانومتر (اللوحة السفلية).

الرقم 4
الشكل 4. & #160؛ الحمض النووي الريبي لمراقبة الجودة من نتائج تحليل الحمض النووي الريبي النزاهة تظهر تمثيل رسومي للسلم (أعلى)، وهو RNA نوعية جيدة (وسط) وعينة الحمض النووي الريبي المتدهورة (القاع).

الرقم 5
الرقم 5. مثال على ميرنا نتائج التنميط. (A) خريطة الحرارة تمثيل ميرنا النتائج ميكروأري لmiRNAs أعرب تفاضلي. وupregulated مير-A، B، C في E2 المعاملة العينة كما هو مبين باللون الأحمر، في حين مير-D، E، F وdownregulated، G في العينة E2 المعاملة كما هو مبين باللون الأخضر. (B) المؤامرات التضخيم لكل ميرنا من نتائج DLP-LDA. وتتضخم ميرنا الكشف كما يتضح من الزيادة في قيمة آكانيوز.

الرقم 6 الرقم 6. تحليل QPCR اللوائح ميرنا (أ) تحليل منحنى ذوبان لميرنا تحليلها باستخدام الكشف Cyanine الصبغة، والتي تبين تجانس جميع العينات المختبرة (يسار) والتضخيم من شظايا متعددة (يمين). (B) المؤامرات التضخيم لكل عينة ل ميرنا. هذا يمكن أن يكون إما من Cyanine صبغ أو DLP طرق الكشف. (C) التمثيل بار الرسم البياني للجينات مرجعية مناسبة لتحليل مرنا ARHGDIA (أعلى) وميرنا لتحليل snRNA U6 (القاع)، يظهر أي تعبير الفرق كبير بين العينات. (D) النتائج ميرنا QPCR لتوضيح المقارنة بين مستويات التعبير النسبية للمير 135A خلال دورة الزمن. يتم طبع الشكل 6D من Katchy وآخرون. 1 بإذن من السيفير. القيم هي عادة متوسط ​​EXPER منفصلةiments (التكرارات البيولوجية) ± SD. يتم استخدام اختبار t الطالب لإثبات أهمية: * ع <0.05.

Discussion

يمكن تحديد آلية التنظيم الهرموني من ميرنا في خلايا سرطان الثدي توفير منصة لفهم هذا المرض ويمكن تقديم العلاج المحتملة لسرطان الثدي. زراعة هذه الخلايا لتوفير الظروف المثلى للعمل هرمون مهم جدا. هنا، وقد وصفت البروتوكول الذي يضمن أن هرمون الفائدة (الاستروجين) تم استبعاد قبل العلاج والذي تم استخدامه جرعة الأمثل للE2 لوقت مناسب خلال فترة العلاج. بقيت آثار أخرى عامل الهرمونية والنمو في الحد الأدنى عن طريق خفض مستويات المصل تدريجيا واستخدام DCC-FBS، وهو FBS التي تم تجريده من معظم الهرمون لها، السيتوكينات وعوامل النمو. تم استخدام الفينول الحمراء الخالية وسائل الإعلام أخرى لتقليل الآثار nonhormonal أخرى، بالنظر إلى أن الفينول الحمراء تم الإبلاغ عن أن يكون نشاطا للاستروجين وتؤثر على وظائف معينة في خطوط الخلايا 20،21. وقت تعرض الخلايا لهرمون له أهمية كبيرة. لتنظيم المرتبطة الاستروجين من الجينات، فإنه قد ثبت في وقت سابق ان 24 hrexposure تنتج استجابة كبيرة من الجينات المستهدفة مباشرة في خلايا سرطان الثدي 1،18. منذ وكتب miRNAs بواسطة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني، مثل mRNAs و، فمن المتصور أن هذه النقطة الوقت المناسب للكشف عن التنظيم المباشر أيضا لل miRNAs. فمن لم يتحدد بعد إذا، وكيف تؤثر هذه miRNAs التعبير عن هذه الأهداف ER المعروفة في خلايا سرطان الثدي.

ميرنا التعبير التنميط يمكن أن يكون تحديا بسبب صغر حجم النسبي لميرنا، والحقيقة أن تسلسل ميرنا ناضجة يمكن العثور عليها أيضا في الحزب الثوري المؤسسي، ميرنا وقبل ميرنا، وبسبب عدم التجانس في المحتويات الخاصة بهم GC 22. وقد استخدمت العديد من التقنيات التنميط وكيمياء للتغلب على هذه الصعوبة. ومن بين هذه المناهج المختلفة من ميكروأري والتحليل QPCR (الشكل 2). على الرغم من أن تحظى بقبول واسع ميكروأري لكامل الجينوم الشرجysis، فإنه يمكن توفير السلبيات كاذبة وتوجد اختلافات بين المنابر المتاحة، بدءا من الكيمياء إلى تكنولوجيا الطباعة 23. كما يعرض عملية التطبيع تحديا عند تحليل عدد قليل نسبيا من الجينات ميرنا، التي تحسب بالآلاف مقارنة مع عشرات الآلاف من النصوص مرنا. QPCR، من ناحية أخرى، هي أكثر حساسية، ويتم تطبيقها على نحو أفضل عندما ينبغي أن ينظر فيها أقل الجينات. ومع ذلك، عندما أجريت في لوحات كبيرة 384 جيدا، مع تكرار تقني واحد فقط لكل لوحة، لوحات متعددة تحتاج إلى تحليل لكل عينة مما يجعل تحليل مكلفة. أيضا، في أيدينا، تم الحصول على العديد من النتائج السلبية أكثر كاذبة باستخدام تحليل DLP-LDA مقارنة ميكروأري. بالنظر إلى أن تسلسل ميرنا ناضجة موجود في الحزب الثوري المؤسسي، ميرنا ومتواليات قبل ميرنا، فإنه من مصلحة للتمييز بين هذه النصوص باستخدام تقنيات PCR 24. هي تحقيقات DLP متوفرة أيضا لمرحلة ما قبل miRNAs، وسويمكن أيضا الاشعال ecific تكون مصممة لاستبعاد مختلفة ناضجة أو السلائف المتغيرات باستخدام Cyanine صبغ التكنولوجيا QPCR.

QPCR هو المعيار الذهبي للتأكد من صحة التعبير التفاضلية من التنميط النتائج. فعالية QPCR، ومع ذلك، يعتمد على العديد من المعلمات بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي، سلامة الحمض النووي الريبي (جودة)، والتوليف [كدنا]، والتصميم التمهيدي، وطريقة الكشف عن (الكيمياء)، وهذا الجين مرجعية لتطبيع البيانات 1،22،25. خيارات التصميم التمهيدي للتحليل ميرنا محدودة للغاية، منذ قصيرة طول تسلسل ميرنا لا يعطي مجالا للبكثير تصميم التمهيدي البديلة، ويمكن آوى التمهيدي واحد فقط في هذا التسلسل القصير. وبالتالي، فإن الحاجة إلى التلاعب البديلة كما هو موضح في الشكل 2. مكررات التقنية مهمة للتحقق من صحة متانة الأسلوب والتضخيم، وعملية توظيف. ويلزم مكررات البيولوجية لتمثيل variatio البيولوجية العامةن، بما في ذلك الاستجابة متغير ليجند العلاج، وتبين أن الآثار ينظر في زنزانة هي استنساخه. بناء على تجربتنا، يمكن أن يحدث تغيرات في التعبير ميرنا بين الثقافات الخلية. عادة ما تكون هذه الخلافات هي أقل من 1.3 أضعاف، ومتوسط ​​القيم والمقابلة SD يحدد الاختلاف الطبيعية والتكنولوجية. هذا الاختلاف يمكن أن تنجم عن عوامل مختلفة بما في ذلك، كثافة الخلية، وحقيقة أن وظائف الخلية يمكن أن تتغير من مرور لمرور. لتحديد تعبيرات هامة إحصائيا الناتجة عن المعالجة يجند، أهمية قبلت على نطاق واسع هو عندما القيمة ع أقل من 0.05. هنا، وقد استخدمت اختبار t للطالب على مكررات البيولوجية والتقنية باستخدام التوزيع ثنائي الطرف وعينة معلمتين الفرق غير متكافئة. المعلمات اختبار t الأخرى موجودة، والاختيار يعتمد على الإعداد التجريبية 26.

بروتوكول مفصلة في تقييم الأنظمة الهرمونية ناضجة ميروقدمت NA في خلايا سرطان الثدي. وقد أوضح التكنولوجيات الهامة والكيمياء في التنميط والتحقق من صحة هذه ميرنا التعبير بوضوح. التكنولوجيا المختارة للدراسات ميرنا في خلايا سرطان الثدي يعتمد في النهاية على ماذا بالضبط يجري التحقيق فيها.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نحن ممتنون للدكتور شياو ليان غاو، جامعة هيوستن، لتقديم المشورة إلى منصة ميكروأري LC العلوم ميرنا، للدكتور كارين Edvardsson، معهد كارولينسكا بالسويد، والدكتور Eylem Aydogdu، جامعة هيوستن، لتبادل الخبرات ميرنا بهم . وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة الوطنية في إطار جائزة عدد R01CA172437. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وأيد هذا العمل أيضا من المنح المقدمة من صندوق التكنولوجيا الناشئة تكساس، في إطار اتفاق لا. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128, (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23, (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40, (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4, (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83, (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17, (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10, (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7, (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37, (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27, (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1, (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12, (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57, (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).
التنميط من MicroRNAs الاستروجين التنظيم في خلايا سرطان الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter