Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

doi: 10.3791/51285 Published: February 21, 2014

Summary

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

Abstract

אסטרוגן ממלא תפקידים חיוניים בהתפתחות בלוטת החלב והתקדמות סרטן השד. זה מתווך את תפקודו באמצעות קשירה והפעלה קולטני אסטרוגן (ERS), ERα, וERβ. ERα לעתים קרובות שהוגברו בסרטן השד ומניע את ההתפשטות של תאי סרטן השד. המיונים לתפקד כגורמי שעתוק ולווסת את ביטוי הגנים. ואילו ההסדרה של ERα של גנים המקודדים חלבונים היא מבוססת היטב, הפיקוח עליה של noncoding microRNA (מירנה) הוא נחקר פחות. miRNAs לשחק תפקיד מרכזי בוויסות לאחר התעתיק של גנים, התרגום המעכב שלהם או משפיל את ה-mRNA שלהם. miRNAs יכול לתפקד כאונקוגנים או מדכאי גידול וגם מבטיחים סמנים ביולוגיים. בין מבחני מירנה הזמינים, microarray ותגובה הכמותית בזמן אמת שרשרת פולימרז (qPCR) נעשה שימוש נרחב כדי לזהות ולכמת רמות מירנה. לזהות miRNAs מוסדר על ידי איתות לאסטרוגן בסרטן השד, הביטוי EIR בשורות תאי סרטן שד ERα חיוביות הושווה לפני ואחרי אסטרוגן הפעלה באמצעות שני microarrays μParaflo-microfluidic והכפול תווית בדיקות נמוכות מערכי צפיפות. תוצאות אומתו באמצעות מבחני qPCR ספציפיים, החלת שני תווית כימיה מבוססת בדיקות מבוססות צבע Cyanine וכפול. יתר על כן, assay נקודת הזמן היה בשימוש כדי לזהות תקנות לאורך זמן. יתרונות של גישת assay מירנה השתמשה במחקר זה הוא שהוא מאפשר הקרנה מהירה של תקנות הבוגרת מירנה בדגימות רבות, גם עם כמויות מדגם מוגבלות. הפריסה, לרבות התנאים הספציפיים לתרבית תאים והטיפול באסטרוגן, משכפל ביולוגי וטכני, והקרנה בקנה מידה גדולה ואחרי אישורים מעמיקים תוך שימוש בטכניקות שונות, מבטיח זיהוי חזק של תקנות מירנה, ומבטל תוצאות חיוביות שגויות וממצאים אחרים. עם זאת, miRNAs מוטציה או לא ידוע, או תקנות בleve התמליל הראשוני והמקדיםl, לא יזוהה. השיטה המוצגת כאן מייצגת חקירה יסודית של הרגולציה מירנה בתיווך אסטרוגן.

Introduction

אסטרוגן הוא הורמון חשוב במהלך התפתחות בלוטת החלב. אסטרוגן גם ממלא תפקידים חשובים בפיתוח, תחזוקה, סיכון, וטיפול בסרטן השד 1. אסטרוגן מפעיל הפונקציה שלה על ידי קשירה לחדרי מיון, שהם גורמי שעתוק ולהסדיר גנים המטרה ספציפיים. של שתי גרסאות קולט, ERα הוא חיוני לשגשוג תלוי באסטרוגן בתאי סרטן השד. רוב מקרי סרטן השד הם ERα חיוביים ותלוי באסטרוגן לצמיחה. זה הפך את איתות אסטרוגן וERα יעד לטיפול בסרטן השד חיובי הורמון לקולטן. הבנת המנגנון הבסיסי של ERα חשובה כדי לשפר את תוצאות טיפול, להתגבר על התנגדות לטיפול, ולהבין כיצד מתפתח סרטן השד.

miRNAs ממלא תפקידים קריטיים בפונקציות תא בשל ההשפעה הגדולה שלהם בויסות הגנים לאחר תעתיק. miRNAs קצר 19-24 נוקלאוטידים, אחד תקוע, Noncoding RNAs אשר עיבד לראשונה על ידי RNA פולימראז II לתעתיקי מירנה ראשוניים (פרי מירנה). הם מעובדים בגרעין על ידי Drosha למבשר-miRNAs קצר סיכה (טרום מירנה) ומעובד לאחר מכן על ידי דייסר ומופרד לגדילים יחיד ליצירת miRNAs הבוגרת בציטופלסמה. MiRNAs הבוגרת חד גדילים מועברות לחלבוני argonaute ליצירת מורכב RISC. לאחר מכן, miRNAs יכול להכליא אזורי 3'-מתורגמים (3'-UTR) של mRNA יעד, מה שמוביל לרגולציה לאחר תעתיק על ידי חסימת תרגום או משפיל את ה-mRNA היעד 2.

בשל התפקיד החשוב שגם אסטרוגן וmiRNAs לשחק בהתקדמות גידול, זיהוי miRNAs קשורים איתות אסטרוגן נורמלית או שיבש הוא חשוב על מנת לשפר את ההבנה של ההתפתחות שלנו ולשפר את הטיפול בסרטן השד. אמנם יש הבנה טובה של איך ERα מסדיר גנים המקודדים חלבונים, ההארכהופרטים של noncoding תקנות RNA נשארים להיחקר ביסודיות. מחקרים ראשוניים במטרה להבהיר הרגולציה ERα של מירנה בשורות תאי סרטן השד הניבו תוצאות סותרות, גם כאשר באותו קו התא כבר ניתח 3-6. זה עשוי להיות תוצאה של טיפולים שונים, וריאציות ביולוגיות, השימוש בטכניקות שונות, והעובדה שהגודל הקטן של miRNAs לגרום להם מאתגר לנתח. כאן, פרוטוקול השולט לוריאציות וחפצי שיטה מתואר.

כדי לזהות איזה miRNAs מוסדר על ידי אסטרוגן, פרופיל של מודל סרטן שד מוגדר היטב של פעילות ERα הוא צעד ראשון. שורות תאים כמה כבר נוצרו מגידולים אנושיים ERα החיובי לסרטן השד, התלויים באסטרוגן הדומה לרוב מקרי סרטן השד קליניים. המאפיינים המולקולריים של שתי שורות תאים אלה, T47D וMCF7, כולל הביטוי של ERα והמטרה במורד הזרם שלו,קולטן הורמון פרוגסטרון (PR), חוסר הביטוי של הקולטן HER2 הקרום, יחד עם ביטוי של גנים בידול אסטרוגן להגיב וluminal-אפיתל, לגרום להם מתאים כמודלים לתת luminal של גידולים בשד 7-10. 17β-אסטרדיול (E2) הוא הצורה הדומיננטית של אסטרוגן, והריכוזים ונקודתי זמן להפעלת תעתיק אופטימלי של ERα היו מאופיינים במחקרים רבים. בטיפול זה פרוטוקול 10 ננומטר E2 ל24 שעות משמש וT47D וMCF7 כמודלים לפעילות ERα בתאי סרטן השד 1. בנוסף, תקנות מירנה תלוית זמן ניתן לנתח באופן ספציפי במרווח של למשל 1-72 שעות זמן.

שנית, יש מירנה ניתוח אתגרים נפרדים, בין שאר בשל הגדלים שלהם קצרים. miRNAs אינם נשמרים גם בסך הכל הכנת RNA כאשר thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol משקעי RNA הרגילים guanidinium מבוצעים, או כאשר stpurifications עמודת andard משמשות. אמצעי זהירות מיוחדת יש לנקוט כדי לשמור או להעשיר עבור החלק הקטן יותר של RNAs. על ידי הגדלת נפח isopropanol, הורדת הטמפרטורה לפני צנטריפוגה (-80 ° C), והשמטת הכביסה ב70% אתנול, התמך של miRNAs יכול להיות משופר במשקעים. לחלופין, ניתן להשתמש בעמודות ספציפיות ומאגרים להכנה איכותית וחזקה של רנ"א הכל המכיל מירנה. גם לניתוח עצמו, הגדלים שלהם קצרים ליצור אתגרים. להקרנת מירנה הגנום כולו, יש שלוש מירנה המשותפת פרופיל טכניקות לבחירה: microarrays, qPCR, והדור הבא של רצף. כל טכניקה יכולה להתבצע באמצעות פלטפורמות שונות מרובות, והכנות מדגם שונות נדרשות, כל אחד עם סיכונים שונים של החדרת חפצים. בmicroarray מירנה, שקופיות הוא הבחין או מסונתז עם אלפי oligonucleotides. oligonucleotides אלה משמשות כמו בדיקות, וכל אחד מהחלליתים נועד להכליא רצף מירנה בפרט. הכנת המדגם עבור microarrays, כפי שבוצעה במחקר זה, מעשירה ראשונה לmiRNAs ולאחר מכן מציגה תיוג Cy5 וCy3 על miRNAs. Microarray נותן את ההזדמנות כדי לבחון את רמות הביטוי היחסית של מספר רב של גנים בו זמנית, הוא מהיר ומתאים להקרנה של מספר הגדול של דגימות, אבל רק יכול לנתח רצפי הווה על microarray ולמשל לא לזהות שינויים בבלתי ידוע או שעבר מוטציה miRNAs. ניתוח microarray כפי שבוצע בפרוטוקול זה דורש גם כמויות גדולות יחסית, כ -5 מיקרוגרם, של רנ"א הכל לדגימה לצורך הניתוח. פרופיל הצפיפות נמוכה qPCR מירנה דורש פחות חומר (700 ng / מדגם ולשכפל), ומאפשר לאיתור והכימות של miRNAs. רמות תמליל ניתן לקבוע, והכמות יכולה להיות סכום מוחלט או סכום יחסי. ניתוח qPCR דורש ראשון המרה של מירנה לתוך cDNA, כאן על ידי שימוש בכרךפריימר לכל מירנה הספציפית הבטחת הניתוח רק מתבגר מירנה. זה יוצר תבנית ארוכה יותר שיכול להיות מוגברות ניצול פריימר קדימה מירנה הספציפית ופריימר הפוכה אוניברסלית משלימה את רצף הכרך, ויכול נמל הכללת בדיקה כפול תווית לייחוד. qPCR ניתן להשתמש בתבנית בצפיפות נמוכה שבו מאות miRNAs ניתן לאתרם במקביל תוך שימוש באחת או כמה צלחות 384 גם עם זוגות פריימר בודדים בכל הטוב 11. הדור הבא של רצף, לעומת זאת, הוא רק של טכניקות אלה המאפשרים הגילוי של רומן, miRNAs מוטציה או עריכה, כפי שיכול להיות רצף כל RNAs במדגם 11. טכניקה זו, עם זאת, דורשת שלבים מרובים להעשיר RNAs הקטן ולייצר ספריית RNA קטנה באמצעות מספר צעדים של ligations מקשר וpurifications עם סיכונים משופרים הבאים של ויסות רמות הביטוי היחסית שלהם בין דגימות. זה גם דורש bioinformati המשמעותיניתוח cs. בהתחשב בטכניקות השונות לפרופיל מירנה, הטכניקה המתאימה ביותר תלויה ביישומים. Microarrays הם מתאים ביותר כאשר חומר הוא יחסית בשפע והעניין הוא להגדיר ביטוי ההפרש של miRNAs כבר ידוע. מערכי qPCR בצפיפות נמוכה הם מתאימים ביותר כאשר כמות מוגבלת של מדגם היא זמינה ורגישות גבוהה של miRNAs הביע נמוך נדרש. רצף הוא מתאים ביותר כאשר הניתוח של miRNAs ידוע, שעבר מוטציה או isoforms שונה של מירנה נדרש.

במסגרת המחקר של miRNAs מוסדר אסטרוגן בסרטן השד, נמצאים בשימוש בשני קווי תאי מודל, T47D וMCF7, שבו כמויות גדולות של RNA זמינות. שורת תאים כל אחד מהם נותחה בתרביות תאים משוכפלים באמצעות קטעים שונים, כל אחד בחזרות טכניות של טיפול. זה מאפשר לגילוי חזק של reproducibly, miRNAs המוסדר ERα. רמות ביטוי מירנה יחסית הושוו באמצעות שני microarray ומירנהבדיקות כפולה תווית - מערכי צפיפות נמוכה (DLP-LDA) ותוקפות את התוצאות עם qPCR הספציפי באמצעות שני לצבוע Cyanine וכימיה של DLP. תקנות מירנה נותחו לאחר מכן עוד זמן סדרה בלהגדיר הרגולציה המדויקת שלהם לאורך זמן, אשר יכול לעזור להבדיל וריאציות אקראיות או היממה מתקנות מושרה אסטרוגן, ומצביע על השפעות עיקריות מהשפעות משניות. השוואות Bioinformatical עם לימודים מחייבים הכרומטין של ERα יכולות לקדם את הסיוע בבידול של ראשוני לעומת השפעות משניות. Assay הביא להערכה אמינה של תקנות מירנה שבו ניתן להקים כי לאחר תעתיקים מקודדי חלבוני טיפול E2 24 שעות הוסדרו בקלות אך miRNAs הבוגרת לא הושפעה 1. עם זאת, לא מן הנמנע כי miRNAs מוסדרים בזמן נקודות מאוחר יותר, כפי שמודגם בניתוח סדרת הזמן של miRNAs שנבחר 1. הפרטים צריכים להיחקר עוד יותר והפרוטוקול המובא כאן מספק Robusדרך לא ללמוד ויסות הורמונלי של miRNAs הבוגר בשורות תאי סרטן השד.

Protocol

1. הכנת תרבית תאי מדיה

  1. לתקשורת ותרבות שורת תאי T47D:
    1. מערבבים 500 מיליליטר הבינוני של הנשר (DMEM) שונה Dulbecco עם F12 500 מיליליטר [DMEM/F12 (1:1)] בבקבוק L autoclaved 1.
    2. הוסף 50 מיליליטר של סרום שור העובר (זה עושה 5% FBS), ולאחר מכן 10 מיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין (זה עושה את הדברה של 1%). מערבבים את התוכן לחלוטין.
    3. חנות ב 4 ° C.
  2. לתקשורת ותרבות שורת תאי MCF7:
    1. מערבבים DMEM 500 מיליליטר עם 25 מיליליטר של FBS (5% FBS), ולאחר מכן 5 מיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין (הדברה 1%).
    2. חנות ב 4 ° C.
    3. לתקשורת ותרבות מופחתת סרום:
      1. לT47D: מערבבים 500 DMEM האדום ללא מיליליטר פנול עם F12 500 מיליליטר (1:1) בבקבוק L autoclaved 1, ולהוסיף 50 מיליליטר של שטופלה בפחם (DCC) FBS מצופה dextran ל5% DCC-FBS. הפוך בקבוק נפרד עם 5 מיליליטר DCC-FBS ל0.5% DCC-FBS. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של הדברה (הדברה 1%) לכל בקבוק. מערבבים את התוכן לחלוטין, storדואר ב 4 ° C.
      2. לMCF7: מערבבים 500 DMEM האדום ללא מיליליטר פנול עם 5 מיליליטר של L-גלוטמין 100x (200 מ"מ ריכוז סופי). הוסף 25 מיליליטר של DCC-FBS (5% DCC-FBS). הפוך בקבוק נפרד עם 2.5 מיליליטר DCC-FBS (0.5% DCC-FBS). לאחר מכן, להוסיף 5 מיליליטר של הדברה (הדברה 1%) לכל בקבוק. מערבבים את התוכן לחלוטין, לאחסן ב 4 ° C.
    4. למלוחים פתרון שנאגרו פוספט (PBS):
      1. מלאו בקבוק זכוכית autoclaved 1 ליטר עם מים ultrapure או מים מזוקקים.
      2. להוסיף אחד לוח PBS ולנער מדי פעם עד שהלוח נמס.
      3. החיטוי פתרון PBS ולאחסן בטמפרטורת חדר.
    5. הכנה של מניות ליגנד:
      1. הכן פתרון מניות 100 מ"מ של E2 על ידי המסת 2.72 מ"ג 17β-אסטרדיול ב100 אתנול μl או DMSO בצינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מיליליטר, ומערבבים את התכולה בעדינות. ספין בקצרה ולעשות דילולים סדרתי (1:10) להניב 10 מ"מ, 1 מ"מ, ו0.1 מ"מ concentr המניהations באמצעות הממס. אחסן את כל פתרונות מניות E2 ב -20 ° C.
      2. הכן פתרון מניות 100 מ"מ של ICI ידי המסת 6.07 מ"ג של ICI 182,780 ב100 μl EtOH או DMSO בצינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מיליליטר, ומערבבים את התכולה בעדינות. ספין בקצרה ולעשות דילולים סדרתי (1:10) להניב 10 מ"מ, 1 מ"מ, 0.1 ריכוזי מניית מ"מ באמצעות הממס. אחסן את כל פתרונות מניות ICI ב -20 ° C.
      3. הרכב הוא הממס (אתנול או DMSO). הנח 0.5-1 מיליליטר של 100% אתנול או DMSO בצינור סטרילי 1.5 מיליליטר microcentrifuge, ולאחסן ב -20 ° C.

2. תא תרבות וטיפול

לבצע כל טיפול בצלחות כפולות או שלושה עותקים למשכפל טכני. חזור על הליך תרבית תאים וטיפול באמצעות מעבר של אותו הקו הסלולרי, שישמש כלשכפל ביולוגי של קו זה תא שונה. לחזור על התהליך עם שורת תאים שונה לreplicate ממצאים עולים בקנה אחד יותר מתא אחד. יש לבצע את כל טכניקות תרבית תאים בתנאים סטריליים בזרימה למינרית.

  1. הפעלת תא התרבות
    1. לחמם את התקשורת ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים חם סטרילי.
    2. הפשירו בקבוקון קפוא של תאי T47D או MCF7.
    3. נקה את החלק החיצוני של בקבוקון ובקבוק תקשורת עם 70% אתנול, ולאחר מכן למקם את שני בקבוקון ובקבוק בזרימה למינרית סטרילי.
    4. תווית בקבוק סטרילי T-75 בהתאם (בשכונה).
    5. הוספת 12-15 מיליליטר של תקשורת המתאימה לתוך הבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגיות סטרילי (להבטיח משטח שמכוסה לגמרי עם תקשורת).
    6. להעביר את התאים מהבקבוקון לבקבוק, ומערבבים בעדינות.
    7. הנח בקבוק בחממה 37 מעלות צלזיוס, המסופקת עם 5% CO 2.
  2. הכנת תאים לטיפול
    1. קח את התאים מחוץ לחממה ולבחון תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים הם שיתוף 80% לפחותnfluent. זאת על מנת להבטיח שיש מספיק תאים לניסוי. העבר את הבקבוק למכסת מנוע סטרילית.
    2. הסר את המדיה מבקבוק בעזרת פיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום. לשטוף בעדינות תאים מצורפים פעמיים עם PBS.
    3. הוסף 1 מיליליטר של טריפסין-EDTA החם לבקבוק, ולשים את הבקבוק בחממה במשך 2 דקות. זה הוא להפוך את התאים לניתק מהבקבוק.
    4. הוסף על 3-4 מיליליטר של תקשורת החמה המתאימה לבקבוק וtriturate התאים המנותק באמצעות פיפטה סרולוגיות 5 מיליליטר. Triturate על ידי לקיחה את התאים בפיפטה סרולוגיות ומשחררים את התאים עם קצה פיפטה להציב נגד החלק התחתון של הבקבוק כדי להגביר את הלחץ. זה הוא לשבור את התאים בנפרד לתוך תאים בודדים.
    5. ספירת התאים, למשל באמצעות דלפק תא, על פי הפרוטוקול של היצרן.
    6. תווית 100 צלחות מ"מ (לפי צורך) ולהוסיף על 10 מיליליטר תקשורת לצלחות. צלחת על 2.0 x 10 6 תאים / צלחת. הפץ תאים על ידי gentle מתערבל הצלחות.
    7. דגירה תאים עבור 24-48 שעה, עד מחוברות כ 80%.
    8. בconfluency 80%, לשטוף תאים פעמיים עם PBS, ולהוסיף את תקשורת DCC-FBS המתאים 5%. ואז, דגירה תאים עבור 24 שעות.
    9. לאחר 24 שעות, לשטוף תאי פעמיים עם PBS, ולהוסיף את תקשורת DCC-FBS המתאים 0.5%. ואז, דגירה תאים עבור 48 שעות נוספות.
  3. טיפול בתאים
    1. לאחר 48 שעה, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הקפד להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר.
    2. בצינור חרוטי 15 מיליליטר, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת DCC-FBS המתאים 0.5%. לאחר מכן, להוסיף 1 μl של מניית 0.1 מ"מ ליגנד (E2 או ICI) לריכוז סופי של 10 ננומטר. כמו כן, להוסיף 1 μl של רכב ל10 מיליליטר תקשורת בצינור נפרד לניסוי הבקרה.
    3. מערבבים את התוכן בצינור בעדינות ולהוסיף לתאים בצלחת. זה צריך להיות ליגנד אחד לכל צלחת.
    4. דגירה תאים עבור נקודת הזמן שנבחר (0-72 hr).
<כיתת p = "jove_title"> 3. RNA הפקה ובקרת איכות

  1. מיצוי RNA
    1. לאחר סיום הטיפול לתקופה הרצויה של זמן, לשטוף תאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף כ 1-2 מיליליטר פתרון thiocyanate-פנול guanidinium לתאים בצלחת. זהירות: פתרון thiocyanate-פנול guanidinium הוא רעיל במגע עם עור או בעיניים, על ידי שאיפה, או במקרה של בליעה. לבש בגדים מתאימים מגן, כפפות, ועל עיניים / פנים הגנה, ולהשתמש במנדף.
    2. ודא שעוצמת הקול של תאים הוא לא יותר מ10% מהיקף פתרון thiocyanate-פנול guanidinium, וכי הצלחת מכוסה בפתרון ולאפשר לשבת במשך דקות 1. ואז, לגרד תאים באמצעות מגרד גומי ולהעביר לצינור microcentrifuge. ניתן לאחסן את התאים בפתרון זה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שבועות.
    3. לחלץ ולטהר רנ"א הכל מכל טיפול בשיטת thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium ואחריו טיהור טור ספין וDNaseשיטת השפלה אני DNA לתאים של בעלי חיים.
    4. לאחר חילוץ, תאי eluted ב60 מים RNase ללא μl. RNA μl aliquot 1-2 לניתוח כימות וRNA החנות ב -80 ° C.
    5. מדוד את ריכוזי RNA באמצעות 1 μl של RNA וaspectrophotometer. ודא שיש ריק נלקח לפני כל מדידה נעשה. כמו כן, למחוק לגמרי את הזמן להגיע ספקטרופוטומטר מדידה נלקחת. ריכוזים בדרך כלל מוצגים בng / μl. שמירת תוצאות מראים ריכוזי RNA.
  2. בקרת איכות RNA
    1. קח על 100 RNA ng של כל דגימה ומקום בצינור microcentrifuge.
    2. מדוד שלמות RNA באמצעות bioanalyzer. בדרך כלל ניתן להפעיל 12 דגימות בבת אחת בbioanalyzer. לרוץ בדרך כלל לוקח בערך 25 דקות.
    3. להשוות את התוצאות עם סולם RNA כדי להבטיח כי RNA הוא טוב לניסוי. שמור ותוצאות הדפסה.

4. אישור על התייחסment: qPCR של גני המקודדים חלבונים

  1. סינתזת cDNA
    1. קח 500 ng או 1 מיקרוגרם של רנ"א המוחלט (של כל דגימה) ולהכניס לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. תביא את נפחו של כל צינור עד 10 μl שימוש במי RNase חינם.
    2. הוסף 2 μl של 50 מיקרומטר פריימרים hexamer אקראיים וצינורות חום ל70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. העבר את הצינורות לקרח עבור 5min.
    4. עבור כל דגימה, להוסיף 4 μl של חיץ הגדיל הראשון 5x, μl 1 של 0.1 M DTT, μl 1 של 10 מ"מ dNTPs, 0.5 μl של כתב עילי III, ו1.5 מים RNase ללא μl.
    5. צינורות מקום בבלוק 25 ° C חום או אמבט מים במשך 10 דקות.
    6. העברת צינורות לגוש חום 46 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ואז, צינורות העברה לגוש חום 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לעצור את התגובה.
    7. לדלל את cDNA ל5 ng / μl מניות (מחושבים באמצעות סך קלט RNA) שימוש במי RNase חינם לדילולים ולאחסן ב -20 ° C.
  2. qPCR
    1. השג פריימרים לגנים של גנים עניין והתייחסות. פריימרים יכולים בקלות להיות מעוצבים באמצעות כלי עיצוב פריימר על תכנית פריימר-תפציץ של צמח השדה 12. זה בדרך כלל יוצר פריימר קדימה והפוך לכל גן של עניין. Primers צריך להיות 18-22 נ"ב באורך, יש טמפרטורת התכה של 52-58 מעלות צלזיוס, יש לי תוכן GC של 40-60%, ואורך amplicon של 100-180 נ"ב.
    2. עבור כל תגובת qPCR היטב, להוסיף 10 ng cDNA (2 μl מריכוז המניה מצעד 4.1.7), pmol 1 של כל אחד מקדימה לאחור פריימרים של הגן של עניין (מצעד 4.2.1), ו -5 μl של תמהיל 2x Cyanine צבע PCR מאסטר. התגובה לכל אחד גם צריכה 10 μl סופי עוצמת תגובה.
    3. ודא שיש בארות בשלושה עותקים עבור כל דגימה עבור כל גן (למשכפל טכני). ניתן להשתמש צלחת תגובת 96 היטב.
    4. על תוכנת מערכת qRT-PCR, להקצות את הכתב והיעד, הזן נפח תגובה, בחר ההשוואתישיטת מחזור סף (ΔΔCt), ומגדיר את בארות מדגם.
    5. הקפד לבצע ניתוח עקום היתוך לכל ריצות צבע Cyanine כדי לאשר את ההגברה של שבר אחד ספציפי. הפעל צלחות תוך שימוש בהגדרות ברירת המחדל עבור הריצה.
    6. שמירת תוצאות אחרי הריצה, ונתוני יצוא (בעיקר ערכי CT ל-MS Excel).
  3. ניתוח נתונים qPCR באמצעות נוסחת ΔΔCT
    השינוי בביטוי mRNA יחסי יכול להיות מחושב כשינוי יחסי של פי לשלוט באקסל עבור כל דגימה באמצעות השלבים הבאים:
    1. כל התוצאות מיוצאות מqPCR מעל צריכים את ערכי ה-CT כלל. לחשב את ערך ΔCT שימוש בנוסחא הבאה:
      • ΔCT = CT (גן המטרה) - CT (גן התייחסות)
      זה צריך להיעשות עבור כל דגימה. היעד הוא הגן או מירנה של עניין.
    2. בשלב הבא, לחשב את סטיית התקן הכוללת (SD) עבור כל דגימה. מחשבון ראשוןSD עבור גן ההתייחסות ולאחר מכן לחשב את ה-SD לגן המטרה (זה יכול להיעשות על Excel באמצעות פונקצית STD DEV על ערכי CT). ואז לחשב את SD בסך הכל עבור כל דגימה באמצעות נוסחה זו:
      • SD סה"כ = (SD2 (יעד) + SD2 (הפניה)) 1/2
    3. לחשב את ΔΔCT של כל דגימה בתוך גן (יעד) על ידי:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (טופל מדגם בדיקה /) - ΔΔCT (שליטה / מדגם כיל)
      מדגם כיל הוא המדגם שלא טופל.
    4. לבסוף, לחשב את מתקפל שינוי הערכים (FC) של כל דגימה באמצעות הנוסחה:
      • FC = 2-ΔΔCT
      מתקפל שינוי הערך של כל מדגם נותן ביטוי היחסי של הגן / מירנה אשר כבר מנורמלות לגן ההתייחסות ודגימת הבקרה.
    5. מבחן t של הסטודנט יכול לשמש לניתוח סטטיסטי באמצעות הפצת שני זנב ושני מדגם שונות שאינו שווהפרמטרים: (P <0.001 (***), P <0.01 (**), ו-P <0.05 (*)). זו יכולה להיות מושגת על Excel. לאשר כי הטיפול הביא לרגולציה של מטרות ידועות לפני שימשיכו עם פרופיל מירנה.

5. מירנה Profiling ניתוח

  1. microarray מירנה
    1. קח 5 מיקרוגרם של רנ"א המבודד מהתאים שטופלו גם עם רכב או ליגנד, ומקום בצינור microcentrifuge. להתאים את עוצמת הקול בשפופרת ל20 μl. כל השוואה צריכה להתבצע בכפילויות או triplicates.
    2. בצע microarray מירנה באמצעות דגימות RNA לעיל. פרופילי ביטוי microarray מירנה צריכים להיקבע באמצעות מערך microarray מירנה האנושי כפול צבע מדגם על ידי הטכנולוגיה biochip μParaflo microfluidic (סנגר שחרור miRBase 14.0) 13.
    3. תוצאות צריכה להראות miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי. קחו למשל ביטויי מירנה משמעותיים כאשר p <0.05.p ערך <0.10 יכול גם להיחשב לשיתוף נוסףניתוח nfirmatory באמצעות qPCR. שמירה של רשימת מירנה זה לאימות נוספת עם qPCR.
  2. פרופיל מירנה: DLP-LDA
    1. כל דגימה צריכה להיות מנותחת בכפילויות או triplicates. קח 700 ng של רנ"א הכל מהתאים שטופלו גם עם רכב או ליגנד, ואת המקום בצינור microcentrifuge. להתאים את עוצמת הקול בשפופרת ל3 μl.
    2. לבצע סינתזת cDNA בשיטה כפולה תווית בדיקות מירנה assay ו10x פריימרים RT. נפח כולל עבור כל תגובה צריך להיות 7.5 μl.
    3. הנח צינור תגובה בthermocycler מערכת ה-PCR, ולהגדיר פרמטרים מומלצים כפי שצוין בשיטת assay בדיקות מירנה הכפול שכותרתו. התחל את הריצה. זה יפיק cDNA. שים לב שcDNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך שבוע לפחות 1.
    4. אמנם תגובת RT פועלת, להוציא את צלחות DLP-LDA ולאפשר לשבת בטמפרטורת חדר. כל צלחת מערך מכילה 384 בארות המכילות פריימרים מירנה ייחודיים ופריימרים שליטה.
    5. קח 6 μl של cDNA (מ 5.2.3) ומקום בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוספת 450 μl של מיקס מאסטר בדיקות 2x יוניברסל PCR הכפול תווית ולהוסיף 444 מים RNase ללא μl.
    6. הפוך צינור כשש פעמים כדי לערבב את תוכן, ובקצרה צנטריפוגות.
    7. כאשר צלחת DLP-LDA הגיעה טמפרטורת חדר, עומס 100 μl לכל אחד משמונה "מלא יציאה 'של הצלחת. ואז, בצנטריפוגה את צלחת המערך.
    8. פתח את מערכת qRT-PCR ולבדוק שהבלוק הוא שלצלחת 384 גם. הגדר את טווח שימוש בתוכנת SDS. בחר כימות יחסי (CT), בחר את המספר היטב וסוג המערך, ולהזין את תיאור מדגם להגדיר בארות.
    9. להפעיל מערך באמצעות תנאי רכיבה תרמית ברירת מחדל. כשהוא סיים לרוץ, לשמור את התוצאות ויצוא ל-MS Excel ולחסוך לניתוח נוסף באמצעות נוסחת ΔΔCT (שלב 4.3).

6. אישורן של תקנות מירנה באמצעות נפרדניתוח qPCR

  1. ניתוח qPCR צבע Cyanine
    1. פריימרים עיצוב לניתוח מירנה רצויה. רצף של מירנה הבוגרת, אשר שווה פריימר קדימה, ניתן להשיג מmirbase.org 14. להמיר את כל 'U' ל 'T'.
    2. הכן cDNA: קח 1 מיקרוגרם של רנ"א הכל ומקום בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. בצע את ההוראות לפולות עוקב וסינתזת cDNA גדיל הראשונה של מירנה מפרוטוקול הסינתזה cDNA וqRT-PCR מירנה גדיל הראשון. לדלל את cDNA וכתוצאה מכך (1:10) ולאחסן ב -20 ° C.
    3. השג צלחת תגובת 96 היטב אחד.
    4. עבור כל תגובת מירנה qPCR היטב, להוסיף 16 ננוגרם של הפולה cDNA (מצעד 6.1.2), 2 pmol של כל אחד מפריימר קדימה הספציפי (מצעד 6.1.1) ופריימר האוניברסלי (מהערכה מהצעד 6.1.2 ), ו -5 μl של תערובת ההורים 2x qPCR. סופי נפח תגובה הוא 10 μl / טוב.
    5. ודא שיש בארות בשלושה עותקים עבור כל דגימה לכל מירנה (למשכפל טכני). כמו כן, ודא כי גן התייחסות (בדרך כלל U6 snRNA) כלול.
    6. על תוכנת מערכת qRT-PCR, להקצות את הכתב והיעד, הזן נפח תגובה, בחר את המחזור ההשוואתי הסף (ΔΔCT) שיטה, ולהגדיר בארות מדגם.
    7. הפעל צלחות תוך שימוש בהגדרות ברירת המחדל עבור הריצה. הקפד לבצע ניתוח עקום היתוך לכל ריצות צבע Cyanine. כל עקומת התכה צריכה להראות שיא ספציפי אחד בלבד כדי לאשר את ההגברה של שבר אחד ספציפי. אם שיא יותר מפעם אחת או לא שיא ברור הוא ציין, פריימרים אינם ספציפיים ולא ניתן להשתמש בנתונים.
    8. שמירת תוצאות אחרי הריצה, ונתוני יצוא (בעיקר ערכי CT ל-MS Excel).
  2. ניתוח כפול תווית בדיקות qPCR
    1. קח 10 ng של כל רנ"א הכל, כל אחד ב5 μl נפח ומקום ב0.2 מיליליטר צינור microcentrifuge.
    2. עקוב אחר הוראות מהפרוטוקול על ביצוע השעתוק לאחור (RT) באמצעות מיקרו בדיקות הכפול תוויתRNA ההפוך transcriptase ערכת 15. כל אחד בסך הכל נפח תגובה צריך להיות 15 μl. שים לב כי לתגובות בדיקות RT הכפול תווית, יש פריימרים ספציפיים לכל מירנה כדי להיחקר.
    3. צינור מקום התגובה בthermocycler מערכת ה-PCR, ולהגדיר את הפרמטרים בהתאם לפרוטוקול שצוין בשלב 6.2.2 לעיל. התחל את הריצה. זה צריך לקחת כ 70-80 דקות.
    4. לאחר תגובת RT, לדלל cDNA המדגם ביחס 1:5, ולאחסן את כל cDNA בחושך ב-20 ° C.
    5. השג צלחת תגובת 96 היטב אחד.
    6. עבור כל תגובת מירנה qPCR היטב, להוסיף את הדברים הבאים: 10 μl של בדיקות כפולה תווית 2x יוניברסל PCR מיקס מאסטר (אותו מגיב כצעד 5.2.5), 7.67 μl מים RNase חינם, μl 1 של 20 × פריימר assay בזמן אמת (ספציפי לכל מירנה), ו1.33 μl של cDNA מהצעד 6.2.4 לעיל. זה צריך להיות 20 μl סופי עוצמת תגובה. מערבבים את התכולה בעדינות, ובקצרה צנטריפוגות.
    7. ודא כי הפה הם בארות בשלושה עותקים עבור כל דגימה לכל מירנה (למשכפל טכני). כמו כן, ודא כי גן התייחסות (בדרך כלל U6 snRNA) כלול.
    8. על תוכנת מערכת qRT-PCR, להקצות את הכתב (FAM) ומרווה (NFQ-MGB) עבור כל מירנה (יעד) של עניין, הזן נפח תגובה, בחר את המחזור ההשוואתי הסף (ΔΔCt) שיטה, ולהגדיר בארות מדגם.
    9. בצע את ההוראות להגדרת הפרמטרים לqPCR לרוץ מפרוטוקול assay בדיקות microRNA הכפול שכותרתו. לאחר מכן, התחל במנוסה. שמירת תוצאות אחרי הריצה, ונתוני יצוא (בעיקר ערכי CT ל-MS Excel).

Representative Results

סקירה של הגישה מוצגת באיור 1 והשוואה של ההכנות מדגם השונות ושינויי חומצות גרעין הנדרשים לכל טכניקה היא מדמיין באיור 2.

המצב והסביבה של התאים לפני טיפול עם הורמון חשוב בקביעת ההשפעות בפועל של ההורמון 16. חלקם בינוני וסרום מכילים גורמי גדילה שעשויה להשפיע על תוצאות, ולכן תאי סרום המורעב כדי להבטיח שכל השפעות הורמונליות צומצמו למינימום. לפיכך, בעת טיפול עם E2, יש ודאות יותר כי ההשפעות שנצפו קשורות-E2. גורם חשוב הוא confluency של תאים, אשר משפיע על קשר בין תאים והתנהגויות כגון איתות תאי תאים והתרבות. תאים הורשו להיות מחוברות 80% (איור 3 א) וכן מצורף כדי לאפשר צמיחה ולמנוע אובדן של תאים במהלך ch כביסה ואמצעי התקשורת הבאAnge.

התנאים במהלך חילוץ ואחסון RNA חשובים לאיכות של RNA וניתוח שלאחר מכן. ידועים גם כי מספר התאים, שיטת החילוץ, ותוכן GC של מירנה יכולים להשפיע על התפוקה והאיכות של שניהם mRNAs וmiRNAs 17. לפיכך, יש צורך לבצע מיצוי RNA בתנאי RNase חינם וכדי לבדוק את האיכות של RNA לפני שתמשיך עם ניסויים. לאחר חילוץ, כימות של RNA מספקת מידע על הריכוז של RNA הכולל (המכיל גם mRNAs וmiRNAs), המאפשר תצפית של תשואה. הוא גם מספק ייצוג גרפי של תוצאות כפי שניתן לראות באיור 3 ב, וזה מאפשר לתצפית של טוהר המדגם (בדרך כלל מצויינים על ידי שיא אחד, פנל עליון). תשואה ירודה של RNA הייתי לייצר שום קליטה ספציפית ב260 ננומטר (איור 3B, פנל תחתון). כדי לקבוע אם ה-RNA הוא באיכות גבוהה, RNAיושרה נמדדה. מספר שלמות RNA (רין) של בין 9-10 מבטיח כי RNA הוא לא מושפל והוא באיכות אופטימלית. כמו כן, הייצוג הגרפי של RNA יש לשים לב, ו18S ו28S rRNA צריך פסגות כפי שמוצג באיור 4 (פנל באמצע). השוואה עם הסולם (איור 4, פנל עליון) מזהה את הגודל של הפסגות. RNA מושפל יהיה פסגות פחות ברורות וכמות היחסית מופחתת של 18S ו28S rRNA (איור 4, פנל תחתון). חלק קטן של RNA הקטן נוסף יכול להיות מובטח באמצעות Agilent RNA הקטן קיט. מומלץ לאמת את תגובת אסטרוגן לאחר טיפול, תחת תנאי ניסוי שצוינו, לפני שתמשיך להקרנת מירנה. ניתן לבצע qPCR בגן יעד ER ידוע כגון PS2 או SPINK4 18, תוך שימוש בתבנית cDNA. גנים כאלה הם בדרך כלל שהוגברו בתוך 1-24 שעות לאחר טיפול E2. ברגע שהאיכות של RNA והתגובה לאסטרוגןכבר העריך, ניסוי יכול להמשיך להתנהל.

Microarray הוא עדיין טכניקה המשמשת באופן נרחב להקרנה בקנה מידה גדולה לביטוי מירנה בתאים. לדוגמא, microarray מירנה ששימש בעבר כלול 894 miRNAs בוגרת ו50 בקרות בדיקות ייחודיות ברביעיית 1. הכלאות בוצעו בכפילויות עם הליך החלפת צבע. תוצאות microarray מירנה בדרך כלל מיוצגות בצורה גרפית על ידי מפות חום. איור 5A מציג מפת חום, המייצג את הנתונים מהשוואת microarray מירנה בין הרכב והדגימות טופלו E2. אדום מצביע על כך שמירנה היא שהוגברו במדגם שטופל-E2 (ביטוי גבוה יותר), ואילו הירוק הצביעה downregulation של מירנה (ביטוי נמוך יותר). בחירת מירנה בדרך כלל תלויה במשמעות שלהם בביטוי, ובדרך כלל p-value פחות מ 0.05 נחשבת משמעותי. MiRNAs שמסומנים לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי צריך להיות תוקף נוסף wה-i qPCR, כדי להבדיל אותם מתוצאות חיוביות שגויות.

מערך DLP-LDA, לעומת זאת, משתמש בשיטה מבוססת qPCR למסך עבור miRNAs המוסדר בפורמט 384 גם. בדרך כלל שתי צלחות 384 גם (כרטיסים) מסופקות, בריכות וברכה ב 'מכיל בדרך כלל מאופיין יותר ויותר הביע מאוד miRNAs מאשר ב' הבריכה ברמה היחסית של כל מירנה נקבעת על ידי qPCR, שבו הוא ניתח למירנה היטב (איור 5). ערך Ct גבוה יותר מצביע על ביטוי פחותים מירנה. בדומה microarray מירנה, תוצאות שהושגו מDLP-LDA צריכים להיות תוקף נוסף כדי להבטיח דיוק.

ניתן לבצע אימותים באמצעות qPCR. הנה, שתי שיטות זיהוי qPCR מתוארות כדי למנוע הטיה שיטה ולאפשר לאישור וחקירה של תקנות מירנה יסודיים. הכימיה זיהוי מבוסס צבע Cyanine עובדת שונה מאשר DLP שפרופיל DLP-LDA מבוסס על, והוא מתאים לאישורמטרות ation. זה יכול להיות פחות ספציפי כפי שהוא מזהה את כל גדילי הדנ"א הכפול המוגבר, אבל ההומוגניות של המדגם ניתן להעריך על ידי ביצוע ניתוח היתוך עקום. איור 6 א (משמאל פנל) מציג את ניתוח היתוך העקום של מירנה, ו שיא אחיד מוגדר וברור שניתן לראות. פסגות מרובות יהיו ציינו אם פריימר הוא כמויות ספציפיות או משמעותיות של פריימר-dimer הוא נוצר (איור 6 א, פנל מימין). מבחני DLP מירנה לעומת זאת, הוא יותר ספציפיים כהגברה בלבד של היעד מירנה מזוהה. חלקות הגברה של כל יעד מירנה ניתן לצפות, כפי שהודגמה באיור 6. האפשרות לשליטה להתרחשות של מוצרי הגברה מרובים באמצעות הניתוח עקום התכה היא, עם זאת, אינו זמינה עם הכימיה הזאת ולצבוע Cyanine qPCR הוא פחות יקר. יכולים לפעמים נוצרו מבחני צבע Cyanine וDLP qPCR תוצאות שונות במקצת. עבור שני מבחני qPCR, השוואה לrefeגן לורנס נדרש כדי לקבוע את הביטוי היחסי של גנים בין שתי דגימות. גן ההתייחסות, המכונה גם גן משק, צריך להיות גן שהביטוי שלו הוא לא השתנה, והוא בא לידי ביטוי ברמות דומות לגן של עניין. דוגמא של גן התייחסות מתאים בשורות תאי סרטן השד אלה היא ARHGDIA, התמ"ג-דיסוציאציה מונעי Rho שמתפקד תהליכי חילוף התמ"ג / GTP של חלבוני Rho. כפי שנצפה באיור 6C (למעלה), ברמת ה-mRNA של ARHGDIA אינה משתנית בין הרכב לבין הדגימות שטופלה יגנד. יכול לשמש גם 18S rRNA, אם כי הביטוי הגבוה שלה דורש 1:500 דילול נפרד של מניית cDNA ולכן פחות מתאים. לניתוח מירנה, יש עדיין ויכוח על גן התייחסות מוגדרת היטב. עד כה, snRNA U6 הוא גן התייחסות שמקובל לניתוח מירנה. U6 snRNA הוא RNA ~ הארוך 110 נוקלאוטיד, noncoding הקטן הגרעיני המתפקדים בSPL מראש mRNA הגרעיניהדובדבן 19. כפי שנצפה באיור 6C (בחלק תחתון), רמות ביטוי U6 הן בערך אותו הדבר בכל הדגימות שמוצגים, ובכך מאפשרות לחישובים של הרמות המשתנה של מירנה. ייצוג גרפי של תוצאת מירנה qPCR להשוואה בין כלי הרכב והתאים שטופלו-E2, כי כבר מנורמל U6 ההתייחסות ניתן לראות באיור 6 ד. זה ממחיש מירנה, שאותרו כnonregulated לאחר טיפול E2 24 שעות, אבל שמטפח אתרים מחייב הכרומטין ER הקרובים למיקומו הגנומי, וניתוח סדרת הזמן זיהה רגולציה משמעותית 72 שעות לאחר טיפול.

איור 1
איור 1. סקירה של הגישה מועסקות לצורך זיהוי של רגולציה הורמונלית של מירנה בתאי סרטן השד.

איור 2
איור 2. השוואה בין התכשירים השונים מדגם ומניפולציות חומצות גרעין לכל טכניקת זיהוי מירנה. () Microarray מירנה בשיטת טכנולוגית μParaflo כולל העשרה, poly-עוקב וסימון קשירה. (ב) הכנת מדגם טכנולוגיית DLP ושיטת זיהוי כוללים פריימר סינתזת cDNA כרך המשתרע לאחר שלב denaturation ומספק שבר כבר מחסה הכנת מדגם טכנולוגיית צבע Cyanine לאחור תחל ורצף בדיקה. (C)ושיטה לגילוי כולל עוקב פולי, וסינתזת cDNA עם פריימרים אוליגו-DT כולל רצף אוניברסלי 5 '.

איור 3
איור 3. תרבית תאים ומיצוי RNA. (א) בתאים בתרבית כדי להמחיש 80% confluency צורך לפני טיפול עם ליגנד. (ב) ייצוג גרפי של ריכוז RNA ובטהרה לאחר חילוץ. שיא כל אלו מהווה מדגם ותהליך חילוץ מוצלח מניב RNA הטהור (פנל עליון). RNA חילוץ גרוע לא מראה שיא ספיגה ברור ב260 ננומטר (פנל תחתון).

איור 4
איור 4. & #160; בקרת איכות RNA תוצאות מניתוח שלמות RNA מראה ייצוג גרפי לסולם (למעלה), RNA באיכות טובה (באמצע) ומדגם RNA מושפל (תחתון)..

איור 5
איור 5. איור של תוצאות פרופיל מירנה. (א) ייצוג מפת החום של תוצאות microarray מירנה לmiRNAs הביע באופן דיפרנציאלי. miR-A, B, C הם שהוגברו בטופל מדגם E2 כפי שצוין באדום, ואילו miR-D, E, F, G הם downregulated במדגם שטופל ב-E2 כפי שצוין בירוק. חלקות הגברה (ב) לכל מירנה מתוצאות DLP-LDA. מירנה זוהתה הם מוגברים כפי שצוינו על ידי גידול בשווי Rn.

איור 6 איור 6. ניתוח qPCR של תקנות מירנה. () ניתוח התכה עקום למירנה נותח באמצעות זיהוי צבע Cyanine, מראה ההומוגניות של כל נבדקו הדגימות (משמאל) וההגברה של שברים מרובים (מימין). חלקות (ב ') הגברה עבור כל דגימה עבור מירנה. זה יכול להיות גם מצבע Cyanine או DLP שיטות זיהוי. (ג) ייצוג גרף עמודות של גנים מתאימים התייחסות לmRNA ניתוח ARHGDIA (למעלה) ולU6 מירנה ניתוח snRNA (תחתון), לא מראים ביטוי ההפרש משמעותי בין דגימות. (D) תוצאות מירנה qPCR כדי להמחיש השוואה של רמות ביטוי היחסית של miR-135a מעל כמובן זמן. איור 6 ד 'הודפסה מחדש מKatchy et al. 1 באישור Elsevier. ערכים הם בדרך כלל הממוצע של exper הנפרדiments (כפילויות ביולוגיות) ± SD. מבחן t של הסטודנט משמש כדי להדגים משמעות: * p <0.05.

Discussion

קביעת המנגנון לויסות הורמונלי של מירנה בתאי סרטן השד יכולה לספק פלטפורמה להבנת מחלה זו והוא יכול לספק טיפול פוטנציאלי לסרטן השד. Culturing תאים אלה כדי לספק את התנאים אופטימליים לפעולת הורמון הוא חשוב מאוד. הנה, בפרוטוקול שמבטיח כי ההורמון של עניין (אסטרוגן) לא נכלל לפני הטיפול ושמינון אופטימלי של E2 שימש לזמן מתאים במהלך הטיפול שתואר. השפעות גורם הורמונלי וצמיחה אחרות הוחזקו לכל הפחות על ידי הורדה הדרגתית של הרמות בסרום ובאמצעות DCC-FBS, שהוא FBS שהופשט מרוב ההורמונים שלה, ציטוקינים וגורמי גדילה. תקשורת האדומה ללא פנול שימשה נוסף כדי למזער את השפעות nonhormonal אחרות, בהתחשב בכך שפנול אדום כבר דווח כי פעילות אסטרוגנית ומשפיע על פונקציות מסוימות בשורות תאי 20,21. זמן חשיפה של התאים להורמון הוא בעל חשיבות רבה. לרגולציה הקשורים לאסטרוגן של גנים, זה כבר הראה בעבר כי 24 hrexposure לייצר תגובה משמעותית של גנים המטרה ישירים בתאי סרטן שד 1,18. מאז miRNAs מתועתק על ידי RNA פולימראז II, כמו mRNAs, מתקבל על הדעת שמדוברת בנקודת זמן מתאימה כדי לזהות רגולציה ישירה גם של miRNAs. זה עדיין לא נקבע אם וכיצד miRNAs אלה משפיע על הביטוי של מטרות ER הידועים אלה בתאי סרטן השד.

פרופיל ביטוי מירנה יכול להיות מאתגר בגלל גודלו הקטן יחסית של מירנה, העובדה שניתן למצוא את רצף מירנה בוגר גם בפרי מירנה וטרום מירנה, ובגלל ההטרוגניות בתוכן GC 22. טכניקות אפיון כמה וכימיה של להיות מועסקים על מנת להתגבר על קושי זה. בין אלה גישות שונות של microarray וניתוח qPCR (איור 2) הן. למרות microarray מקובל לאנאלי הגנום כולויסיס, הוא יכול לספק נגטיבים שווא וקיים הבדלים בין הפלטפורמות הזמינות, החל הכימיה לטכנולוגיית הדפסת 23. גם תהליך הנורמליזציה מציג אתגר בניתוח יחסית מעט גנים מירנה, שנספרים באלפים בהשוואה לעשרות אלפי תעתיקי mRNA. qPCR, לעומת זאת, הוא רגיש יותר, והוא טוב יותר מיושם כאשר פחות גנים הם להילקח בחשבון. עם זאת, כאשר היא מבוצעת ב384 גם צלחות גדולות, עם לשכפל טכני אחת בלבד לכל צלחת, צלחות מרובות צריכים להיות מנותחות עבור כל דגימה שהופך את הניתוח יקר. כמו כן, בידיים שלנו, רבות תוצאות שליליות יותר שווא התקבלו באמצעות ניתוח DLP-LDA לעומת microarray. בהתחשב בכך את רצף מירנה בוגר נמצא בפרי, מירנה והרצפים טרום מירנה, זה עניין להבדיל בין תעתיקים אלה באמצעות טכניקות PCR 24. בדיקות DLP זמינות גם ל- miRNAs מראש, וspיכולים גם להיות מתוכננים פריימרים ecific להוציא בוגר או מבשר שונים גרסאות באמצעות טכנולוגיית qPCR צבע Cyanine.

qPCR הוא תקן זהב עבור אימות ביטוי ההפרש מפרופיל תוצאות. היעילות של qPCR, לעומת זאת, תלויה במספר פרמטרים הכוללים מיצוי RNA, שלמות RNA (איכות), סינתזת cDNA, עיצוב פריימר, שיטת זיהוי (כימיה), וגן ההתייחסות לנורמליזציה נתונים 1,22,25. האפשרויות לעיצוב פריימר לניתוח מירנה היא מוגבלות מאוד, שכן אורך רצף מירנה הקצר אינו נותן מקום להרבה עיצוב פריימר חלופי, ורק אחד פריימר ניתן טיפח ברצף קצר זה. לפיכך, הצורך במניפולציות חלופיות כפי שמודגמות באיור 2. משכפל טכני חשוב כדי לאמת את חוסנו של שיטת ההגברה והתהליך המועסק. משכפל ביולוגי נדרש לייצוג של variatio הביולוגי הכלליn, לרבות תגובה משתנה ליגנד טיפול, וכדי להראות שתופעות ראו בתא הן לשחזור. בהתבסס על הניסיון שלנו, שינויים בביטוי מירנה בין תרביות תאים יכולים להתרחש. בדרך כלל ההבדלים האלה הם פחות מ פי 1.3, והממוצע של ערכים וSD המתאימים מזהה את הווריאציה הטבעית וטכנולוגית. וריאציה זו יכולה לנבוע מגורמים שונים, כולל, צפיפות תאים והעובדה שפונקציות תא יכולים להשתנות מקטע לקטע. כדי לזהות ביטויים סטטיסטיים משמעותיים כתוצאה מטיפול ליגנד, משמעות מקובלת היא כאשר p-הערך הוא פחות מ 0.05. הנה, כבר בשימוש על מבחן t של סטודנט על משכפל הביולוגי וטכני באמצעות ההפצה שני זנב ופרמטרים שונות שאינם שווים שני מדגם. פרמטרים מבחן t אחרים קיימים, והבחירה תלויה בהתקנה הניסיונית 26.

פרוטוקול מפורט בהערכת תקנות ההורמונלית של הבוגר miRNA בתאי סרטן שד כבר סיפק. וטכנולוגיות חשובות כימיה באפיון ואימות של ביטויי מירנה אלה הוסברו באופן ברור. הטכנולוגיה שנבחרה למחקרים של מירנה בתאי סרטן השד תלויה בסופו של דבר מה בדיוק נחקר.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר Xiaolian גאו, אוניברסיטת יוסטון, למתן ייעוץ לפלטפורמת microarray LC מדעי מירנה, ד"ר קארין Edvardsson, מכון קרולינסקה, שוודיה, וד"ר Eylem איידוגדו, אוניברסיטת יוסטון, לשיתוף המומחיות של מירנה . מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס R01CA172437. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים מהקרן מתעוררים טקסס הטכנולוגיה, על פי הסכם שלא. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128, (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23, (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40, (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4, (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83, (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17, (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10, (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7, (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37, (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27, (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1, (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12, (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57, (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).
פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter