Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

doi: 10.3791/51285 Published: February 21, 2014

Summary

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Abstract

Östrojen meme bezi gelişimi ve meme kanseri ilerlemesinde önemli rol oynar. Bu bağlanarak ve östrojen reseptörleri (ER), ERα ve ERβ aktive ederek işlevini aracılık eder. ERα sık meme kanserinde yukarı-regüle ve meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını tahrik eder. ER transkripsiyon faktörleri olarak işlev gören ve gen ekspresyonunu düzenler. Protein kodlayan genlerin ERα en düzenleme köklü Oysa, MicroRNA (miRNA) noncoding onun düzenlenmesi az araştırılmıştır. miRNA'ların kendi çeviri inhibe ya da mRNA yıkımı, genlerin transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. miRNA'ların onkogen veya tümör baskılayıcı olarak işlev görebilir ve aynı zamanda biomarkerlerin umut vericidir. Mevcut miRNA deneyleri arasında, mikroarray ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yaygın miRNA seviyelerini belirlemek ve ölçmek için kullanılmıştır. Göğüs kanseri, th östrojen sinyal düzenlenir miRNA'lar tanımlamakERα pozitif meme kanseri hücre hatlarında EIR ekspresyonu karşılaştırıldı önce ve sonra problar düşük yoğunluklu diziler Etiketli μParaflo-mikroakışkan mikrodizileri ve çift her ikisini de kullanarak bir östrojen aktivasyonu. Sonuçlar Sondalar-tabanlı kimya Etiketli Siyanin boya bazlı ve Dual ikisini de uygulayarak, belirli qPCR deneyleri kullanılarak valide edildi. Bundan başka, bir zaman noktası deney zamanla düzenlemeleri tespit etmek için kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan miRNA deney yaklaşımının avantajları daha da sınırlı miktarda numune ile, çok sayıda numune olgun miRNA düzenlemelerin hızlı bir tarama kılmasıdır. Özel hücre kültürü için koşulları ve östrojen tedavisi, biyolojik ve teknik çoğaltır ve büyük ölçekli tarama dahil olmak üzere düzeni, ayrı teknikleri kullanılarak derinlemesine onaylarını takiben, miRNA düzenlemelerin sağlam tespitini sağlamaktadır ve yanlış pozitif ve diğer eserler ortadan kaldırır. Birincil ve öncü transkript leve Ancak, mutasyona uğramış veya bilinmeyen miRNA'ların, veya yönetmeliklerl, tespit edilmez. Burada sunulan yöntem estrojen aracılı miRNA düzenlemenin ayrıntılı bir soruşturma temsil eder.

Introduction

Östrojen meme bezi gelişimi sırasında önemli bir hormondur. Östrojen, ayrıca, meme kanseri 1 geliştirilmesi, bakım, risk ve tedavisinde önemli bir rol oynar. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan ve belirli bir hedef genleri düzenleyen Erler, bağlanarak fonksiyonunu uygular. İki reseptör türevleri arasında, ERα meme kanseri hücrelerinin östrojen bağımlı çoğalması için gereklidir. En çok meme kanserleri ERα-pozitif ve büyüme için östrojen bağlıdır. Bu estrojen sinyal yapılan ve hormon-reseptör pozitif göğüs kanserinin tedavisi için bir hedef ERα gelmiştir. ERα yatan mekanizmayı anlamak, tedavi sonuçlarını iyileştirmek tedaviye direnci aşmak ve meme kanseri nasıl gelişeceğini anlamak önemlidir.

miRNA'ların nedeniyle transkripsiyon sonrası gen düzenlenmesinde bunların büyük etkisi hücre fonksiyonları kritik rol oynamaktadır. miRNA'ların 19-24 nükleotid kısa, tek iplikliİlk birincil miRNA transkript (pri-miRNA) içine RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu noncoding RNA. Bunlar, kısa saç tokası ön-miRNAs (ön miRNA) içine drosha ile çekirdekte işlenir ve daha sonra Dicer ile işlenir ve sitoplazmada olgun miRNA'lar oluşturulması için tek lifler halinde ayrılır. Tek şeritli olgun miRNAs RISC kompleks oluşturmak için proteinlerin Argonaute aktarılır. Daha sonra, miRNAs çeviri bloke veya hedef mRNA 2 ayrıştırmaları transkripsiyon sonrası düzenleme için önemli bir hedef mRNA'nın 3'-tercüme edilmemiş bölgeleri (3'-UTR) hibridize olabilir.

Nedeniyle östrojen ve miRNA'ların hem normal veya bozulmuş östrojen sinyalizasyon ile ilgili miRNA'lar belirlenmesi, tümör gelişiminde oynadığı önemli role kalkınma anlayışımızı geliştirmek ve meme kanseri tedavisini geliştirmek için önemlidir. ERα protein kodlama genleri düzenleyen nasıl iyi bir anlayış, uzantısı olsave RNA düzenlemeler noncoding detayları iyice araştırılması gerekmektedir. Meme kanseri hücre hatlarında miRNA ERα düzenleme aydınlatmak amaçlayan ilk çalışmalar, aynı hücre çizgisi 3-6 analiz edilmiş olsa bile, çelişkili sonuçlar vermiştir. Bu değişen tedaviler, biyolojik varyasyonlar, farklı tekniklerin kullanımı ve miRNA'ların küçük boyutlu analiz onları zor hale gerçeğinin bir sonucu olabilir. Burada, varyasyonlar ve yöntem eserler için denetleyen bir protokol tarif edilir.

MiRNAs Östrojen tarafindan düzenlenen belirlemek için, ERα aktivitesinin iyi tanımlanmış bir meme kanseri modeli profil bir ilk adımdır. Çeşitli hücre çizgileri klinik göğüs kanserlerinin çoğunda benzer östrojen bağımlı insan ERα-pozitif göğüs kanseri tümörlerinin, elde edilmiştir. ERα ve alt hedefin ekspresyonu dahil olmak üzere bu hücre hatları iki, T47D ve MCF7, moleküler özellikleri,progesteron hormon reseptörü (PR), estrojen-duyarlı ve lümen-epitelial farklılaşma genlerin sentezlenmesi ile birlikte zar reseptör HER2 ifade eksikliği, göğüs tümörlerinin 7-10 luminal alt tipi için model olarak kullanılabilir olmasını sağlar. 17β-estradiol (E2) östrojen baskın şeklidir ve ERα optimal transkripsiyonel aktivasyonu için konsantrasyonları ve zaman noktaları çok çalışmalarda karakterize edilmiştir. 24 saat boyunca bu protokol, 10 nM E2 tedavisinde, göğüs kanseri hücrelerinin 1 ERα aktivitesi için model olarak kullanılmış ve T47D ve MCF7 edilir. Buna ek olarak, zaman-bağımlı miRNA düzenlemeler, özellikle örneğin 1-72 saatlik bir zaman aralığı içinde analiz edilebilir.

İkincisi, analiz miRNA nedeniyle kısa boyutlarda kısmen, ayrı zorlukları vardır. Düzenli Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA çökeltmeler yapılan veya zaman zaman miRNA'ların sıra toplam RNA hazırlık korunmaz standard sütun saflaştırma kullanılır. Özel önlemler korumak veya RNA'lar küçük kısmıyla zenginleştirmek için alınması gerekir. Santrifüj (-80 ° C) önce sıcaklığının düşürülmesi, izopropanol hacminin artırılması ve% 70 etanol içinde yıkama vermemek suretiyle, miRNA'ların tutma çökeltme sırasında artırılabilir. Ya da, miRNA içeren toplam RNA, yüksek kaliteli ve sağlam hazırlanması için özel bir sütun ve tamponlar da kullanılabilir. Ayrıca analizinin kendisi için, kendi kısa boyutları zorluklar yaratır. Mikroarrayler, qPCR, ve yeni nesil dizileme: genom miRNA taraması için, üç ortak seçim teknikleri profil miRNA vardır. Her teknik eserler tanıtılması farklı riskleri ile her biri, çok sayıda değişik platformlar kullanarak gerçekleştirilebilir ve farklı örnek preparatları gerekmektedir. MiRNA mikroarray, bir slayt benekli veya oligonükleotidlerden binlerce sentezlenir. Bu oligonükleotidler prob olarak kullanılır ve her bir probs, belirli bir miRNA sekansına hibridize için tasarlanmıştır. Bu çalışmada yapılan gibi mikrodizilerde numune hazırlama, ilk miRNAs için zenginleştirir ve daha sonra miRNAs üzerine Cy5 ve Cy3 etiketleme tanıttı. Mikrodizi, aynı zamanda bir gen çok sayıda göreceli ekspresyon seviyelerini gözlemek için fırsat verir, hızlı ve örneklerin çok sayıda taranması için uygundur, fakat sadece mikrodizi üzerindeki diziler mevcut analiz edebilir ve örneğin değişiklikleri algılamaz bilinmeyen veya mutasyona uğramış miRNA'ların. Bu protokolde olduğu gibi gerçekleştirilir Mikro-dizi analizi, aynı zamanda analiz için bir örnek için toplam RNA, nispeten büyük miktarlarda, yaklaşık 5 ug gerektirir. Düşük yoğunluklu QPCR miRNA profil daha az malzeme (700 ng / numune ve çoğaltmak) gerektirir ve miRNA'ların saptanması ve nicelenmesi için izin verir. Transkript seviyeleri tespit edilebilir, ve bir miktar mutlak miktarı veya göreceli bir miktar olabilir. QPCR analizi, ilk olarak bir ilmek kullanarak burada, CDNA'ya miRNA dönüştürülmesini gerektirirsadece miRNA olgun analizini sağlayarak her özel miRNA için primer. Bu, miRNA spesifik ileri primeri ve ilmekli dizisine tamamlayıcı olan bir evrensel ters primeri kullanılarak amplifiye edilebilir uzun bir şablon oluşturur ve özgüllük için bir çift etiketli Probe dahil liman olabilir. QPCR miRNAs yüzlerce her bir oyuk 11 içinde ayrı ayrı primer çiftleri ile bir ya da 384-kuyucuklu plakalar kullanılarak paralel olarak tespit edilebilir bir düşük yoğunluklu bir biçimde kullanılabilir. , Bir örnekteki tüm RNA 11 dizilebilir gibi gelecek nesil dizileme, diğer yandan, roman, mutasyona uğramış veya düzenlenmiş miRNA'ların keşfedilmesine olanak sağlar, bu tekniklerin sadece. Bu teknik, bununla birlikte, küçük RNA'ların zenginleştirmek ve numuneler arasında göreli ekspresyon seviyelerini modüle edilmesi için geliştirilmiş daha sonra riskleri ile bağlayıcı ligasyonu ve saflandırma çeşitli adımlar kullanılarak küçük bir RNA bir kütüphane üretilmesi için birden fazla aşama gerektirir. Aynı zamanda, önemli ölçüde bioinformati gerektirircs analizi. MiRNA profilleme için çeşitli teknikler göz önüne alındığında, en uygun tekniği uygulamalarına bağlıdır. Malzeme oldukça bol ve faiz zaten bilinen miRNA'ların diferansiyel ifadeyi tanımlamak için zaman Mikrodiziler en uygundur. Örnek sınırlı bir miktarda mevcuttur ve düşük ifade miRNAs yüksek bir hassasiyet gerektiği zaman düşük yoğunluklu QPCR diziler en uygun olanlardır. Dizi, mutasyona uğramış bilinmeyen miRNAs veya miRNA farklı izoformlarının analizi gerekli olduğunda en uygundur.

Göğüs kanseri östrojen düzenlenmiş miRNA'ların çalışmada iki modeli hücre hatları, RNA'nın büyük miktarlarda kolaylıkla temin edilebilir T47D ve MCF7, kullanılır. Her bir hücre hattı bir tedaviye teknik tekrardan değişik yollarını, her kullanılarak yinelenmiş hücre kültürlerinde incelenmiştir. Bu tekrarlanabilir, ERα düzenlenmiş miRNA'ların sağlam tespiti için izin verir. Bağıl miRNA ifade seviyeleri miRNA mikrodizisi ve her ikisini de kullanarak karşılaştırıldıÇift etiketli problar - düşük yoğunluklu diziler (DLP-LDA) ve siyanin boyası ve DLP kimyasallar her ikisini de kullanarak belirli QPCR ile sonuçları teyit etti. miRNA düzenlemeler daha sonra östrojen kaynaklı düzenlemelerin rastgele veya sirkadiyen varyasyonlarını ayırt yardımcı ve ikincil etkilerinden birincil etkilerini gösterebilir zamanla onların tam düzenleme, tanımlamak için zaman serisi analiz edildi. ERα kromatin-bağlanma çalışmaları ile Biyoinformatik karşılaştırmalar ikincil etkilerin karşı birincil ayrımında yardım daha fazla olabilir. Tahlil, 24 saat tedavi E2 protein-kodlayan transkriptleri sonra kolaylıkla düzenlenir, ancak olgun miRNAs 1 etkilenmediği kurulamadığı MiRNA düzenlemeler güvenilir bir değerlendirme ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, seçilen miRNAs 1'in zaman serisi analizinde gösterildiği gibi miRNAs, daha sonraki zaman noktalarında düzenlenir mümkündür. Detayları ek araştırılması gerekir ve burada sunulan protokol Robus sağlarmeme kanseri hücre hatlarında olgun miRNA'ların hormonal regülasyonu incelemek için t yolu.

Protocol

1.. Hücre kültür ortamının hazırlanması

  1. 47D hücre hattı kültürü ortamı için:
    1. Bir otoklav 1 L şişe içinde 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] ile 500 ml Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) karıştırın.
    2. Fetal sığır serumu, 50 ml (bu% 5 FBS) yapar, ve daha sonra penisilin streptomisin, 10 ml (% 1 bu PEST yapar) eklenir. Tamamen içeriği karıştırın.
    3. 4 ° C'de saklayın
  2. MCf7 hücre hattı kültürü ortamı için:
    1. 25 FBS (% 5 FBS) içinde ml ve daha sonra 5 penisilin streptomisin (% 1 PEST) ml ile 500 ml DMEM karıştırın.
    2. 4 ° C'de saklayın
    3. Indirgenmiş serum kültür ortamı için:
      1. T47D için: Bir otoklav 1 L şişe içinde 500 ml F12 (1:1) ile 500 ml kırmızı fenol içermeyen DMEM karıştırılmakta ve% 5 DCC-FBS için dekstran ile kaplanmış mangal kömürü ile muamele edilmiş (DCC) FBS, 50 ml. % 0.5 DCC-FBS boyunca 5 ml DCC-FBS ile ayrı bir şişe yapın. Sonra, her bir şişe için PEST (% 1 PEST) 10 ml ekleyin. Tamamen içeriği Mix, stor4 ° C'de e
      2. MCF7 için: 100x L-glutamin, 5 ml (200 mM nihai konsantrasyon) ile birlikte 500 ml kırmızı fenol içermeyen DMEM karıştırın. DCC-FBS (% 5 DCC-FBS) içinde 25 ml ilave edilir. 2.5 ml DCC-FBS (% 0.5 DCC-FBS) içeren ayrı bir şişe yapın. Sonra, her şişeye PEST (% 1 PEST) 5 ml. 4 ° C 'de, tamamen mağaza içeriği karıştırın
    4. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi için:
      1. Saf su veya distile su ile 1 L Otoklavlanmış cam şişeye doldurun.
      2. Bir PBS tablet ekleyin ve tablet eriyinceye kadar ara sıra sallayın.
      3. Oda sıcaklığında PBS çözüm ve mağaza otoklavlayın.
    5. Ligand stoklarının hazırlanması:
      1. Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 100 | il etanol ya da DMSO içerisinde 17β-estradiol 2.72 mg eriterek E2'nin bir 100 mM stok çözelti hazırlayın ve içeriği yavaşça karıştırın. Kısaca Spin ve 10 mM, 1 mM ve 0.1 mM stok concentr elde etmek üzere seri seyreltmeleri (1:10) yapmakçözücü kullanılarak maktadır. -20 ° C'de tüm E2 stok çözümleri Mağaza
      2. Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 100 ul, EtOH ya da DMSO içinde ICI 182780 içinde 6.07 mg eriterek ICI bir 100 mM stok çözelti hazırlayın ve içeriği yavaşça karıştırın. Kısaca Spin ve 10 mM, 1 mM, çözücü kullanılarak 0.1 mM stok konsantrasyonları elde etmek için seri seyreltmeleri (1:10) olun. -20 ° C'de tüm ICI stok çözümleri Mağaza
      3. Araç, çözücü (etanol ya da DMSO) 'dir. -20 ° C'de steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve mağazada% 100 etanol veya DMSO 0.5-1 ml Sıra

2. Hücre Kültürü ve Tedavi

Teknik çoğaltır için çift veya üçlü plakalar her tedavi gerçekleştirin. Bu hücre hattı, bir biyolojik tekrarında olarak hizmet edecek, aynı hücre hattı, farklı bir geçiş kullanılarak hücre kültürü işlemi ve tedavi tekrarlayın. Repl için farklı bir hücre soyu ile in prosedürü tekrarlayınbirden fazla hücre hattı bulguları TARĐHĐ BELGE. Tüm hücre kültürü teknikleri, bir laminar akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.

  1. Hücre kültürü başlangıç
    1. Steril bir ılık su banyosu içerisinde 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.
    2. T47D ve MCF7 hücreleri donmuş şişe çözülme.
    3. % 70 etanol ile bir şişe ve medya şişenin dış temizleyin ve sonra da steril bir laminer akış başlığı içinde şişe ve şişe hem de koyun.
    4. (Kaput) göre steril bir T-75 şişesi etiketleyin.
    5. (Ki yüzeyi tamamen medya ile kaplı olduğundan emin olun) steril bir serolojik pipet kullanarak balona uygun ortam 12-15 ml ekleyin.
    6. Şişeye şişesinden hücreleri aktarın ve hafifçe karıştırın.
    7. % 5 CO2 ile birlikte 37 ° C inkübatör içinde bir şişe yerleştirin.
  2. Tedavi için hücrelerin hazırlanması
    1. Kuluçka hücreleri almak ve hücrelerin en az% 80 ortak olmasını sağlamak için bir mikroskop altında gözlemlemeknfluent. Bu deneme için yeterli hücre olduğu sağlamaktır. Steril kaput şişeyi aktarın.
    2. Bir vakuma bağlı steril bir Pasteur pipeti kullanılarak şişeden ortamı çıkarın. Nazikçe PBS ile iki kez bağlı hücreleri yıkayın.
    3. Şişeye sıcak tripsin-EDTA 1 ml ilave edilir ve 2 dakika boyunca inkübatör şişe yerleştirin. Bu, hücreler şişeden ayırmak yapmaktır.
    4. Şişeye yaklaşık 3-4 ml uygun bir sıcak ortam ilave edin ve 5 ml'lik bir pipet kullanılarak, serolojik müstakil hücreleri çiğnemek. Serolojik pipet hücreleri alınarak ve basıncı arttırmak için şişenin tabanına karşı yerleştirilen pipet ucu ile hücreleri bırakarak öğütün. Bu tek hücrelere ayrı hücreleri kırmak için.
    5. Üreticinin protokolüne göre, bir hücre sayacı kullanılarak hücreleri, örneğin, say.
    6. (Gerektiği kadar), 100 mm tabak etiketleyin ve plakalar, yaklaşık 10 ml ortam ekleyin. Tabak yaklaşık 2.0 x 10 6 hücre / levha. Ge hücreleri Dağıtntle plakaları dönen.
    7. Yaklaşık% 80 oranında birleşene dek, 24-48 saat boyunca inkübe hücreleri.
    8. % 80 Akışların birleştiği yerde, hücreler PBS ile iki kez yıkama ve uygun bir% 5 DCC-FBS ortamı eklenir. Daha sonra, 24 saat boyunca hücrelerin inkübe edin.
    9. 24 saat sonra, hücreler iki kez PBS ile yıkayın ve uygun bir% 0.5 DCC-FBS ortamı eklenir. Daha sonra, ilave 48 saat daha hücrelerin inkübe edin.
  3. Hücre tedavisi
    1. 48 saat sonra, hücreler iki kez PBS ile yıkayın. Mümkün olduğunca PBS kadar kaldırın emin olun.
    2. 15 ml konik bir tüp içinde, uygun% 0.5 DCC-FBS ortamı 10 ml ekleyin. Daha sonra, 10 nM'lik bir nihai konsantrasyonu için 0.1 mM stok ligand (E2 veya ICI) 1 ul ekle. Ayrıca, kontrol deney için ayrı bir tüp içinde 10 ml ortama aracın 1 ul ekle.
    3. Hafifçe tüpün içerikleri karıştırılır ve plaka hücrelere ilave edin. Bu plaka başına bir ligand olması gerekir.
    4. Seçilen bir zaman noktasında (0-72 saat) boyunca hücreleri inkübe edin.
<p class = "jove_title"> 3. RNA Ekstraksiyonu ve Kalite Kontrol

  1. RNA ekstraksiyonu
    1. Tedavi istenen zaman süresi için tamamlandıktan sonra, plaka içindeki hücrelere yaklaşık 1-2 ml guanidinyum tiosianat-fenol çözeltisi ekleyin, sonra hücreler PBS ile iki kez yıkayın. DİKKAT: Guanidinium tiyosiyanat-fenol çözüm Teneffüs edilmesi, cilde veya göze temas yoluyla toksik, ya da yutulduğunda. Uygun koruyucu giysi, eldiven ve göz / yüz koruması takın, ve davlumbaz kullanın.
    2. Hücre hacmi Guanidinium tiyosiyanat-fenol solüsyonun hacminin en fazla 10%, ve plaka çözeltisi ile kaplandı ve 1 dakika boyunca oturmasına izin olduğundan emin olun. Sonra, bir lastik kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreler hafta içinde -80 ° C de, bu çözelti içinde saklanabilir.
    3. Özü ve spin kolon saflaştırma ve DNase ardından guadinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform yöntemi kullanılarak her bir tedavi gelen toplam RNA'yı saflaştırmakHayvan hücreleri için bir DNA degradasyon yöntemi.
    4. Ekstraksiyon işleminden sonra, hücreler, 60 ul RNase-içermeyen su içinde elüt edilmiştir. -80 ° C'de miktar analizi ve saklamak için RNA kısım 1-2 ul RNA
    5. RNA ve aspectrophotometer 1 ul kullanılarak RNA konsantrasyonları ölçülür. Herhangi bir ölçüm yapılmadan önce alınan bir boş olduğundan emin olun. Ayrıca, tamamen bir ölçü alınır spektrofotometre ulaşmak zaman silin. Konsantrasyonlar genellikle ng / ul 'de gösterilmiştir. RNA konsantrasyonlarını gösteren sonuçları kaydedin.
  2. RNA kalite kontrol
    1. Bir mikrosantrifüj tüpü içinde, her numune ve yeri, yaklaşık 100 ng RNA al.
    2. Bir Bioanalyzer kullanılarak RNA bütünlüğü ölçün. Genellikle 12 örnekleri Bioanalyzer bir anda çalıştırabilirsiniz. Run genellikle yaklaşık 25 dakika sürer.
    3. RNA deney için iyi olduğundan emin olmak için RNA merdiveni ile sonuçları karşılaştırın. Kaydedin ve baskı sonuçları.

4. Treat Onayment: Protein kodlama Genlerin QPCR

  1. cDNA sentezi
    1. (Her bir numunenin), toplam RNA 500 ng ya da 1 ug alın ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne konur. Up RNAse içermeyen su kullanılarak 10 ul her bir tüpün hacmi getirin.
    2. 10 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar 50 uM gelişigüzel heksamer primerleri ve ısı boruları 2 ul ekle.
    3. 5 dakika boyunca buz tüpler aktarın.
    4. Her numune için, 5x birinci zincir tamponu 4 ul, 0.1 M DTT 1 ul 10 mM dNTPs ve 1 ul üst simge III 0.5 ul ve 1.5 ul RNase içermeyen su ekleyin.
    5. 10 dakika için bir 25 ° C ısıtma bloğu ya da su banyosu içerisinde yer boruları.
    6. 1 saat için bir 46 ° C ısıtma bloğu transfer boruları. Daha sonra, 15 dakika süre ile, 70 ° C ısı transferi tüpleri bloğuna reaksiyonu durdurmak için.
    7. -20 ° C'de dilüsyonları ve saklamak için RNase içermeyen su ile (toplam RNA giriş kullanılarak hesaplanmıştır), 5 ng / ml stok cDNA seyreltin
  2. QPCR
    1. Faiz ve referans genlerin genler için primerler edinin. Primerler kolayca NCBI BLAST programı Primer-12 primer tasarımı aracı kullanılarak tasarlanabilir. Bu genellikle ilgi her gen için bir ileri ve geri primer oluşturur. Primerler uzunlukta 18-22 bp olması gerekir, 52-58 ° C arasında bir erime sıcaklığına sahip% 40-60 bir GC muhtevasına sahip, ve 100-180 bp'lik bir amplikon uzunluğu.
    2. Her QPCR reaksiyonu için de, cDNA ng (aşama 4.1.7 ikinci stok konsantrasyonu 2 ul), her biri ileri 1 pmol 10 ekleyin ve (aşama 4.2.1), ilgi konusu genin geri primerler ve 5 ul of 2x Siyanin boya PCR master mix. Her bir oyuk için 10 ul bir reaksiyon, son reaksiyon hacmi olması gerekir.
    3. (Teknik kopyalar için), her gen için, her numune için üç kopya halindeki gözlerin olmadığından emin olun. 96 oyuklu bir tepkime levhası kullanılabilir.
    4. Mah-PCR sistemi yazılımı, muhabir ve hedef atamak reaksiyon hacmi girin, karşılaştırmalı seçineşik döngüsü (ΔΔCt) yöntemi ve numune kuyuları tanımlar.
    5. Belirli bir fragmanın amplifikasyonu teyit etmek için siyanin boyası çalışmaları için erime eğrisi analizi gerçekleştirmek için emin olun. Çalıştırmak için varsayılan ayarları kullanarak plakayı.
    6. Çalıştırdıktan sonra sonuçları ve ihracat verileri (MS Excel özellikle CT değerleri) kaydedin.
  3. ΔΔCT formül kullanılarak QPCR veri analizi
    Göreceli mRNA ifadesinde değişiklik, aşağıdaki adımları kullanarak her bir numune için Excel üzerinde kontrol etmek için kat değişim göreceli olarak hesaplanabilir:
    1. Yukarıdaki QPCR tüm ihraç sonuçlar Ct değerleri dahil olmalıdır. Aşağıdaki formül kullanılarak ACt değerini hesaplayın:
      • ACt = CT (hedef gen) - CT (referans gen)
      Bu, her bir numune için yapılmalıdır. Hedef, ilgi konusu geni ya da miRNA olduğunu.
    2. Daha sonra, her bir örnek için toplam standart sapma (SD) hesaplar. İlk hesaplareferans gen için ve daha sonra hedef genin (bu CT değerleri üzerinde STD DEV işlevini kullanarak excel yapılabilir) için SD hesaplamak SD. Daha sonra bu formül kullanılarak her numune için toplam SD hesaplanır:
      • Toplam SS = (SD2 (hedef) + SD2 (referans)) 1/2
    3. Bir gen (hedef) içinde her bir numunenin ΔΔCT hesaplayın:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (tedavi / test örneği) - ΔΔCT (kontrol / kalibratör numune)
      Kalibratör örnek muamele edilmemiş örnek.
    4. Son olarak, formülü kullanarak her bir numunenin kat-değişimi (FC) değerlerini hesaplamak:
      • FC = 2-ΔΔCT
      Her numunenin kat-değişimi değeri referans geni ve kontrol numunesine normalize edilmiş gen / miRNA göreceli ifade verir.
    5. Student t-testi, iki kuyruklu dağılımı ve iki örnek eşitsiz varyans analizi kullanılarak istatistiksel analiz için kullanılabilirÖzellikler: (P <0.001 (***), p <0.01 (**), ve P <0.05 (*)). Bu Excel elde edilebilir. Tedavi miRNA profilleme ile geçmeden önce bilinen hedeflerin düzenlenmesinde sonuçlandı onaylayın.

5. miRNA profil Analizi

  1. miRNA mikroarray
    1. , Bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir araç ya da bir ligand ve bir yer ile muamele edilen hücrelerden izole edilmiş RNA 5 ug al. 20 ul tüp içinde ses seviyesini ayarlayın. Her karşılaştırma çiftleri ya da üç kopya halinde yapılmalıdır.
    2. Yukarıdaki RNA örnekleri kullanılarak miRNA mikrodizisinin yapın. miRNA mikroarray ifade profilleri μParaflo mikroakışkan Biochip Teknoloji insan miRNA mikroarray çift renk numune dizi (Sanger miRBase Release 14.0) 13 kullanılarak tespit edilmelidir.
    3. Sonuçlar farklı şekilde ifade miRNA'lar göstermelidir. P <0.05, p değeri <0.10 daha da işbirliği için kabul edilebilir zaman önemli miRNA ifadeler düşününQPCR kullanılarak nfirmatory analizi. QPCR ile daha fazla doğrulama için bu miRNA listesini kaydetmek.
  2. miRNA profilleme: DLP-LDA
    1. Her örnek çiftleri ya da üçlü olarak analiz edilmelidir. Araç veya ligand ile tedavi hücrelerden toplam RNA'nın 700 ng alın ve bir mikrosantrifüj tüpü içinde yer. 3 ul tüp içinde ses seviyesini ayarlayın.
    2. Çift etiketli sondalar miRNA tahlil yöntemi ve 10x RT primerleri kullanılarak cDNA sentezi yapın. Her reaksiyon için toplam hacim 7.5 ul olmalıdır.
    3. PCR termosikler sistem reaksiyon tüpü yerleştirin ve çift etiketli sondalar MiRNA deney yönteminde belirtildiği gibi önerilen parametrelere ayarlayın. Çalışma başlatmak. Bu cDNA üretecektir. CDNA, en az 1 hafta -20 ° C'de saklanabilir unutmayın.
    4. RT reaksiyon çalışırken, DLP-LDA plakalar ve oda sıcaklığında bekletin. Her dizi plaka benzersiz miRNA astar ve kontrol primerleri içeren 384 kuyu içerir.
    5. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 6 (5.2.3 'dan itibaren) cDNA'nın ul ve yerini al. Çift Etiketli sondalar 2x Universal PCR Master mix 450 ul ekleyin ve 444 ul RNaz ücretsiz su ekleyin.
    6. Içeriğini ve santrifüj kısaca karıştırmak tüpü yaklaşık altı kez ters.
    7. DLP-LDA plaka sekiz her biri içine, oda sıcaklığına, yük 100 ul ulaştığı zaman plakanın 'noktası Dolgu'. Ardından, dizi plaka santrifüj.
    8. Mah-PCR sistemi açın ve blok olduğunu kontrol etmeleri 384 plaka için. SDS yazılımı kullanarak çalıştırmak kurmak. Nispi miktarını (Ct) seçmek, iyi sayı ve dizi türünü seçin, ve kuyu tanımlamak için örnek açıklama girin.
    9. Varsayılan termal döngü koşulları kullanılarak dizi çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, MS Excel sonuçlarını ve ihracat kaydetmek ve ΔΔCT formülü (adım 4.3) kullanılarak daha fazla analiz için kaydedin.

6. Ayrı kullanarak miRNA Yönetmeliğinin OnayıQPCR Analizi

  1. Siyanin boyası QPCR analizi
    1. İstenen MiRNA analizi için primerler dizayn. Ileri primer eşittir olgun miRNA, sırası, 14, mirbase.org elde edilebilir. 'T' Tüm 'U' dönüştürün.
    2. CDNA hazırlayın: 1.5 ml santrifüj tüpüne total RNA ve yer 1 ug al. PolyA bir miRNA ilk iplikçik cDNA Sentezi ve Mah-PCR protokolü atık ve miRNA ilk iplikçik cDNA sentezi için yönergeleri izleyin. -20 ° C'de, elde edilen cDNA (1:10) ve mağaza seyreltin
    3. Bir 96-yuvalı plaka reaksiyon elde edilir.
    4. Her MiRNA QPCR reaksiyonu için de, ikinci aşama 6.1.2 kit (16 ng poli A cDNA (aşama 6.1.2 dan), (aşama 6.1.1) spesifik ileri primeri her birinin 2 pmol ve evrensel astar eklemek ) ve 2x qPCR ana karışımı 5 ul. Nihai reaksiyon hacmi 10 ul / iyi.
    5. (Teknik çoğaltır için) Her miRNA için her numune için üç nüsha kuyu olmadığından emin olun. AyrıcaBir referans gen (genellikle U6 snRNa) dahil olduğundan emin olun.
    6. Mah-PCR sistemi yazılımı, muhabir ve hedef atamak reaksiyon hacmi girin, karşılaştırmalı eşik döngüsü (ΔΔCT) yöntemi seçin, ve numune kuyuları tanımlar.
    7. Çalıştırmak için varsayılan ayarları kullanarak plakayı. Tüm Siyanin boya çalışmaları için erime eğrisi analizi gerçekleştirmek için emin olun. Her bir erime eğrisi, belirli bir fragmanın amplifikasyonu onaylamak için, yalnızca belirli bir tepe göstermelidir. Birden fazla tepe ya da açık bir tepe gözlenirse, primerler, spesifik değildir ve veri kullanılamaz.
    8. Çalıştırdıktan sonra sonuçları ve ihracat verileri (MS Excel özellikle CT değerleri) kaydedin.
  2. Çift etiketli problar QPCR analizi
    1. 0.2 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 5 ul hacminde ve yerine her bir toplam RNA, 10 ng, her al.
    2. Çift Etiketli sondalar Micro kullanarak ters transkripsiyon (RT) yapılması hakkında protokol yönergeleri izleyinRNA Reverse Transcriptase Kit 15. Her toplam reaksiyon hacmi 15 ul olmalıdır. Çift etiketli sondalar RT reaksiyonlar için, üzerinde çalışılacak her miRNA için özel primerler olduğuna dikkat edin.
    3. Reaksiyon, bir yer PCR sistemi PCR tüp ve protokolüne göre parametrelerini ayarlamak yukarıda adım 6.2.2 belirtildiği gibidir. Çalışma başlatmak. Yaklaşık 70-80 dakika sürer.
    4. RT reaksiyonu sonra, 1:05 oranında seyreltilmiş örnek cDNA ve -20 ° C'de karanlıkta tüm cDNA depolamak
    5. Bir 96-yuvalı plaka reaksiyon elde edilir.
    6. Çift etiketli Sondalar 10 ul 2x Universal PCR Master Mix (adım 5.2.5 aynı reaktifi), RNase-içermeyen su içinde 7,67 ul 20 x gerçek zamanlı deney primerden 1 ul: Her MiRNA QPCR reaksiyonu için de aşağıdakileri ekleyin (Her biri özel miRNA) ve yukarıdaki adım 6.2.4 cDNA 1.33 ul. Bu, 20 ul son reaksiyon hacmi olması gerekir. Nazikçe içeriği karıştırın ve santrifüj kısaca.
    7. Bu th sağlamakere (teknik kopyalar için) her bir miRNA için, her numune için üç kopya halindeki gözlerin bulunmaktadır. Ayrıca, bir referans gen (genellikle U6 snRNa) dahil olduğundan emin olun.
    8. Mah-PCR sistemi yazılımı, her bir ilgi miRNA (hedef) için muhabiri (FAM) ve söndürücü (NFQ-MGB) atamak reaksiyon hacmini girin, karşılaştırmalı eşik döngüsü (ΔΔCt) yöntemi seçin, ve numune kuyuları tanımlar.
    9. Çift Etiketli sondalar mıkroRNA tahlil protokolü çalıştırmak qPCR parametrelerini ayarlamak için yönergeleri izleyin. Daha sonra, çalışma başlatmak. Çalıştırdıktan sonra sonuçları ve ihracat verileri (MS Excel özellikle CT değerleri) kaydedin.

Representative Results

Bu yaklaşımın bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir ve çeşitli numune hazırlama ve her tekniği için gerekli olan nükleik asit modifikasyonları bir karşılaştırması Şekil 2'de görüntülenmiştir.

Bir hormon ile tedavi öncesi hücrelerin durumu ve ortam hormon 16 gerçek etkisini belirlemede önemlidir. Bazı orta ve serum sonuçlarını etkileyebilecek büyüme faktörleri içerir, bu nedenle hücreler tüm hormonal etkileri minimuma indirilmiş olmasını sağlamak için açlıktan serum vardır. E2 ile muamele Bu yüzden, gözlenen etkileri E2-ilişkili olduğunu daha fazla kesinlik yoktur. Önemli bir faktör, hücre-hücre teması ve bu hücre-hücre sinyalinin verilmesi ve proliferasyona gibi davranışları etkileyen hücrelerin confluency vardır. Hücreler% 80 konfluent (Şekil 3A) izin vermek ve iyi bir büyüme ve daha sonraki yıkama ve ortam ch sırasında hücre kaybını önlemek için bağlanmıştırange.

RNA ekstre etme ve depolama sırasında koşullar RNA kalitesi ve sonraki analiz için önemlidir. Aynı zamanda, hücrelerin sayısı, ekstraksiyon yöntemi ve miRNA GC içeriği ve mRNA'ların miRNAs 17 hem de verimini ve kalitesini etkileyebilir bilinmektedir. Bu nedenle, RNaz içermeyen koşullar sırasında RNA izolasyonu için ve deneyler ile devam etmeden önce RNA kalitesini kontrol etmek gereklidir. Ekstre etmeden sonra, RNA miktar verim gözlenmesini sağlar (mRNA ve miRNA'lar hem de içeren), toplam RNA, konsantrasyonuna bilgi sağlar. Aynı zamanda, Şekil 3B'de görüldüğü gibi sonuçların grafik bir temsilini sağlar ve bu (genellikle bir zirve, üst panel ile belirtilen) numunenin saflığı gözlem için izin verir. RNA Poor verimi 260 nm (Şekil 3B, alt panel) hiçbir özel emilimini üretecektir. RNA, yüksek kaliteli, RNA olup olmadığını belirlemek için,bütünlük ölçüldü. 9-10 arasında bir RNA bütünlüğü numarası (RIN) RNA bozulmuş değildir ve optimal kalitede olmasını sağlar. Ayrıca, RNA grafik gösterimi dikkat edilmelidir, ve Şekil 4 (orta panel) 'de gösterildiği gibi 18S ve 28S rRNA tepe noktaları olmalıdır. Merdivenin (Şekil 4, üst panel) ile karşılaştırma tepe boyutunu tanımlar. Bir bozulmuş RNA daha az net zirveleri ve 18S ve 28S rRNA azaltılmış göreceli miktarı (Şekil 4, alt panel) olurdu. Küçük RNA'ların fraksiyon ayrıca Agilent küçük RNA Kit kullanılarak sağlanabilir. Bu MiRNA tarama geçmeden önce, belirtilen deney koşulları altında, tedavi sonrası estrojen tepki doğrulamak için tavsiye edilir. A QPCR cDNA şablonu kullanılarak, örneğin PS2 veya SPINK4 18 olarak bilinen bir ER hedef gen üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu tür genler, genellikle E2 tedavi sonrası 1-24 saat içinde artış gösterirler. RNA kalitesi ve östrojen tepki kezbundan başka deney yapılabilir, tayin edilmiştir.

Mikroarray hala hücrelerde miRNA ifade için büyük ölçekli tarama için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Örneğin, bir zamanlar, kullanılan miRNA mikrodizi 894 olgun miRNA'lar ve dördüz 1 'de 50 kontrol benzersiz problar ihtiva etmiştir. Hibritlemeler boya swap prosedüre iki kopya halinde yapıldı. MiRNA mikrodizi sonuçlar genellikle grafik ısı haritaları ile temsil edilmektedir. Şekil 5A, araç ve E2 tedavi edilen örnekler arasında, bir mikro-dizi miRNA karşılaştırma verilerini temsil eden bir ısı haritasını gösterir. Kırmızı, yeşil miRNA (alt ifade) ile infekte belirtilen süre miRNA, E2-muamele edilmiş numune (daha fazla ifade) in yukarı-regüle edildiğini gösterir. MiRNA seçimi genellikle ifade önemleri bağlıdır ve 0.05 genellikle daha bir p-değeri daha az önemli olarak kabul edilir. Farklı şekilde eksprese edilmesi gösterilir miRNAs ayrıca w geçerli olmalıdırITH QPCR, yanlış pozitiflerin onları ayırt etmek.

DLP-LDA dizisi, diğer yandan, 384 oyuklu formatta düzenlenmiş miRNAs taranması için bir QPCR dayalı bir yöntem kullanır. Genellikle iki 384 oyuklu plakalar (kart) havuzları A, B sağlanan ve Havuz A, her miRNA nispi seviye bir MiRNA başına incelendiğinde qPCR, belirlenir havuz B daha miRNA'lar genellikle daha iyi karakterize içerir ve daha çok ifade de (Şekil 5B). Daha yüksek bir Cı-değeri daha az miRNA ifadesini gösterir. Çok miRNA mikroarray gibi, DLP-LDA dan elde sonuçları daha doğruluğunu sağlamak için geçerli olması gerekir.

Geçerlilik QPCR kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, iki qPCR algılama yöntemleri yöntemi yanlılığı önlemek ve kapsamlı onay ve miRNA düzenlemelerin soruşturma için izin açıklanmıştır. Siyanin boya-tabanlı algılama kimya DLP-LDA profilleme dayalı olduğunu DLP daha farklı çalışır ve onaylamak için uygundurtirme amaçları. Bu miRNA erime eğrisi analizini göstermektedir tüm büyütülmüş çift sarmallı DNA tespit eder, ancak numunenin homojenlik. Şekil 6A, (sol panel), erime eğrisi analizi gerçekleştirerek ile değerlendirilebilir gibi daha az spesifik olabilir ve bir açıkça tanımlanmış homojen tepe görülebilir. Astar primer-dimer spesifik olmayan ya da önemli miktarlarda olan (Şekil 6, sağ panel) oluşturulmuş ise birden fazla tepe noktası gözlenmiştir olacaktır. Öte yandan DLP MiRNA tahliller, miRNA tespit hedefin tek amplifikasyonu daha özeldir. Şekil 6B'de gösterildiği üzere, her bir hedef miRNA amplifikasyonu araziler, gözlemlenebilir. Erime eğrisi analizi kullanarak birden fazla amplifikasyon ürünlerinin oluşması için kontrol seçeneği, bu kimya ve boya Siyanin qPCR daha pahalı olan, ancak mevcut değildir. Cyanine boya ve DLP qPCR deneyleri bazen biraz daha farklı sonuçlar elde edebilirsiniz. Bir refe hem QPCR deneyleri, karşılaştırma için,rence gen, iki örnek arasında genlerinin göreceli ekspresyonunu belirlemek için gereklidir. Ayrıca temizlik geni olarak da geçmektedir referans geni, ekspresyonu değişmez ve ilgilenilen gen olarak benzer seviyelerde ifade edilen bir gen olmalıdır. Bu meme kanseri hücre hatlarında uygun bir referans genin bir örneği ARHGDIA, Rho GDP proteinlerin / GTP değişim reaksiyonları işlev gören bir Rho GDP disosiasyon inhibitörü olduğunu. Şekil 6C'de (üst) da görüldüğü gibi, ARHGDIA mRNA seviyesi, araç ve ligand ile muamele edilmiş örnekler arasında değişmez. Yüksek ekspresyon cDNA stokunun ayrı bir 1:500 seyreltme gerektirir ve bu nedenle de daha az uygun da olsa 18S rRNA de kullanılabilir. MiRNA analizi için, iyi tanımlanmış bir referans geni üzerinde bir tartışma hala var. Şimdiye kadar, U6 snRNa yaygın miRNA analizi için kabul edilen bir referans gen olduğunu. U6 snRNa nükleer pre-mRNA SPL çalışması ~ 110 nükleotid uzunluğunda, noncoding küçük nükleer RNAicing 19. Şekil 6C'de (alt) de görüldüğü gibi, U6 ekspresyon seviyeleri, böylece miRNA değişken seviyelerinin hesaplamalar için izin veren, gösterilen tüm örnekler arasında yaklaşık aynıdır. Referans U6 normalize edilmiş araç ve E2 ile muamele edilmiş hücreler arasında bir karşılaştırma için, bir miRNA QPCR sonuç grafik gösterimi Şekil 6D'de gözlemlenebilir. Bu 24 saat E2 tedavi sonrası nonregulated olarak tespit edildi bir miRNA göstermektedir, ancak genomik yere yakın ER kromatin bağlayıcı siteleri limanlar, ve zaman serisi analizi tedaviden sonra önemli düzenleme 72 saat tespit edilmektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Meme kanseri hücrelerinde miRNA hormonal düzenlenmesi tespiti için kullanılan yaklaşımın genel bir bakış.

Şekil 2,
Şekil 2. Her miRNA algılama tekniği için çeşitli numune hazırlama ve nükleik asit manipülasyonlar karşılaştırılması. (A) μParaflo teknoloji yöntemi kullanılarak MiRNA mikrodizi zenginleştirme, poli-A, izleyin ve ligasyon etiketleme içerir. (B) DLP teknolojisi numune hazırlama ve saptama yöntemi denatürasyon basamağından sonra uzanan döngülü bir cDNA sentez primer içeren ve barındıran daha uzun bir fragmanını, astar ve prob dizisini ters. (C) Siyanin boya teknolojisi numune hazırlamave algılama yöntemi poli A-atık ve bir evrensel 5 'sekansı dahil olmak üzere, bir oligo-dT primerler ile cDNA sentezini içerir.

Şekil 3,
Şekil 3,. Hücre kültürü ve RNA ekstraksiyonu. (A) Kültürlenmiş hücreler ligand ile muamele önce gerekli% 80 ortak akışkanlığa göstermek için. (B) RNA konsantrasyonu ve saflık grafiksel temsilini ekstre sonra. Her tepe bir örnek temsil eder ve başarılı bir çıkarma işlemi saf RNA (üst panel) verir. Bir kötü ekstre RNA 260 nm (alt panel) hiç net soğurma pik gösterir.

Şekil 4,
Şekil 4. & #160; RNA kalite kontrol merdivenin (üst), kaliteli bir RNA (orta) ve bozulmuş RNA örnek (alt) için grafiksel bir temsilini gösteren RNA bütünlüğü analiz sonuçları..

Şekil 5,
Şekil 5,. MiRNA profilleme sonuçlarının bir illüstrasyon. (A) farklı olarak ifade miRNAs için miRNA mikroarray sonuçlarının bir ısı harita gösterimi. Kırmızı belirtildiği gibi yeşil gösterildiği gibi miR-D, E, F, G-E2 ile muamele edilen numune olarak azaldı ise miR-A, B, C,-E2 tedavi edilen numune içinde yukarı-regüle edilmiştir. her biri için (B) Amplifikasyon araziler DLP-LDA sonuçları miRNA. Rn değer artışı ile gösterildiği gibi, tespit miRNA güçlendirilir.

Şekil 6, Şekil 6,. miRNA düzenlemelerin QPCR analizi. bir miRNA için (A) Erime-eğrisi analizi, test edilen tüm örneklerin (solda) ve çoklu parçaları (sağ) amplifikasyonu homojenlik gösteren, Siyanin boya algılama kullanılarak analiz. bir için her bir örnek için (B) Amplifikasyon araziler miRNA. Bu, ya Siyanin boyası veya DLP algılama yöntemleri arasında olabilir. (C) örneklerinin arasında önemli bir fark ekspresyonu gösteren mRNA analizi ARHGDIA (üst) ve miRNA analiz snRNa U6 (alt) uygun bir referans genlerin Çubuk grafik temsilidir. (D) bir zaman boyunca miR-135a bağıl ifade seviyelerinin karşılaştırmasını göstermek için miRNA QPCR neden olur. Şekil 6D Elsevier izni ile Katchy et al. 1 ila yeniden yazdırılır. Değerler genellikle ayrı Exper ortalamaiments (biyolojik çiftleri) SD ±. * P <0.05: Student t-testi önemini göstermek için kullanılır.

Discussion

Meme kanseri hücrelerinde miRNA hormonal düzenlenmesi için mekanizma belirlenmesi, bu hastalığın anlaşılması için bir platform sağlayan ve göğüs kanseri için potansiyel bir tedavi sağlayabilir. Hormon hareket için en uygun durum sağlamak için bu hücrelerin kültürlenmesi çok önemlidir. Burada, E2'nin bir uygun doz tedavi süresince uygun bir süre için kullanılmıştır tedavi öncesi ve ilgi (östrojen) hormon dahil olduğu sağlayan bir protokol tarif edilmiştir. Diğer hormonal ve büyüme faktörü etkisi giderek serum seviyesini düşürerek ve hormon, sitokinler ve büyüme faktörlerinin çoğu soyulmuş edilmiş FBS olan DCC-FBS kullanarak en azından tutuldu. Fenol kırmızı içermeyen ortam ayrıca fenol kırmızı estrojenik aktiviteye sahip olan ve hücre çizgileri 20,21 belirli fonksiyonları etkilediği bildirilmiştir göz önüne alındığında, diğer hormonal olmayan etkileri en aza indirmek için kullanılmıştır. Hormona hücrelerin maruz kalma süresi büyük önem taşımaktadır. Genlerinin östrojen ile ilişkili düzenleme için, bir önceki 24 hrexposure göğüs kanseri hücrelerinin 1,18 doğrudan hedef genlerin önemli bir cevap üretmek gösterilmiştir. MiRNAs RNA polimerazı II tarafından transkribe olduğu için, mRNA gibi, bu aynı zamanda miRNAs doğrudan düzenleme tespit etmek için uygun bir zaman noktası olduğunu akla uygundur. Bu miRNAs meme kanseri hücrelerinde bu bilinen ER hedeflerin ifadesini nasıl etkilediğini ve henüz belirlenecek.

MiRNA ekspresyon profili nedeniyle miRNA, olgun miRNA dizisi pri-miRNA ve önceden miRNA de bulunabilir gerçeği göreli küçük boyutta zor olabilir, ve bu nedenle bunların GC içeriği 22 heterojenliğin olabilir. Çeşitli profilleme teknikleri ve kimyaları bu zorluğu aşmak için istihdam edilmiştir. Bunlar arasında mikroarray ve qPCR analizi farklı yaklaşımlar (Şekil 2). Mikrodizi yaygın tüm genom anal kabul edilmekle birlikteölçmeye çalıştığımız, bu yanlış negatifler sağlayabilir ve kimya baskı teknolojisi 23 arasında değişen, mevcut platformlar arasında farklılıklar vardır. MRNA onbinlerce kıyasla binlerce sayılır nispeten az miRNA genlerinin, analiz ederken de normalleşme sürecinin bir meydan okuma sunuyor. QPCR, diğer taraftan, daha duyarlıdır ve daha az genler dikkate alınması gereken zaman daha iyi uygulanır. Plaka başına sadece bir teknik tekrarında, geniş, 384 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir Ancak, birden fazla plakalar analiz pahalı hale getirir, her numune için analiz edilmesi gerekir. Ayrıca, bizim ellerde, daha birçok yanlış negatif sonuçlar mikroarray göre DLP-LDA analizi kullanılarak elde edilmiştir. Olgun miRNA dizisi pri-miRNA ve önceden miRNA dizileri içinde mevcut olduğu göz önüne alındığında, bu PCR teknikleri kullanarak bu transkript 24 arasında ayırt etmek için önem taşımaktadır. DLP sondalar ön miRNA'lar ve sp için de kullanılabilirecific primerleri siyanin boyası QPCR teknolojisi kullanılarak varyantları farklı olgun ya da ön-maddesini çıkarmak için tasarlanabilir.

QPCR sonuçları profilleme ayırıcı ifade doğrulama için bir altın standarttır. QPCR etkinliği, ancak, RNA ekstraksiyonu, RNA bütünlüğü (kalite), cDNA sentezi, primer tasarımı, saptama yöntemi (kimya) ve veri normalleştirme 1,22,25 için referans gen dahil olmak üzere çeşitli parametrelere bağlıdır. Kısa miRNA dizi uzunluğu kadar alternatif primer dizaynı için yer vermez beri miRNA analizi için primer dizaynı için seçenekler çok sınırlı ve sadece bir primer bu kısa sırayla barındıran olabilir. Bu nedenle, alternatif manipülasyonlar için ihtiyaç, Şekil 2'de gösterildiği gibi. Teknik çoğaltır amplifikasyon yöntemin sağlamlığını ve kullanılan işlemi doğrulamak için önemlidir. Biyolojik çoğaltır genel biyolojik variatio bir temsili için gerekli olann tedavi ligand için, ve bir hücrede görülen etkileri tekrarlanabilir olduğunu göstermek için değişken yanıt dahil. Bizim deneyime dayalı, hücre kültürleri arasındaki miRNA ifade varyasyonlar oluşabilir. Genellikle bu fark 1.3-kat daha az olan, ve değerlerin ortalaması ve ilgili SD doğal ve teknolojik varyasyonu tanımlar. Bu varyasyon, hücre yoğunluğu ve hücre fonksiyonları geçide pasajdan değişebilir olmasından, dahil olmak üzere çeşitli faktörler neden olabilir. P-değeri 0.05 'den daha az olduğu zaman ligand tedaviden kaynaklanan istatistiksel olarak anlamlı ifadeleri belirlemek için, yaygın olarak kabul edilen bir önem arz eder. Burada, iki kuyruklu dağılımı ve iki örnek eşit olmayan varyans parametreleri kullanarak biyolojik ve teknik suretin bir öğrencinin t-testi kullanılmıştır. Diğer t-test parametreleri var, ve seçim deney düzeneği 26 bağlıdır.

Olgun miR hormonal düzenlemeleri değerlendirirken ayrıntılı bir protokolMeme kanseri hücrelerinde NA sağlanmıştır. Profilleme ve bu miRNA ifadeleri doğrulayarak önemli teknolojileri ve kimya açıkça açıklanmıştır. Meme kanseri hücrelerinde miRNA çalışmalar için seçilmiştir teknoloji sonunda tam olarak araştırılmaktadır bağlıdır.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz onların miRNA uzmanlık paylaşımı için Dr Karin Edvardsson, Karolinska Enstitüsü, İsveç, ve Dr Eylem Aydoğdu, Houston Üniversitesi,, LC Bilimleri miRNA mikroarray platformu tavsiye sağlamak için, Dr Xiaolian Gao, Houston Üniversitesi minnettarız . Bu yayında bildirilen Araştırma Ödülü Numarası R01CA172437 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu çalışma aynı zamanda Anlaşma kapsamında Teksas Gelişen Teknoloji Fonu, hiçbir hibe tarafından desteklenmiştir. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128, (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23, (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40, (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4, (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83, (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17, (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10, (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7, (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37, (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27, (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1, (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12, (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57, (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).
Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter