Summary
Blod leukocyter och trombocyter kan användas som markör för allmänna bioenergetiska hälsan hos en individ och så har potential att övervaka patologiska processer och effekten av behandlingarna. Här beskriver vi en metod för att isolera och mäta mitokondriefunktion och oxidativt utbrott i dessa celler.
Abstract
Mitokondriell dysfunktion är känt för att spela en betydande roll i ett antal patologiska tillstånd såsom åderförkalkning, diabetes, septisk chock, och neurodegenerativa sjukdomar, men att bedöma förändringar i bioenergetisk funktionen hos patienter är utmanande. Även sjukdomar som diabetes eller åderförkalkning närvarande kliniskt med specifik organfunktion, de systemiska komponenter i patologi, såsom hyperglykemi eller inflammation, kan förändra bioenergetiska funktion i cirkulerande leukocyter eller trombocyter. Detta koncept har erkänts under en tid, men dess utbredda tillämpning har begränsats av det stora antalet primära celler som behövs för bioenergetisk analys. Denna tekniska begränsning har övervunnits genom att kombinera den särskilda karaktären hos de magnetiska pärla isoleringstekniker, cellvidhäftningsteknik, som gör att celler som skall fästas utan aktivering till mikroplattor, och känsligheten för ny teknik utformad för hög genomströmning microplate respiration. Ett exempel på denna utrustning är den extracellulära flux analysatorn. Sådana instrument används vanligtvis syre och pH-känsliga sonder för att mäta förändringstakt i dessa parametrar i vidhäftande celler, som sedan kan relateras till ämnesomsättningen. Här är vi i detalj de metoder för isolering och plätering av monocyter, lymfocyter, neutrofiler och trombocyter, utan aktivering, från humant blod och analysen av mitokondrie bioenergetisk funktion i dessa celler. Dessutom visar vi hur den oxidativa brast i monocyter och neutrofiler kan också mätas i samma prover. Eftersom dessa metoder använder bara 8-20 ml blod de har potential för övervakning av reaktiva syreradikaler generation och bioenergetik i en klinisk miljö.
Introduction
Övervakning bioenergetiska hälsan av immunceller (monocyter, lymfocyter, neutrofiler) och blodplättar från blod har erkänts under en tid som ett potentiellt användbart diagnostiskt verktyg för att bedöma den totala bioenergetiska hälsa hos en individ. Det finns en växande mängd litteratur tillskriva en rad sjukdomar som cancer, hjärt-och kärlsjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar till mitokondriell dysfunktion 1,2. Detta är kliniskt viktigt eftersom mitokondriell dysfunktion kan initiera en serie av cellulära händelser som främjar pro-inflammatoriska signalvägar eller leder till celldöd. Flera studier har karaktäriserat mitokondriell funktion av perifera mononukleära blodkroppar och blodplättar i tillstånd såsom fibromyalgi, diabetes, septisk chock, och Alzheimers sjukdom 3-7. Till exempel, utvärderade en ny studie av bioenergetik trombocyter som markör för mitokondriefunktion och funnit att trombocyter från typ 2 diabetIC patienter hade minskat mitokondrie syreförbrukning 7,8. Från dessa iakttagelser och andra, är det tydligt att monocyter, lymfocyter, neutrofiler och trombocyter kan fungera som surrogatmarkörer för förändringar i bioenergetik i sjukdomstillstånd, eftersom de kartlägga kretsloppet och kan återspegla lokala och globala metabola förändringar. För att avgöra om detta tillvägagångssätt har prognostiskt eller diagnostiskt värde en hög genomströmning metod för analys och det krävs en konsekvent metod för förberedelse cell.
Metoderna för att mäta mitokondriefunktion i leukocyter och trombocyter har tidigare involverat isolering av mitokondrier eller bedömning av cellulära bioenergetik i intakta celler 4,9. Fördelen med cellulära bioenergetisk bedömning med hjälp av ett extracellulärt flöde (XF) Analysatorn är att den mitokondriefunktion i celler kan fastställas med endogena substrat och respiratoriska parametrar som proton läcka och maximal andningskapacitet kan bestämmas. Vi och andra har använt denna teknik för att visa att bioenergetiska profiler i trombocyter, kan monocyter och lymfocyter som isolerats från humant blod fastställas och jämföras mellan celltyper 8. Dessutom har både neutrofiler och monocyter har en oxidativ burst egenskap i vilken NAPDH oxidaser är aktiverade och förbrukar syre till att bilda superoxid. Viktigt är denna väg en viktig del av medfödd immunitet och moduleras av systemisk inflammation. Till exempel har det visat sig att förändringar i den oxidativa sprängnings kapacitet är associerade med olika autoimmuna sjukdomar, såsom multipel skleros, artrit, och återkommande infektioner 10,11. För närvarande finns inga hög genomströmning kvantitativa analyser tillgängliga för att mäta den oxidativt utbrott i kliniska prover. Detta är viktigt eftersom att karakterisera den oxidativa sprängnings kapacitet av neutrofiler och monocyter kan också tjäna som ett viktigt diagnostiskt verktyg för flera pathologier.
De viktigaste tekniska utmaningar har låg känslighet för mätning av syreförbrukning genom användning av konventionella polarografiska tekniker och behovet av att använda vidhäftade celler vid användning av mer känsliga mikro fluorometriska tekniker. I den här praktiska video beskriver vi den tekniska lösningen på dessa problem. Vi detalj de metoder för isolering, plätering och mätning av bioenergetik av monocyter, lymfocyter, neutrofiler och trombocyter och den oxidativa explosion av monocyter och neutrofiler från humant blod. Denna metod är lämplig för klinisk bedömning av bioenergetik och oxidativ burst för utredare som har tillgång till en patientgrupp och förmågan att skaffa nya blodprover.
Protocol
Alla protokoll som beskrivs i detta manuskript för blodinsamling, isolering och analys har granskats och godkänts av Institutional Review Board vid University of Alabama i Birmingham.
1. Cell Isolation (Ändrad från Histopaque Sigma-Aldrich protokoll nr 1119 och Miltenyi Biotec microbead positiva och negativa Selection protokoll)
- Centrifugera helblod (samlas in i ACD eller EDTA-rör) vid 500 xg under 15 minuter i en centrifug med en svängande-hink rotor (acceleration = 5-6, och ingen broms).
- Ta bort det översta lagret som innehåller trombocyter rich plasma (PRP) med en överföringspipett tills 1 cm förblir ovanför cellager (erytrocyter / buffy coat). Lägg undan PRP vid rumstemperatur för bearbetning senare.
- Överför lättcellskoncentratet till en steril 50 ml koniska rör, späd till 24 ml med basal RPMI eller att åtminstone 4x start gula hinnan volym.
Anmärkning: Den övre halv av RBC skiktet kan have inkluderas även om detta kommer att leda till att öka RPMI volym proportionellt. - Förbered densitetsgradient med användning av låg densitet Ficoll med en specifik vikt av 1,077 (1077) för det övre skiktet och high density Ficoll med en specifik vikt av 1,119 (1119) för det undre skiktet i tre 15 ml koniska rör (3 ml vardera). För att utföra detta steg, först lägga 1077 till varje rör. Med hjälp av en 5 ml smal pipett lägga 1119 till botten av röret genom att placera pipettspetsen under 1077 och långsamt frigöra reagenset utan att blandas med den övre gradienten. Totalt 6 ml densitetsgradient medier bör vara närvarande vid detta skede med en synlig fas separation på 3 ml.
- Med hjälp av en automatiserad pipett, tillsätt 8 ml utspätt blod (från steg 1,3) försiktigt till varje lutning röret med hjälp av låg effektinställning för att hindra från att störa övertoningslager. Den totala volymen bör vara 14 ml vid det här steget.
- Centrifugera rören vid 700 xg under 30 minuter vid rumstemperatur (accelereration 6, ingen broms).
OBS: I detta skede bör tre distinkta cellband framgå (Figur 1A). De översta banden (mellan 1077 och plasma) innehåller mononukleära celler (MNC) och trombocyter, samt mittband (mellan 1007 och 1119) innehåller polymorfonukleära celler (PMN) och undre bandet (under 1119) innehåller RBK. - Samla MNC och PMN separat genom att använda sterila glaspipetter utan att störa de andra cellbanden. Kombinera MNC populationen från varje rör in i en steril 50 ml koniska rör. Upprepa detta för PMN befolkningen också.
- Lägg 4 volymer av RPMI till varje rör som innehåller MNC och PMN fraktioner respektive att späda ut densitetsgradienten.
- Centrifugera rören vid 700 xg under 10 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera MNC cellpelleten och PMN cellpelleten i 1 ml RPMI innehållande 0,5% ultraren fettsyrafritt BSA (RPMI-BSA) och överför till sterilt 1,5 ml rör. Pelletera cellerna genom att använda en bänk picofuge för 30sek.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera varje cell pelleten i 80 | il RPMI-BSA.
- Tillsätt 20 l av magnetisk pärla märkt-antiCD14 antikropp till röret med MNC fraktionen för positiv selektion av monocyter. För röret med PMN cellfraktionen, tillsätt 20 ìl av magnetiska pärlor märkt-antiCD15 antikropp för positiv selektion av neutrofiler. Inkubera varje cell suspension 15 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta varje cellsuspension med 1 ml RPMI-BSA media och pellets som tidigare och återsuspendera varje pellet i 500 pl RPMI-BSA.
- De märkta cellerna separeras i det magnetiska fältet hos magnetaktiverad cellsortering (MACS) separatorn. Förbered MACS LS kolumner (en för varje cellsuspension) genom att placera kolumnen till MACS separator och tvättning med 3 ml RPMI-BSA före tillsats av cellsuspension.
- Efter tillämpning cellsuspensioner, tvätta varje kolumn 3x med 3 ml RPMI-BSA-media (se till att låta media drain helt mellan tvättar). Samla cellsuspensionen genomflöde och kolonntvättningar i ett sterilt rör.
- För att isolera monocyter och neutrofiler, avlägsna kolonnen från det magnetiska fältet efter den slutliga tvättningen och eluera de positivt selekterade celler i ett sterilt rör med 5 ml av RPMI-BSA med användning av kolonnen kolven.
- För att isolera lymfocyterna pellegenomflödestvättfraktion av MNC från steg 1,15 vid 300 xg under 10 min. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten i 80 pl RPMI-BSA. Tillsätt 20 l av CD61 och CD235a antikroppar och inkubera cellsuspension i 15 minuter vid 4 ° C. Upprepa MACS separation som tidigare och samlar flödet men innehåller lymfocyter.
- För att pelle monocyter, neutrofiler och lymfocyter fraktioner centrifugen som tidigare (steg 1,9) och kassera supernatanter. Cellpelletar bör återsuspenderades i 1 ml extracellulära flödesmedier (XF-DMEM) för räkning. <br /> Note: 8 ml helblod bör resultera i 1-5 x 10 6 monocyter / ml och 5-20 x 10 6 lymfocyter och neutrofiler / ml.
- Att isolera blodplättar, centrifug PRP (steg 1,2) under 8-10 min vid 1500 xg vid rumstemperatur. Avlägsna plasma och tvätta cellpelleten en gång med steril 5 ml PBS som kompletterats med 1 | ig / ml PGI2, repellet och suspendera slutliga pelleten i 1 ml PBS-PGI 2-buffert.
- Bestäm antalet blodplättar genom turbidimetri när blodplättarna suspenderades i PBS-PGl2 buffert genom spektrofotometer såsom beskrivits av Walkowiak et al med användning av följande ekvation: [6,23 / (2,016 - Abs 800)] - 3,09 x spädningsfaktor = # x 10 8. trombocyter / ml 12.
2. Plätering av celler
- Beredning av Cell-Tak (cell lim): Lägg 90 l cell lim till 180 l DIH 2 0, 540 pl av 0,1 N natrium-bikarbonat (pH 8,0) och justera pH till 7,2 till 7,8 med användning av 1 N NaOH. Förbered XF plattor (24 brunnar, V7 mikroplattor) genom att belägga varje brunn med 30 l av beredd cell lim.
OBS: Cell lim bör beredas på nytt för varje användning. - Inkubera plattan vid 37 ° C i 20-30 minuter sedan aspirera cell lim och tvätta brunnarna med PBS två gånger (1 ml / brunn).
- Utför ett celltal på isolerade monocyter, lymfocyter, neutrofiler och trombocyter och ta med till lämplig volym med XF-DMEM att tillåta en seedning densitet på 250k celler / brunn för monocyter, lymfocyter och neutrofiler, och 25 x 10 6 / bra för blodplättar. Alternativt, för att mäta oxidativ burst respons, neutrofiler kan ympas vid 125K celler / brunn. Den slutliga seeding volym för varje cellsuspension bör vara 200 l / brunn.
- Centrifugera plattan vid 200 x g under 1 sekund utan någon broms. Vrid plattan 180 ˚ och centrifugera igen med ingen broms vid 300 x g..
- Ta sista väl volUME till 660 l med XF-DMEM och inkubera vid 37 ° C i 30 minuter före XF-analys. Notera: Fotomikrografer av pläterade celler före och efter analys kan användas för att säkerställa tillräcklig plätering och utesluta cell lossnar.
3. Framställning av en 24-brunnars Extracellulär Flux Assay Plate (XF24)
- Hydrat XF sonder med kalibreringsvätska för minst 2 h före analysen.
- Förbered 10x lager av 0,5 | ig / ml oligomycin, 0,6 pM FCCP och 10 pM antimycin A i XF-DMEM och belastning 75 | il av stamlösningarna i patroninjektionsöppningar i ovanstående ordning. Om oxidativa mätningar av sprängstyrka skall erhållas, kan injektion av 10x stock av 100 ng / ml PMA injiceras efter antimycin-A.
- Kalibrera hydrerad och laddade patronen och utför XF-analysen. De detaljerade metoder för analys och tolkning av både syreförbrukningen och pH-förändringar har beskrivits i tidigare publikationer 9,13,14 och är inte discussed i detalj här.
- Efter XF-analysen, aspirera alla utom de sista 50 pl XF-DMEM efter analysen för att förhindra förlust av celler från plattan och tillsätt 50 l RIPA cellysbuffert och utföra en proteinanalys för normalisering.
Representative Results
För att bedöma de bioenergetik av blodceller, är helblod från människa genom venpunktion i EDTA-eller ACD vacutainer provröret. Isoleringen av leukocyter och trombocyter efter blodinsamling visualiseras i figur 1 A som beskrivs i protokollet. Hela blodprov behandlas inom 8 timmar av insamling för att undvika celldöd och aktivering. Utökade lagrings gånger större än 8 tim har inte testats, men kan leda till förändrade bioenergetik och vara mindre representativa för fysiologiska förhållanden. Vätecitrat dextros (ACD-8 ml) och EDTA vacutainerrör har använts för cell isoleringar med ingen effekt på den bioenergetiska funktion av isolerade celler. Antikoagulantia är nödvändigt eftersom proppar minska antalet celler som erhållits, påverka korrekt fas bildas under Ficoll gradient centrifugering, och resulterar i liten eller ingen trombocyter framställda i centrifug serum. Allt blod representerar en biologka fara och korrekt personlig skyddsutrustning skall genomföras under hela proceduren även efter cellpopulationer isoleras eller cellysaten genereras. Proverna ska kasseras i enlighet med institutionens normer avfallshantering mänskliga.
Helblod centrifugerades för att separera blodplättsrik plasma från buffy coat, det vita skiktet ovanför de packade röda blodkroppar som innehåller leukocyter. Lättcellskoncentratet appliceras på densitetsgradienter och centrifugeras för att erhålla de perifera mononukleära blodceller (monocyter och lymfocyter) och polymorfonukleära celler (granulocyter). RBC förorening av enskilda MNC och PMN cellfaserna är vanligt i detta skede och bör lösas under MACS rening. De olika typer av celler erhålles sedan genom inkubering med magnetiska antikroppar för erhållande av rena fraktioner. Monocyter uppsamlas genom inkubation av PBMC-fraktionen med CD14, genomflödet från than monocyter innehålla lymfocyter, som sedan är utarmade av RBC och trombocyter. De neutrofiler erhålls genom inkubation av polymorfonukleära cellskiktet med CD15-antikroppen (Figur 1A). Därefter kan blodplättarna pelleteras genom centrifugering av blodplättsrik plasma och tvättades för avlägsnande av andra plasmakomponenter. Efter dessa val trombocyterna, CD14 + monocyter, lymfocyter, CD15 + neutrofiler kan räknas och pläterade på en cellvidhäftningsmedelbelagda XF analysator platta för bioenergetik och oxidativ burst analys.
Varje skede av förfarandet ska utföras under sterila förhållanden och uppmuntras för att förhindra för tidig aktivering av oxidativ burst svar i monocyter och neutrofiler. En indikator på under sterila förhållanden under isolering är uppenbar när neutrofiler, som har liten eller ingen syreförbrukning under basala förhållanden, börjar den extracellulära flödesanalysen med förhöjda OCR mätningar somgradvis öka eller minska under hela analysen. Vi betonar vikten av att avbilda celler med ljusmikroskop vid 200X eller högre för att säkerställa att inga morfologiska tecken på aktivering har skett före analysen. Till exempel, neutrofiler normalt visa ett avrundat till oregelbunden form med uttalade cellgränserna som visas i figur 1B. Dock kommer dessa celler plattas mot ytan av plattan när den aktiveras och förlorar sin distinkta cellmorfologi. Vi har tidigare rapporterat de morfologiska förändringarna av aktiverade leukocyter och trombocyter använda detta protokoll och ytterligare åtgärder måste vidtas för att säkerställa sterila förhållanden, om att möta aktivering 8.
Ett enklare system av protokollet ses i figur 2 som en tidsplan där de primära stegen i cellisolering, XF tallrik förberedelse, och XF-analysen är detaljerade. Isolering består av densitetsgradient separation av celltyper ochföljs av magnetisk separation. Parallellt med cellisolering process krävs XF tallrik förberedelse för att undvika förseningar i cell plätering eller början av XF-analysen. Detta är avgörande eftersom betydande förseningar kan leda till cellaktivering och minskade bioenergetik parametrar.
Otillräcklig cellkoncentrationer efter isolering är ett vanligt problem och optimering av varje centrifuge process är nödvändig för att undvika cellförlust. Framgångsrika isoleringar har utförts på så kort tid som 6 ml blod men ändringar kan göras beroende på cirkulerande koncentrationer av den önskade celltypen. Om densitetsgradienten är felaktigt förberedd, kan distinkta cellfaser inte vara synlig och förlust av celler kan förekomma (se JUPITER instruktionsvideo för en visuell demonstration). Otillräcklig trombocyter isolerad från PRP är sällsynt men har förekommit om tvättbuffert inte innehåller PGI 2 eller om isoleringen sker under rumstemperatur. Risken för blodplättar activation ofta förhindras om trombocyter är de sista celler som skall isoleras, men om trombocyter kvar i tvättbuffert under längre perioder de bioenergetics kommer att påverkas. Det har förekommit fall av mindre trombocyter populationer som inte pellets under 1500 xg centrifugering och bioenergetik av dessa celler har inte varit omfattande karakteriseras. Se tabell 2 för en mer komplett felsökningsguide.
Bioenergetiska profiler av leukocyter och trombocyter kan bestämmas med hjälp av XF-analysator, som mäter realtid O 2 konsumtionen i celler noninvasivt. Varje celltyp pläteras på XF24 plattan med fem replikat, såsom visas i fig. 3A. Tabell 1 indikerar förväntade basala och oxidativ burst värden efter celltyp under analysen och den genomsnittliga proteinhalter per brunn. Högre genomströmning teknik finns tillgänglig, till exempel XF96, vilket gör det möjligt förfyra givare som ska bedömas samtidigt som visas i figur 3B. När analysen är data exporteras till en arbetsstation dator för analys med hjälp av lämplig XF programvara och Microsoft Excel. OCR-värdena normaliserades till total proteinhalt i motsvarande brunnar och uttrycktes som pmol / min / mg protein. De representativa bioenergetiska-oxidativ burst profiler för varje celltyp har nyligen rapporterats av vår grupp 8. Ytterligare analys av bioenergetiska parametrar för analysen (basal, ATP-linked, proton läcka, maximal, nonmitochondrial och oxidativ burst) kan beräknas för individuella brunnar såsom tidigare visats och beskrivits under 8.
Den basala syreförbrukningshastigheten (OCR) är inrättad av de tre första mätningarna som visas i Figur 4A. Oligomycin (0,5 | ig / ml), en hämmare av mitokondrie ATP-syntas injiceras i XF-medium för att uppskatta OCR kopplad till ATP-syntes och företrä ted som ATP-kopplad. Rest OCR minus nonmitochondrial OCR kan hänföras till proton läcka. Därefter FCCP en frikopplare tillsättes för att bestämma den maximala OCR, följt av antimycin-A, en inhibitor av mitokondriell andning, för att bestämma nonmitochondrial källor av syreförbrukning. Reservkapaciteten är ett mått på den mängd ATP som kan framställas under energisk efterfrågan och kan beräknas som skillnaden mellan den högsta graden av andning och basala. I syfte att bestämma den oxidativa sprängnings kapacitet forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) en PKC-agonist injiceras för att öka NADPH-oxidasaktivitet, och ökningen i syreförbrukningshastigheten efter PMA-stimulering kan mätas med hjälp av XF-analysatorn. Figur 4B visa hur man kan beräkna olika parametrar för mitokondriefunktion och oxidativ burst.
1301/51301fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
Figur 1. Isolering av leukocyter och trombocyter från helblod. A) Färskt uppsamlade proverna separeras i deras plasma och cellulära komponenter genom centrifugering och renades genom Ficoll-densitetsgradient, och magnetaktiverad cellsortering (MACS) av positiva (monocyter och neutrofiler) eller negativ selektion (lymfocyter), medan blodplättar isoleras genom hög B) Bilder av de isolerade cellpopulationer gång suspenderade i XF DMEM och pläterade på angivna celldensiteter hastighet centrifugering av trombocyter rich plasma.. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
Figur 2. Beredning av XF24 plattor för Bioenergetiska studier av leukocyter och trombocyter. Detaljerad tidsplan för beredning av en XF24 analysplatta med cellisolering och plätering och patron hydration och injektion port lastning.
Figur 3. Layout av leukocyter och blodplättar på XF24 och XF96 analyzer plattor. A) Leukocyter (125-250k celler / brunn) och blodplättar (25 x 10 6 celler / brunn) från en enda donator utstrykes på XF24 analysplatta bland bakgrund kontroller. 75 ^ il 10 x lager av oligomycin (0,5 | ig / ml), FCCP (0,6 ^ M), antimycin-A (10 ^ iM) och PMA (100 ng / ml) spädd i XF medierna är laddade iatt de angivna injektionsöppningarna. B) Leukocyter (75-150k celler / brunn) och trombocyter (10 x 10 6 celler / brunn) från så många som fyra givare kan vara pläterade på XF96 i en total volym av 180 | il XF-DMEM. 20 ^ il 10 x lager av oligomycin (1,0 pg / ml), FCCP (0,6 ^ M), antimycin-A (10 ^ iM) och PMA (100 ng / ml) spädd i XF-DMEM laddas in i de angivna injektionsöppningarna.
Figur 4. Analys av Bioenergetiska index. A) representant spår av syreförbrukning (OCR) av mitokondrier och oxidativ burst i monocyter. Basal OCR är etablerad (första 3 priser anges med siffror i cirklar). Då sekventiella tillsatser av oligomycin (O; 0,5 | ig / ml), FCCP (F, 0,6 ^ M) och antimycin-A (A, 10 ^ M) injiceras för att bestämma mitokondrie och nonmitochondrial andning av icke-aktiverade celler. Slutligen, PMA (100 ng / ml) tillsätts för att mäta oxidativ burst. B) Modul analys av mitokondriefunktion och oxidativ burst beräknas av skillnaderna i priser som anges.
| Optimal Sådd Densitet | Avg. Basal OCR (pmol O2 / min) | Avg. Oxidativ Burst OCR (pmol O2 / min) | Avg. protein (ng) / brunn | |
| Monocyter | 250k celler / brunn | 83,9 (± 13,0) | 300,3 (± 58,8) | 19,0 (± 2,4) |
| 250k celler / brunn | 6,1 (± 2,2) | 1411,8 (± 233,3) | 20,6 (± 2,7) | |
| Lymfocyter | 250k celler / brunn | 52,9 (± 7,7) | 15 (± 4,1) | 13,2 (± 2,1) |
| Trombocyter | 25 x 10 6 celler / brunn | 199,4 (± 20,3) | 24 (± 2,7) | 47,5 (± 3,1) |
Tabell 1. Normala parametrar för XF24-analys: Det genomsnittliga basala (Rate 3) och oxidativ burst (Rate 7) OCR inte rättas till nonmitochondrial OCR eller protein visas av celltyp klädd vid de angivna celldensiteter. Den genomsnittliga proteinhalt per brunn visas som utförs av en DC-Lowry-analys. Dessa data utgör medelvärden av6-8 friska donatorer med parentes innehåller ± SEM.
| Steg | Problem | Möjlig orsak | Lösning |
| 1,2 | klar plasma | trombocyter pellete under centrifugering | minska centrifugeringstiden till 10 min eller långsamt 400 xg |
| milky plasma | överskott lipider | undvika postprandial insamling | |
| 1,6 | ofullständig cellband som bildas | impRoper gradient beredning, kallt reagens | inte störa lutning under pipettering, användning rumstemperatur reagens |
| klumpar i cellband | koagulering av blod kan ha inträffat | Samla blod med hjälp av antikoagulantia såsom ACD eller EDTA | |
| 1,10 | ingen cellpellet | se steg 1.6 | Om supernatant dimmig se nedan |
| grumlig supernatant | Tung Ficoll lutning kontamination, förorening trombocyter | Öka centrifugeringshastigheten till 900 xg, diluta med mer RPMI | |
| 1,16, 1,17 | lågt utbyte av leukocyter | tung RBC kontamination, inte tillräckligt helblod, koagulering | Dubbel antikropp och RPMI-BSA volymer, samla in mer blod, lägga antikoagulantia |
| 1,19 | trombocytaggregation | PGI 2 utelämnas, exponering för kyla media, förlängd lagring i plasma | lägga PGI 2 till trombocyter tvätt buffert, reagens används rumstemperatur |
| 1,20 | lågt antal blodplättar | förlust under primär centrifugering, aggregering av blodplättar | Sesteg 1,2 och 1,19 |
| 2,3 | RBC kontamination | Upprepa MACS separation |
Tabell 2. Leukocyter och trombocyter isolering felsökning. Tabellen listar vanliga problem som uppstår under leukocyter och trombocyter cell isolering från helblod och lösningar som kan vägleda användarna genom felsökningsprocessen.
Discussion
Detta protokoll utgör en sammanställning av flera gemensamt utnyttjade tekniker för blodcellisolering på ett sätt som lämpar sig för bioenergetik analys. De angränsande tekniker som presenteras är fördelaktiga för andra isoleringsmetoder (dvs. FACS-analys) för sin förmåga att isolera ett stort antal celler i kontrollerade medier förhållanden med minimala påfrestningar som ställs på de isolerade cellerna. Den har nackdelen av långa isoleringar även med minimala avbrott. Detta protokoll utgör grunden för isolering av primära blodceller från människa, som kan extrapoleras in i kliniska inställningar och translationell forskning.
MACS separation är en tillförlitlig cell isoleringsteknik som erbjuder möjligheten att isolera celler direkt från helblod, dock kräver denna metod större mängder av antikroppen och är inte optimal för isolering av alla fyra distinkta celltyper som beskrivs i denna metod. Det har been inga bevis för att visa att det positiva urvalet av leukocyter från MACS separation resulterar i aktivering med hjälp av vår isolering protokoll. MACS-kolonner fungera genom sekvestrering av märkta celler i ett magnetiskt fält med användning av antikroppar konjugerade till 50 nm superparamagnetiska partiklar. Märkta celler elueras därefter från kolonnen. Positiva och negativa val genomförs i detta protokoll för att säkerställa snabb isolering och renhet. Om otillräckliga cell nummer erhålls från isolering eller renhet är i fråga, kan fler antikroppar sättas till provet enligt leverantörens instruktioner och andra passage genom LS kolumnen kan leda till större renhet (tabell 2). Vårt laboratorium fann hög renhet och plätering effektivitet med hjälp av befintliga protokollet genom att analysera slut cellsuspensioner genom FACS-analys 8.
Cellulära flux analysatorer har förmågan att övervaka både syreförbrukning och media försurning i realtid över den för othennes elektroder. Den syreförbrukning som observeras av oxidativ burst svar i monocyter och neutrofiler är NADPH-oxidas beroende vilket framgår av hämning med DPI 8. Vi har sett en beroende förlust tid i oxidativ burst kapacitet med långa isoleringar eller utvidgade XF-analyser. Detta protokoll har utformats och utvecklats för användning på XF24 men är också förenligt med den XF96 vid ungefär en tredjedel till en halv av den XF24 cell seeding densiteter (Figur 3).
I utformningen av detta protokoll, har anslutning till befintliga protokoll för varje teknik som krävs för optimal prestanda med ändringar som gjorts enbart för att styra media förutsättningar för bioenergetisk analys. Efter mastering tekniker, kan ett sådant protokoll kan användas i ett brett spektrum av translationell och forskningsansökningar för att mäta toxicitet eller effektiva behandlingsstrategier, utforska metaboliska egenskaper sjukdom och oxidationsmedel produktion av monocyter och neutrophils i inflammatoriska tillstånd.
Disclosures
Bildskärm är en medlem av den Bioscience vetenskapliga råd Seahorse.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för det tekniska bidraget av Gloria A Benavides. Detta arbete stöddes av American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK diabeteskomplikationer Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) bevilja DK076169 (subaward VDU), och O'Brien Center P30 DK079337 (bildskärm).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
| CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
| CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
| CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
| Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
| 1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
| Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
| Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
| XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
| DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
| L-Glutamine, 200 mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
| Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| (FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
| DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
| DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
| QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
| Spectrophotometer |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).
- Jin, S. Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis. Autophagy. 2, 80-84 (2006).
- Cordero, M. D., et al. Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease. Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).
- Japiassu, A. M., et al. Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity. Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).
- Widlansky, M. E., et al. Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes. Transl. Res. 156, 15-25 (2010).
- Shi, C., et al. Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets. Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).
- Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).
- Hultqvist, M., et al. Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).
- Rosa-Borges, A., et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report. J. Ped. 77, 331-336 (2001).
- Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation. Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).
- Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).
