Summary
रक्त leukocytes और प्लेटलेट्स एक व्यक्ति के समग्र bioenergetic स्वास्थ्य के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया और इसलिए रोग प्रक्रियाओं और उपचार के प्रभाव पर नजर रखने की क्षमता है किया जा सकता है. यहाँ हम mitochondrial समारोह और इन कोशिकाओं में oxidative फट अलग करने और मापने के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
Mitochondrial रोग atherosclerosis, मधुमेह, सेप्टिक सदमे, और neurodegenerative रोगों लेकिन चुनौती दे रहा है रोगियों में bioenergetic समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के रूप में रोग की स्थिति की एक संख्या में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है. मधुमेह या वर्तमान atherosclerosis जैसे रोगों चिकित्सकीय विशिष्ट अंग हानि के साथ, इस तरह के hyperglycemia या सूजन के रूप में विकृति के प्रणालीगत घटकों, leukocytes या प्लेटलेट्स प्रचलन में bioenergetic समारोह को बदल सकता है. इस अवधारणा को कुछ समय के लिए स्वीकार किया गया है, लेकिन इसके व्यापक आवेदन bioenergetic विश्लेषण के लिए आवश्यक प्राथमिक कोशिकाओं की बड़ी संख्या से विवश कर दिया गया है. यह तकनीकी सीमा कोशिकाओं microplates के लिए सक्रियण के बिना संलग्न करने की अनुमति दे जो चुंबकीय मनका अलगाव तकनीक, कोशिका आसंजन तकनीक, की विशिष्टता के संयोजन के द्वारा दूर किया गया है, और नई प्रौद्योगिकियों की संवेदनशीलता उच्च throughput mic के लिए बनाया गयाroplate respirometry. इस उपकरण का एक उदाहरण के बाह्य प्रवाह विश्लेषक है. इस तरह इंस्ट्रूमेंटेशन आमतौर पर तब चयापचय से संबंधित हो सकते हैं जो पक्षपाती कोशिकाओं में इन मानकों में परिवर्तन की दर को मापने के लिए ऑक्सीजन और पीएच संवेदनशील जांच का उपयोग करता है. यहाँ विस्तार से मानव रक्त और इन कोशिकाओं में mitochondrial bioenergetic समारोह के विश्लेषण से, सक्रियण के बिना, monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils और प्लेटलेट्स का अलगाव और चढ़ाना के लिए तरीकों हम. इसके अलावा, हम monocytes और neutrophils में फट ऑक्सीडेटिव भी एक ही नमूनों में मापा जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. इन तरीकों में केवल 8-20 मिलीग्राम मानव रक्त का उपयोग के बाद से वे एक नैदानिक सेटिंग में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों पीढ़ी और bioenergetics की निगरानी के लिए की क्षमता है.
Introduction
प्रतिरक्षा कोशिकाओं (monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils) और रक्त से प्लेटलेट्स की bioenergetic स्वास्थ्य की निगरानी के लिए एक व्यक्ति के समग्र bioenergetic स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए एक संभावित रूप से उपयोगी नैदानिक उपकरण के रूप में कुछ समय के लिए स्वीकार किया गया है. इस तरह के कैंसर, हृदय रोग और mitochondrial रोग 1,2 के लिए neurodegenerative रोगों जैसे रोगों के एक नंबर के हवाले से साहित्य की एक उभरती शरीर है. Mitochondrial रोग समर्थक भड़काऊ संकेत दे रास्ते को बढ़ावा देने या कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कि सेलुलर घटनाओं की एक श्रृंखला शुरू कर सकते हैं क्योंकि यह चिकित्सकीय महत्वपूर्ण है. कई अध्ययनों से ऐसे fibromyalgia, मधुमेह, सेप्टिक सदमे, और अल्जाइमर रोग 3-7 जैसी स्थितियों में परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं और प्लेटलेट्स की mitochondrial समारोह की विशेषता है. उदाहरण के लिए, हाल ही में एक अध्ययन mitochondrial समारोह के लिए एक मार्कर के रूप में प्लेटलेट्स के bioenergetics का मूल्यांकन किया और पाया कि टाइप 2 Diabet से प्लेटलेट्सआईसी रोगियों mitochondrial ऑक्सीजन की खपत 7,8 कम था. इन निष्कर्षों और दूसरों से, यह वे प्रणालीगत संचलन सर्वेक्षण और स्थानीय और वैश्विक चयापचय परिवर्तनों को प्रतिबिंबित कर सकते क्योंकि monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils, और प्लेटलेट्स रोग की स्थिति के तहत bioenergetics में परिवर्तन के रूप में किराए मार्करों सेवा कर सकते हैं कि स्पष्ट है. इस दृष्टिकोण शकुन या नैदानिक मूल्य एक उच्च throughput विश्लेषण की पद्धति और सेल तैयार करने के लिए एक सुसंगत विधि आवश्यक है निर्धारित किया जाए.
leukocytes और प्लेटलेट्स में mitochondrial समारोह को मापने के लिए तरीकों पहले से बरकरार कोशिकाओं 4,9 में सेलुलर bioenergetics के mitochondria या मूल्यांकन के अलगाव शामिल है. एक बाह्य प्रवाह (XF) विश्लेषक का उपयोग सेलुलर bioenergetic मूल्यांकन का लाभ कोशिकाओं में mitochondrial समारोह ऐसे प्रोटॉन रिसाव और अधिक से अधिक श्वसन के रूप में अंतर्जात substrates और श्वसन मानकों के साथ स्थापित किया जा सकता हैक्षमता निर्धारित किया जा सकता है. हम और दूसरों प्लेटलेट्स में bioenergetic प्रोफाइल, मानव रक्त से अलग monocytes और लिम्फोसाइटों स्थापित और सेल प्रकार 8 के बीच में तुलना की जा सकती है कि दिखाने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. इसके अलावा, दोनों neutrophils और monocytes NAPDH oxidases सक्रिय कर रहे हैं, जिसमें एक oxidative फट क्षमता के अधिकारी और superoxide फार्म को ऑक्सीजन की खपत. महत्वपूर्ण बात है, इस मार्ग सहज उन्मुक्ति का एक प्रमुख घटक है और प्रणालीगत सूजन द्वारा संग्राहक है. उदाहरण के लिए, यह ऑक्सीडेटिव फट क्षमता में परिवर्तन एकाधिक काठिन्य, गठिया, और आवर्तक संक्रमण 10,11 के रूप में विभिन्न autoimmune रोग के साथ जुड़े रहे हैं दिखाया गया है. वर्तमान में नैदानिक नमूनों में oxidative फट मापने के लिए कोई उपलब्ध उच्च throughput मात्रात्मक assays कर रहे हैं. Neutrophils और monocytes के ऑक्सीडेटिव फट क्षमता निस्र्पक भी कई patholo के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है क्योंकि यह महत्वपूर्ण हैgies.
प्रमुख तकनीकी चुनौतियों पारंपरिक polarographic तकनीक का उपयोग कर ऑक्सीजन की खपत की माप और अधिक संवेदनशील microplate fluorometric तकनीकों का उपयोग करते समय संलग्न कोशिकाओं का उपयोग करने की आवश्यकता के लिए कम संवेदनशीलता किया गया है. इस व्यावहारिक वीडियो में, हम इन समस्याओं के लिए तकनीकी समाधान का वर्णन. हम विस्तार monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils, और प्लेटलेट्स और monocytes और मानव रक्त से neutrophils की ऑक्सीडेटिव फट के bioenergetics के अलगाव, चढ़ाना और माप के लिए तरीके. यह तरीका है कि जांचकर्ताओं के लिए bioenergetics और oxidative फट के नैदानिक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है एक रोगी जनसंख्या और ताजा रक्त के नमूने प्राप्त करने के लिए क्षमता के लिए उपयोग.
Protocol
रक्त संग्रह, अलगाव और विश्लेषण के लिए इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रोटोकॉल बर्मिंघम में अलबामा के विश्वविद्यालय में समीक्षा की और संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. सेल अलगाव (Histopaque सिग्मा Aldrich प्रोटोकॉल सं 1119 और Miltenyi बायोटेक microbead सकारात्मक और नकारात्मक चयन प्रोटोकॉल से संशोधित)
- एक झूलते बाल्टी रोटर (त्वरण = 5-6, और कोई ब्रेक) के साथ एक अपकेंद्रित्र में 15 मिनट के लिए 500 XG पर (एसीडी या EDTA ट्यूब में एकत्र) अपकेंद्रित्र पूरे रक्त.
- 1 सेमी सेल परत (एरिथ्रोसाइट / Buffy कोट) से ऊपर रहता है जब तक एक हस्तांतरण विंदुक के साथ प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (पीआरपी) है जिसमें ऊपर परत को हटा. बाद में प्रसंस्करण के लिए कमरे के तापमान पर पीआरपी अलग निर्धारित करें.
- एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बफी कोट स्थानांतरण, बेसल RPMI के साथ 24 मिलीलीटर पतला या कम से कम शुरू करने बफी कोट मात्रा 4x को.
नोट: आरबीसी परत के ऊपरी आधे मई घंटेइस आनुपातिक RPMI मात्रा में वृद्धि का परिणाम देगा हालांकि शामिल किया जाना एवेन्यू. - तीन 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (3 मिलीलीटर प्रत्येक) में नीचे की परत के लिए 1.119 (1119) की एक विशिष्ट गुरुत्व के साथ शीर्ष स्तर और उच्च घनत्व Ficoll के लिए 1.077 (1077) की एक विशिष्ट गुरुत्व के साथ कम घनत्व Ficoll का उपयोग घनत्व ढाल तैयार करें. इस चरण को पूरा करने के लिए, पहले प्रत्येक ट्यूब 1077 जोड़ें. एक 5 मिलीलीटर संकीर्ण विंदुक का प्रयोग 1077 के नीचे पिपेट टिप रखकर ट्यूब के नीचे करने के लिए 1119 जोड़ सकते हैं और धीरे - धीरे ऊपरी ढाल के साथ मिश्रण के बिना अभिकर्मक जारी. घनत्व ढाल मीडिया के 6 मिलीलीटर की कुल 3 एमएल निशान पर जुदाई का एक दृश्य चरण के साथ इस स्तर पर मौजूद होना चाहिए.
- एक स्वचालित विंदुक का प्रयोग, धीरे ढाल परतों परेशान करने से रोकने के लिए कम बिजली सेटिंग का उपयोग कर प्रत्येक ढाल ट्यूब (1.3 चरण से) पतला रक्त के 8 एमएल जोड़ने. कुल मात्रा इस चरण में 14 एमएल होना चाहिए.
- कमरे के तापमान (accele पर 30 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूबोंराशन 6, कोई ब्रेक).
नोट: इस चरण में, तीन अलग सेल बैंड स्पष्ट (चित्रा 1 ए) होना चाहिए. (1077 और प्लाज्मा के बीच) ऊपरवाला बैंड polymorphonuclear कोशिकाओं (PMNs) और (1119) से नीचे कम बैंड शामिल mononuclear कोशिकाओं (एमएनसी) और प्लेटलेट्स, और (1007 और 1119 के बीच) मध्य बैंड शामिल लाल रक्त कोशिकाओं में शामिल है. - अन्य सेल बैंड परेशान बिना बाँझ कांच pipettes का उपयोग करके अलग से बहुराष्ट्रीय कंपनियों और PMN लीजिए. एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में प्रत्येक ट्यूब से बहुराष्ट्रीय कंपनी आबादी का मिश्रण. साथ ही PMN आबादी के लिए इस दोहराएँ.
- घनत्व ढाल पतला करने के लिए क्रमश: बहुराष्ट्रीय कंपनी और PMN भिन्न युक्त प्रत्येक ट्यूब RPMI के 4 मात्रा में जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों.
- Resuspend बहुराष्ट्रीय कंपनी सेल गोली और 0.5% अति शुद्ध फैटी एसिड मुक्त BSA (RPMI-बीएसए) युक्त 1 मिलीलीटर RPMI में PMN सेल गोली और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब बाँझ को हस्तांतरण. 30 के लिए एक benchtop picofuge का उपयोग कर गोली कोशिकाओंसेक.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 80 μl RPMI-BSA में प्रत्येक सेल गोली resuspend.
- Monocytes के सकारात्मक चयन के लिए बहुराष्ट्रीय कंपनी अंश युक्त ट्यूब के लिए चुंबकीय मनका लेबल antiCD14 एंटीबॉडी के 20 μl जोड़ें. PMN सेल अंश युक्त ट्यूब के लिए, neutrophils की सकारात्मक चयन के लिए चुंबकीय मनका लेबल antiCD15 एंटीबॉडी के 20 μl जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्रत्येक कक्ष निलंबन सेते
- 1 मिलीलीटर RPMI-बीएसए मीडिया के साथ एक सेल निलंबन धो लें और पहले की गोली और 500 μl RPMI-BSA में प्रत्येक गोली resuspend.
- लेबल कोशिकाओं (एमएसीएस) विभाजक छँटाई चुंबकीय सक्रिय सेल के चुंबकीय क्षेत्र में अलग हो रहे हैं. पूर्व सेल निलंबन जोड़ने के लिए RPMI-बीएसए के 3 मिलीलीटर के साथ एमएसीएस विभाजक और धोने पर स्तंभ रखकर एमएसीएस लोकसभा कॉलम (प्रत्येक कक्ष निलंबन के लिए) तैयार करें.
- सेल निलंबन लगाने के बाद, RPMI-बीएसए मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ 3x (जाने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्तंभ धो मीडिया drain पूरी तरह से washes के बीच). एक बाँझ ट्यूब में सेल निलंबन प्रवाह के माध्यम से और स्तंभ washes लीजिए.
- Monocytes और neutrophils को अलग करने के लिए, अंतिम धोने के बाद चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ को हटाने और स्तंभ सवार का प्रयोग RPMI-बीएसए के 5 एमएल के साथ एक बाँझ ट्यूब में सकारात्मक चयनित कक्षों elute.
- लिम्फोसाइटों 10 मिनट के लिए 300 XG पर कदम 1.15 से बहुराष्ट्रीय कंपनियों के प्रवाह के माध्यम से धोने अंश गोली को अलग. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 80 μl RPMI-BSA में सेल गोली resuspend. CD61 और CD235a एंटीबॉडी के 20 μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेल निलंबन सेते पहले की तरह एमएसीएस जुदाई दोहराएँ और लिम्फोसाइटों युक्त हालांकि प्रवाह इकट्ठा.
- (कदम 1.9) के रूप में पहले monocytes, neutrophils, और लिम्फोसाइटों भिन्न, अपकेंद्रित्र गोली और supernatants त्यागें. सेल छर्रों गिनती के लिए 1 मिलीलीटर बाह्य प्रवाह मीडिया (XF-DMEM) में resuspended किया जाना चाहिए. <br /> नोट: पूरे रक्त के 8 एमएल 1-5 एक्स 10 6 monocytes / एमएल, और 5-20 x 10 6 लिम्फोसाइटों और neutrophils / मिलीलीटर में परिणाम चाहिए.
- कमरे के तापमान पर 1500 XG पर 8-10 मिनट के लिए प्लेटलेट्स, अपकेंद्रित्र पीआरपी (1.2 चरण) को अलग करने के लिए. प्लाज्मा निकालें और पीबीएस 1 ग्राम / एमएल पीजीआई 2, repellet के साथ पूरक बाँझ 5 एमएल के साथ एक बार सेल गोली धोने और पीबीएस पीजीआई 2 बफर के 1 मिलीलीटर में अंतिम गोली निलंबित.
- Walkowiak एट अल द्वारा वर्णित के रूप में प्लेटलेट्स स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा पीबीएस पीजीआई 2 बफर में निलंबित कर रहे हैं एक बार turbidimetry द्वारा प्लेटलेट गिनती का निर्धारण करते निम्न समीकरण का उपयोग कर [6.23 / (2.016 - ABS 800)] - 3.09 एक्स कमजोर पड़ने कारक = # x 10 8. प्लेटलेट्स / एमएल 12.
2. प्रकोष्ठों के चढ़ाना
- सेल तक (सेल चिपकने वाला) की तैयारी: 180 μl 90 μl सेल चिपकने वाला जोड़ें DIH 2 0, 0.1 एन सोडियम द्वि के 540 μlकार्बोनेट (पीएच 8.0), और 1 एन NaOH का उपयोग 7.2-7.8 पीएच को समायोजित करें. तैयार सेल चिपकने के 30 μl के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कोटिंग से एक्सएफ प्लेट (24 अच्छी तरह से, V7 microplates) तैयार करें.
नोट: सेल चिपकने वाला प्रत्येक उपयोग के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. - 20-30 मिनट तो महाप्राण सेल चिपकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं और दो बार पीबीएस के साथ कुओं धोने (1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से).
- पृथक monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils और प्लेटलेट्स पर एक कोशिका गिनती प्रदर्शन और monocytes, लिम्फोसाइटों, और neutrophils के लिए अच्छी तरह से 250K कोशिकाओं / की एक बोने घनत्व की अनुमति के लिए XF-DMEM का उपयोग उचित मात्रा में लाना है, और 25 x 10 6 / अच्छी तरह से प्लेटलेट्स के लिए. वैकल्पिक रूप से, ऑक्सीडेटिव फट प्रतिक्रिया को मापने के लिए, neutrophils 125k कोशिकाओं / अच्छी तरह पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. प्रत्येक सेल निलंबन के लिए अंतिम बोने मात्रा 200 μl / अच्छी तरह से किया जाना चाहिए.
- कोई ब्रेक के साथ 1 सेकंड के लिए 200 XG पर थाली अपकेंद्रित्र. 300 x जी पर कोई ब्रेक के साथ फिर से थाली 180 ˚ और अपकेंद्रित्र घुमाएँ.
- अंतिम अच्छी तरह से वॉल लाओUme XF-DMEM के साथ और पूर्व एक्सएफ परख करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 660 μl के लिए. नोट: मढ़वाया कोशिकाओं से पहले और परख के बाद की photomicrographs पर्याप्त चढ़ाना सुनिश्चित करने और सेल टुकड़ी बाहर शासन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. 24 अच्छी तरह से बाह्य प्रवाह परख प्लेट की तैयारी (XF24)
- हाइड्रेट एक्सएफ पूर्व परख करने के लिए 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए calibrant समाधान के साथ जांच.
- ऊपर के क्रम में कारतूस इंजेक्शन बंदरगाहों में 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल oligomycin के 10x शेयरों में 0.6 माइक्रोन FCCP, और XF-DMEM में 10 माइक्रोन antimycin एक और शेयर समाधान का भार 75 μl तैयार करें. ऑक्सीडेटिव फट माप प्राप्त हो रहे हैं, तो 100 एनजी / एमएल पीएमए के 10x शेयर इंजेक्शन antimycin एक के बाद इंजेक्शन जा सकता है.
- हाइड्रेटेड और लोड कारतूस जांचना और एक्सएफ परख करते हैं. विश्लेषण और ऑक्सीजन की खपत और पीएच दोनों परिवर्तनों की व्याख्या के लिए विस्तृत तरीकों पिछले प्रकाशनों 9,13,14 में वर्णित किया गया है और डी नहीं कर रहे हैंयहां विस्तार से iscussed.
- परख थाली से कोशिकाओं के नुकसान को रोकने और 50 μl RIPA सेल lysis बफर जोड़ने के लिए और सामान्य बनाने के लिए एक प्रोटीन परख प्रदर्शन करने के बाद एक्सएफ परख के बाद, एक्सएफ DMEM के पिछले 50 μl लेकिन सभी aspirate.
Representative Results
रक्त कोशिकाओं के bioenergetics का आकलन करने के लिए, पूरे रक्त एक EDTA या एसीडी vacutainer संग्रह ट्यूब में venipuncture द्वारा मानव विषयों से इकट्ठा किया जाता है. प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप leukocytes और रक्त संग्रह के बाद प्लेटलेट्स के अलगाव चित्रा 1 ए में कल्पना है. पूरे रक्त के नमूनों कोशिका मृत्यु और सक्रियण से बचने के लिए संग्रह की 8 घंटे के भीतर कार्रवाई कर रहे हैं. 8 घंटा से अधिक विस्तारित भंडारण बार परीक्षण नहीं किया गया है लेकिन बदल bioenergetics में परिणाम और शारीरिक स्थिति की कम प्रतिनिधि हो सकते हैं. एसिड साइट्रेट डेक्सट्रोज (एसीडी-8 मिलीग्राम) और EDTA vacutainer ट्यूबों अलग कक्षों की bioenergetic समारोह पर कोई मनाया प्रभाव के साथ सेल isolations के लिए इस्तेमाल किया गया है. थक्के, प्राप्त कोशिकाओं की संख्या कम Ficoll ढाल centrifugation के दौरान उचित चरण गठन के साथ हस्तक्षेप, और centrifuged सीरम में प्राप्त नहीं प्लेटलेट्स के लिए बहुत कम में परिणाम के रूप में anticoagulants जरूरी हैं. सभी रक्त एक biolog का प्रतिनिधित्व करता हैराजनैतिक खतरा और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण सेल आबादी अलग कर रहे हैं या सेल lysates उत्पन्न कर रहे हैं के बाद भी पूरी प्रक्रिया के दौरान लागू किया जाना चाहिए. नमूने संस्था के मानव अपशिष्ट निपटान मानकों के अनुसार निपटाया जा रहे हैं.
पूरे रक्त बफी कोट, leukocytes होता है जो सिर्फ पैक लाल रक्त कोशिकाओं के ऊपर सफेद परत से प्लेटलेट रिच प्लाज्मा अलग करने के लिए centrifuged है. बफी कोट घनत्व ढ़ाल के लिए आवेदन किया और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (monocytes और लिम्फोसाइटों) और polymorphonuclear कोशिकाओं (granulocytes) प्राप्त करने के लिए centrifuged है. व्यक्तिगत बहुराष्ट्रीय कंपनी और PMN सेल चरणों की आरबीसी संदूषण इस स्तर पर आम है और एमएसीएस शुद्धि के दौरान हल किया जाना चाहिए. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं तो शुद्ध भिन्न प्राप्त करने के लिए चुंबकीय एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. Monocytes CD14, टी से प्रवाह के माध्यम से PBMC अंश की ऊष्मायन द्वारा एकत्र कर रहे हैंवह तो लाल रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स की समाप्त हो रहे हैं, जो लिम्फोसाइटों, होते monocytes. neutrophils CD15 एंटीबॉडी (चित्रा 1 ए) के साथ polymorphonuclear सेल परत की ऊष्मायन द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. इसके बाद, प्लेटलेट्स प्लेटलेट रिच प्लाज्मा की centrifugation द्वारा pelleted और अन्य प्लाज्मा घटकों को दूर करने के लिए धोया जा सकता है. इन चुनावों के बाद प्लेटलेट्स, CD14 + monocytes, लिम्फोसाइटों, CD15 + neutrophils bioenergetics और oxidative फट विश्लेषण के लिए एक सेल आसंजन मध्यम लिपटे एक्सएफ विश्लेषक प्लेट पर गिना और चढ़ाया जा सकता है.
प्रक्रिया के प्रत्येक चरण बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए और monocytes और neutrophils में oxidative फट प्रतिक्रिया की समयपूर्व सक्रियण को रोकने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है. बेसल परिस्थितियों में कोई ऑक्सीजन की खपत को कम किया है जो neutrophils, ऊंचा ओसीआर माप के साथ बाह्य प्रवाह परख शुरू जब अलगाव के दौरान बाँझ स्थितियों से कम का एक संकेतक स्पष्ट है किधीरे - धीरे बढ़ाने या परख के दौरान गिरावट. हम सक्रियण का कोई रूपात्मक संकेत पिछले परख करने के लिए हुआ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए 200X या अधिक से अधिक पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं इमेजिंग के महत्व पर जोर. चित्रा 1 बी के रूप में देखा उदाहरण के लिए, neutrophils सामान्य रूप से स्पष्ट सेल सीमाओं के साथ अनियमित आकार में एक गोल प्रदर्शित करते हैं. हालांकि, इन कोशिकाओं को सक्रिय जब प्लेट की सतह के खिलाफ समतल और उनके अलग सेल आकारिकी खो देंगे. हम पहले इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सक्रिय leukocytes और प्लेटलेट्स की morphological परिवर्तन की सूचना दी है और सक्रियण 8 सामना अगर अतिरिक्त उपाय बाँझ शर्तों सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए.
प्रोटोकॉल का एक सरलीकृत योजना सेल अलगाव, एक्सएफ प्लेट तैयार करने, और एक्सएफ परख के प्राथमिक चरणों में विस्तृत कर रहे हैं, जिसमें एक समय तालिका के रूप में चित्रा 2 में देखा जाता है. अलगाव घनत्व ढाल प्रकार की कोशिकाओं की जुदाई और के होते हैंचुंबकीय जुदाई के बाद है. सेल अलगाव प्रक्रिया के समानांतर, एक्सएफ थाली तैयारी सेल चढ़ाना या एक्सएफ परख शुरुआत में देरी से बचने के लिए आवश्यक है. महत्वपूर्ण देरी सेल सक्रियण और कम bioenergetics मापदंडों का कारण बन सकता है क्योंकि यह महत्वपूर्ण है.
अलगाव के बाद अपर्याप्त सेल सांद्रता एक आम समस्या है और प्रत्येक centrifugation प्रक्रिया का अनुकूलन सेल नुकसान से बचने के लिए आवश्यक है कर रहे हैं. सफल isolations रक्त के रूप में छोटे रूप में 6 मिलीग्राम पर प्रदर्शन किया गया है, लेकिन परिवर्तन वांछित सेल प्रकार की सांद्रता परिसंचारी के आधार पर बनाया जा सकता है. घनत्व ढाल अनुचित तरीके से तैयार किया जाता है, तो अलग सेल चरणों दिखाई नहीं हो सकता है और कोशिकाओं की कमी (एक दृश्य प्रदर्शन के लिए जौव अनुदेशात्मक वीडियो देखें) हो सकता है. पीआरपी से अलग अपर्याप्त प्लेटलेट दुर्लभ है, लेकिन अलगाव कमरे के तापमान नीचे जगह लेता है, तो धोने बफर पीजीआई 2 होते हैं या नहीं है अगर हुई है. प्लेटलेट एक का खतराप्लेटलेट्स अलग होने की अंतिम कोशिकाओं रहे हैं अगर ctivation अक्सर रोका जाता है, प्लेटलेट्स विस्तारित अवधि के लिए धोने बफर में रहना हालांकि, अगर bioenergetics प्रभावित हो जाएगा. 1,500 XG centrifugation के दौरान गोली नहीं था और इन कोशिकाओं के bioenergetics बड़े पैमाने विशेषता नहीं किया गया है कि छोटे प्लेटलेट आबादी का उदाहरण दिया गया है. एक और पूरी समस्या निवारण गाइड के लिए 2 टेबल देखें.
leukocytes और प्लेटलेट्स की bioenergetic प्रोफाइल के noninvasively कोशिकाओं में वास्तविक समय ओ 2 खपत जो उपाय एक्सएफ विश्लेषक, का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 3 में दिखाया गया है प्रत्येक कोशिका प्रकार पांच replicates साथ XF24 प्लेट पर चढ़ाया जाता है. तालिका 1 इंगित करता है अच्छी तरह से प्रति परख और औसत प्रोटीन सांद्रता के दौरान सेल प्रकार से उम्मीद बेसल और oxidative फट मूल्यों. उच्च throughput प्रौद्योगिकियों ऐसी के लिए अनुमति देता है जो XF96, के रूप में उपलब्ध हैंचित्रा 3 बी में दिखाया गया है एक साथ मूल्यांकन की चार दाताओं. परख के बाद, डेटा उचित एक्सएफ सॉफ्टवेयर और माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक वर्क स्टेशन कंप्यूटर को निर्यात किया जाता है. ओसीआर मूल्यों के इसी कुओं में कुल प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकृत और pmol / मिनट / मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया. प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रतिनिधि bioenergetic-ऑक्सीडेटिव फट प्रोफाइल को हाल ही में हमारे समूह 8 की सूचना मिली. पहले दिखाया गया और 8 नीचे वर्णित के रूप में परख (बेसल, एटीपी से जुड़े, प्रोटॉन रिसाव, अधिक से अधिक, nonmitochondrial और oxidative फट) के bioenergetic मापदंडों के आगे विश्लेषण व्यक्तिगत कुओं के लिए गणना की जा सकती.
चित्रा -4 ए के रूप में दिखाया बेसल ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) पहले 3 माप द्वारा स्थापित है. Oligomycin (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल), mitochondrial एटीपी synthase के एक अवरोध ओसीआर एटीपी संश्लेषण और प्रतिनिधियों के लिए युग्मित अनुमान लगाने के लिए एक्सएफ माध्यम में इंजेक्ट किया जाता है टेड एटीपी से जुड़े हैं. अवशिष्ट ओसीआर शून्य से nonmitochondrial ओसीआर प्रोटॉन रिसाव के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. फिर FCCP एक uncoupler ऑक्सीजन की खपत की nonmitochondrial स्रोतों का निर्धारण करने के लिए antimycin ए द्वारा पीछा अधिकतम ओसीआर, mitochondrial श्वसन के एक अवरोध, यह निर्धारित करने के लिए जोड़ा गया है. रिजर्व क्षमता ऊर्जावान मांग के तहत उत्पादन किया जा सकता है और श्वसन की अधिकतम दर और बेसल के बीच अंतर के रूप में गणना की जा सकती है कि एटीपी की राशि का एक उपाय है. ऑक्सीडेटिव फट क्षमता का निर्धारण करने के लिए, phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) एक पीकेसी एगोनिस्ट NADPH oxidase गतिविधि बढ़ाने के लिए इंजेक्शन है, और पीएमए उत्तेजना के बाद ऑक्सीजन की खपत दर में वृद्धि एक्सएफ विश्लेषक का उपयोग करके मापा जा सकता है. 4B चित्रा mitochondrial समारोह और oxidative फट के विभिन्न मापदंडों की गणना करने के लिए कैसे दिखा.
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पूरे रक्त से leukocytes और प्लेटलेट्स की चित्रा 1. अलगाव. ए) हौसले से एकत्रित नमूनों centrifugation द्वारा अपने प्लाज्मा और सेलुलर घटकों में विभाजित और Ficoll घनत्व ढाल द्वारा शुद्ध, और प्लेटलेट्स उच्च से अलग कर रहे हैं, जबकि चुंबकीय सक्रिय सेल, सकारात्मक (एककेंद्रकश्वेतकोशिका और न्युट्रोफिल) या नकारात्मक चयन (लिम्फोसाइटों) द्वारा (एमएसीएस) छंटाई कर रहे हैं एक बार एक्सएफ DMEM में resuspended और संकेत सेल घनत्व पर चढ़ाया अलग सेल आबादी की गति प्लेटलेट रिच प्लाज्मा की centrifugation. बी) छवियों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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सेल अलगाव और चढ़ाना और कारतूस हाइड्रेशन और इंजेक्शन बंदरगाह लोड हो रहा द्वारा एक XF24 परख थाली की तैयारी के लिए leukocytes और प्लेटलेट्स की bioenergetic पढ़ाई के लिए XF24 प्लेटों के चित्रा 2. तैयारी. विस्तृत समय.
XF24 और XF96 विश्लेषक प्लेटें. ए) leukocytes (125 250K कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और एक दाता से प्लेटलेट्स (25 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) पर leukocytes और प्लेटलेट्स की चित्रा 3. लेआउट पृष्ठभूमि के बीच XF24 परख थाली पर चढ़ाया जाता है नियंत्रण. 75 oligomycin के 10x स्टॉक्स (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल), FCCP (0.6 माइक्रोन), antimycin-A (10 माइक्रोन) के μl, और एक्सएफ मीडिया में पतला पीएमए (100 एनजी / एमएल) में लोड कर रहे हैंसंकेत इंजेक्शन बंदरगाहों के लिए. बी) leukocytes (75-150k कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और के रूप में कई के रूप में चार दाताओं से अच्छी तरह से 6 कोशिकाओं /) 180 μl XF-DMEM की कुल मात्रा में XF96 पर चढ़ाया जा सकता है प्लेटलेट्स (10 X10. Oligomycin (1.0 माइक्रोग्राम / एमएल) की 10x शेयरों के 20 μl, FCCP (0.6 माइक्रोन), antimycin-A (10 माइक्रोन), और पीएमए XF-DMEM में पतला (100 एनजी / एमएल) ने संकेत इंजेक्शन बंदरगाहों में लोड कर रहे हैं.
Mitochondria और monocytes में oxidative फट द्वारा ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) की चित्रा 4. Bioenergetic सूचकांकों का विश्लेषण. ए) प्रतिनिधि ट्रेस. बेसल ओसीआर (हलकों में संख्या से संकेत पहले 3 दर) की स्थापना की है. Oligomycin के तत्कालीन अनुक्रमिक परिवर्धन (हे, 0.5 ग्राम / एमएल), FCCP (एफ, 0.6 माइक्रोन) और विरोधीMycin ए (ए, 10 माइक्रोन) mitochondrial और nonactivated कोशिकाओं की nonmitochondrial श्वसन निर्धारित करने के लिए इंजेक्शन हैं. अंत में, पीएमए (100 एनजी / एमएल) के संकेत के रूप में mitochondrial समारोह और oxidative फट के मॉड्यूलर विश्लेषण दरों में अंतर से गणना कर रहे हैं) ऑक्सीडेटिव फट. बी को मापने के लिए जोड़ा गया है.
| इष्टतम बोने घनत्व | औसत. बेसल ओसीआर (pmol ओ 2 / मिनट) | औसत. ऑक्सीडेटिव फट ओसीआर (pmol ओ 2 / मिनट) | औसत. प्रोटीन (माइक्रोग्राम) / अच्छी तरह से | |
| Monocytes | 250K कोशिकाओं / अच्छी तरह से | 83.9 (13.0 ±) | 300.3 (58.8 ±) | 19.0 (2.4 ±) |
| 250K कोशिकाओं / अच्छी तरह से | 6.1 (2.2 ±) | 1411.8 (233.3 ±) | 20.6 (2.7 ±) | |
| लिम्फोसाइटों | 250K कोशिकाओं / अच्छी तरह से | 52.9 (7.7 ±) | 15 (4.1 ±) | 13.2 (2.1 ±) |
| प्लेटलेट्स | 25 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से | 199.4 (20.3 ±) | 24 (2.7 ±) | 47.5 (3.1 ±) |
तालिका 1. XF24 परख के लिए सामान्य मानकों: औसत बेसल (दर 3) और oxidative फट (दर 7) ओसीआर nonmitochondrial ओसीआर या प्रोटीन के लिए सही नहीं संकेत सेल घनत्व पर चढ़ाया सेल प्रकार से दिखाया जाता है. एक डीसी लौरी परख द्वारा प्रदर्शन के रूप में अच्छी तरह से औसत प्रति प्रोटीन सामग्री दिखाया गया है. इन आंकड़ों का मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व± SEM युक्त कोष्ठक 6-8 स्वस्थ दाताओं.
| चरण | समस्या | संभावित कारण | समाधान |
| 1.2 | स्पष्ट प्लाज्मा | centrifugation के दौरान pelleted प्लेटलेट्स | 10 मिनट या 400 XG के लिए धीमी गति से करने के लिए centrifugation के समय में कमी |
| दूधिया प्लाज्मा | अतिरिक्त लिपिड | भोजन के बाद का संग्रह से बचने | |
| 1.6 | अधूरा सेल बैंड का गठन | छोटा सा भूतनट ढाल तैयारी, ठंड अभिकर्मक | pipetting, उपयोग कमरे के तापमान अभिकर्मक दौरान ढाल में खलल न डालें से बचने |
| सेल बैंड में clumps | रक्त के थक्के हुई हो सकती है | ऐसे एसीडी या EDTA के रूप में anticoagulants का उपयोग रक्त एकत्र | |
| 1.10 | कोई सेल गोली | कदम 1.6 देखना | सतह पर तैरनेवाला धुंधला नीचे देखते हैं |
| धुंधला सतह पर तैरनेवाला | भारी Ficoll ढाल संदूषण, प्लेटलेट संदूषण | 900 XG, आपदाओं को centrifugation गति बढ़ाएँअधिक RPMI साथ ल्यूट | |
| 1.16, 1.17 | leukocytes की कम उपज | भारी आरबीसी संदूषण, पर्याप्त नहीं पूरे रक्त थक्के | डबल एंटीबॉडी और RPMI-बीएसए संस्करणों, थक्कारोधी जोड़ने, अधिक रक्त एकत्र |
| 1.19 | प्लेटलेट एकत्रीकरण | पीजीआई 2 को छोड़ दिया जाए, ठंड मीडिया, प्लाज्मा में लंबे समय तक भंडारण के लिए जोखिम | प्लेटलेट धोने बफर, उपयोग कमरे के तापमान अभिकर्मकों को पीजीआई 2 जोड़ |
| 1.20 | कम प्लेटलेट गिनती | प्राथमिक centrifugation, प्लेटलेट एकत्रीकरण के दौरान नुकसान | देखना1.2 और 1.19 कदमों |
| 2.3 | आरबीसी संदूषण | एमएसीएस जुदाई दोहराएँ |
तालिका 2. ल्युकोसैट और प्लेटलेट अलगाव समस्या निवारण. तालिका पूरे रक्त और समस्या निवारण की प्रक्रिया के माध्यम से उपयोगकर्ताओं का मार्गदर्शन कर सकते हैं कि समाधान से ल्युकोसैट और प्लेटलेट सेल अलगाव के दौरान आने वाली आम समस्याओं को सूचीबद्ध करता है.
Discussion
इस प्रोटोकॉल bioenergetics विश्लेषण के लिए उपयुक्त ढंग से रक्त कोशिका अलगाव के लिए कई आमतौर पर उपयोग की तकनीक का संकलन का प्रतिनिधित्व करता है. प्रस्तुत सन्निहित तकनीक अलग कक्षों पर रखा गया कम से कम तनाव के साथ नियंत्रित मीडिया की स्थिति में कोशिकाओं की बड़ी संख्या को अलग करने की क्षमता के लिए अन्य अलगाव के तरीके (यानी FACS विश्लेषण) के लिए फायदेमंद हैं. यह भी कम से कम रुकावट के साथ लंबा isolations का नुकसान है. इस प्रोटोकॉल नैदानिक सेटिंग और शोधों में extrapolated किया जा सकता है जो मानव विषयों, से प्राथमिक रक्त कोशिकाओं के अलगाव के लिए आधार के रूप में कार्य करता है.
एमएसीएस जुदाई पूरे रक्त से सीधे कोशिकाओं को अलग करने की संभावना प्रदान करता है कि एक विश्वसनीय सेल अलगाव तकनीक है, लेकिन इस विधि एंटीबॉडी का अधिक से अधिक मात्रा की आवश्यकता है और इस विधि में वर्णित के रूप में सभी चार अलग प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव के लिए इष्टतम नहीं है. बी वहाँ हैeen कोई सबूत नहीं सक्रियण में एमएसीएस जुदाई परिणामों से leukocytes के सकारात्मक चयन हमारे अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर दिखाने के लिए कि. एमएसीएस स्तंभों 50 एनएम superparamagnetic कणों संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कर एक चुंबकीय क्षेत्र में लेबल कोशिकाओं की ज़ब्ती से कार्य करते हैं. लेबल कोशिकाओं तो कॉलम बंद eluted हैं. सकारात्मक और नकारात्मक सेलेक्शन तेजी से अलगाव और शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में लागू कर रहे हैं. अपर्याप्त सेल नंबर अलगाव से प्राप्त या शुद्धता सवाल में है, तो और एंटीबॉडी अधिक से अधिक शुद्धता (तालिका 2) में हो सकता है लोकसभा स्तंभ के माध्यम से विक्रेता की शिक्षा और दूसरा बीतने के अनुसार नमूने के लिए जोड़ा जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला FACS विश्लेषण 8 से अंतिम सेल निलंबन का विश्लेषण करके मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग उच्च शुद्धता और चढ़ाना दक्षता पाया.
बाह्य प्रवाह analyzers ओ.टी. के उस पर वास्तविक समय में ऑक्सीजन की खपत और मीडिया अम्लीकरण दोनों की निगरानी करने की क्षमता हैउसके इलेक्ट्रोड. डीपीआई 8 के साथ अवरोध के रूप में दिखाया monocytes और neutrophils में oxidative फट प्रतिक्रिया द्वारा मनाया के रूप में ऑक्सीजन की खपत NADPH oxidase निर्भर है. हम लंबे समय तक isolations या विस्तारित एक्सएफ assays के साथ ऑक्सीडेटिव फट क्षमता में एक समय निर्भर नुकसान देखा है. इस प्रोटोकॉल डिजाइन और विकसित XF24 पर उपयोग के लिए, लेकिन यह भी लगभग एक तिहाई घनत्व बोने XF24 सेल के एक आधा (चित्रा 3) के लिए XF96 के साथ संगत किया गया था.
इस प्रोटोकॉल के डिजाइन में, प्रत्येक तकनीक के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल के पालन केवल bioenergetic विश्लेषण के लिए मीडिया की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए किए गए संशोधनों के साथ इष्टतम प्रदर्शन के लिए आवश्यक था. तकनीक माहिर के बाद, इस तरह के एक प्रोटोकॉल, उपचार रणनीतियों की विषाक्तता या प्रभावशीलता को मापने की बीमारी की चयापचय विशेषताओं का पता लगाने, और एककेंद्रकश्वेतकोशिका और neut द्वारा ऑक्सीडेंट उत्पादन करने के लिए translational और अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी में इस्तेमाल किया जा सकता हैभड़काऊ शर्तों में rophils.
Disclosures
VDU Seahorse बायोसाइंस वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य है.
Acknowledgments
लेखकों ग्लोरिया एक Benavides के तकनीकी योगदान को स्वीकार करना होगा. इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 13PRE16390001 (एसआर), एनआईएच T32HL07918 (पाकिस्तान), एनआईएच T32HL007457 (टीएम), P30DK056336 (बीकेसी) द्वारा समर्थित किया गया था, NIDDK मधुमेह जटिलताओं कंसोर्टियम (DiaComp, www.diacomp.org) अनुदान DK076169 (subaward VDU), और ओ 'ब्रायन केंद्र P30 DK079337 (वीडीयू).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
| CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
| CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
| CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
| Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
| 1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
| Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
| Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
| XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
| DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
| L-Glutamine, 200 mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
| Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| (FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
| DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
| DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
| QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
| Spectrophotometer |
References
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