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Bioengineering

सेलुलर Mimics के निर्माण के लिए vesicles में सेल मुक्त ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद मशीनरी की इनकैप्सुलेशन

Published: October 21, 2013 doi: 10.3791/51304
Automatic Translation
1, 1, 1
1Centre for Integrative Biology, University of Trento

Summary

इस के साथ साथ हम फफोले, प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी के encapsulation, और प्रोटीन के उत्पादन की निगरानी की तैयारी के लिए सरल विधियों का वर्णन. परिणामस्वरूप सेल मुक्त प्रणालियों जटिल सेलुलर mimics के निर्माण के लिए जिसमें से एक शुरुआती बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

व्यक्तिगत अणुओं से अणुओं की प्रणालियों के लिए ब्याज की पाली के रूप में, प्रयोगशालाओं की संख्या बढ़ बेहतर सेलुलर जीवन की जटिलता का प्रतिनिधित्व करते हैं कि सेलुलर mimics, नीचे से ऊपर का निर्माण करने की मांग की है. पानी में तेल emulsions, microfluidic उपकरणों, और vesicles के शोषण सहित compartmentalized सेलुलर mimics के निर्माण के लिए ले जाया जा सकता है कि रास्तों में से एक नंबर रहे हैं तिथि करने के लिए. उपलब्ध विकल्पों में से प्रत्येक विशिष्ट फायदे और नुकसान है. उदाहरण के लिए, पानी में तेल emulsions उच्च कैप्सूलीकरण दक्षता दे, लेकिन अच्छी तरह से जीवित कोशिकाओं की पारगम्यता बाधा की नकल नहीं है. इस के साथ साथ वर्णित विधि का प्राथमिक लाभ यह है कि वे सभी के लिए आसान और लागू करने के लिए सस्ता हो रहा है. प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी इस तरह के एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण और एक extruder के रूप में आम इंस्ट्रूमेंटेशन, शोषण करने वाली एक प्रक्रिया के माध्यम से फॉस्फोलिपिड vesicles के अंदर समझाया है. प्रतिक्रियाओं प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा निगरानी कर रहे हैं. प्रोटोकॉलएस पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेलुलर mimics के निर्माण, सेलुलर जीवन के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं का अन्वेषण, या आनुवंशिक circuitry के विधानसभा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

सेल मुक्त, इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रियाओं और सिंथेटिक लिपिड से vesicles की पीढ़ी नई बात नहीं है. हालांकि, नकल एक सेलुलर में दो के संयोजन challenging1 -6 काफी अधिक है. ई. T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के साथ या बिना कोलाई सेल अर्क प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी 7,8 के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटीन अभिव्यक्ति और तह सुविधा कर सकते हैं कि अतिरिक्त सेलुलर घटकों की उपस्थिति से सेल अर्क लाभ. वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत रूप से शुद्ध आरएनए और प्रोटीन के अणुओं का मिश्रण, शुद्ध प्रणाली 9 यानी intravesicular प्रोटीन संश्लेषण 4,10-14 मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शुद्ध प्रणाली पूरी तरह से परिभाषित सेलुलर mimics के निर्माण के लिए अनुमति देता है और सेल निष्कर्षों में पाया nuclease गतिविधि से ग्रस्त नहीं है. व्यावहारिक रूप से, यह इस तरह कम कैप्सूलीकरण दक्षता 11 के साथ प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने, बहुत कम डीएनए टेम्पलेट की आवश्यकता है कि इसका मतलब है 16-18 सूचित किया गया है.

प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए सबसे आसान तरीका आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग तत्वों की रोशनी या luminescence के उपाय है. इन विट्रो में प्रतिक्रियाओं अक्सर radiolabeling द्वारा मापा जाता है, हालांकि आमतौर पर, जुगनू luciferase 19 या GFP, उपयोग किया जाता है. प्रतिदीप्ति का पता लगाने के अतिरिक्त जिससे जैविक जैसी प्रक्रियाओं के stochastic प्रकृति में कुछ अंतर्दृष्टि की पेशकश, cytometry आधारित विधियों के माध्यम से फफोले 20,21 की आबादी की निगरानी के लिए अनुमति देता है. इन निगरानी तरीकों मैं के साथ संगत कर रहे हैं कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक संग्रह सहित डिजाइन के नियमों के एक छोटे से सेट और जिसमें से से निर्माण करने के लिए भागों की एक पुस्तकालय, परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद 22, अभिव्यक्ति 22 पर आनुवंशिक संगठन के प्रभाव, सिग्मा कारकों 16 की गतिविधि, और transcriptional terminators के 23 की दक्षता. फिर भी, बहुत विट्रो में उम्मीद के मुताबिक निर्माण की क्षमता, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों को बढ़ाने के लिए किया जाना चाहिए कि वहाँ रहता है.

पुटिका बनाने के लिए उपलब्ध कई तरीके हैं. सबसे आम तरीकों जलीय solution24 में मेजबान द्वारा पीछा एक कांच की सतह पर एक पतली लिपिड फिल्म की पीढ़ी पर निर्भर करती है. जलीय घोल प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी शामिल हैं, उदाहरण के लिए, तो vesicles के एक अंश का गठन प्रोटीन के उत्पादन के लिए आवश्यक घटक शामिल होगा. हालांकि, इस तरह के तरीकों के encapsulation दक्षता vesicles के केवल एक छोटा सा प्रतिशत सक्रिय हैं जिसका अर्थ है कि, कम है. वैकल्पिक तरीकों से कई बहुत अधिक कैप्सूलीकरण eff की विशेषताiciency vesicles के लिए पानी में तेल पायस बूंदों के रूपांतरण का दोहन. यह इस तरह के तरीकों भविष्य में सामान्य हो जाएगा संभावना है, वर्तमान में इन तरीकों के विशेष उपकरण की जरूरत से पीड़ित हैं और बदल झिल्ली रचनाओं के साथ 25 पुटिका दे. पुटिका के तरीकों के लिए पानी में तेल की एक विशिष्ट लाभ झिल्ली lamellarity को नियंत्रित करने की क्षमता है. इस के साथ साथ वर्णित विधि एक अतिरिक्त homogenization के कदम सहित मामूली संशोधनों के साथ Yomo प्रयोगशाला 11 से वर्णित पतली लिपिड फिल्म प्रोटोकॉल पर आधारित है. इस विधि से, आराम से सस्ता है, और अच्छी तरह से प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी के encapsulation के लिए अनुकूल मजबूत पुटिका देता है.

Protocol

1. डीएनए खाका तैयार कर रहा है

  1. ई. का एक मानक प्रयोगशाला तनाव से प्लाज्मिड शुद्ध ऐसे ई. के रूप में कोली, कोली DH5a या एक वाणिज्यिक किट के साथ नोवा ब्लू. वैकल्पिक रूप से, एक रैखिक पीसीआर उत्पाद इसी तरह एक वाणिज्यिक किट के साथ शुद्ध किया जा सकता है. केवल 2 एच ओ के साथ डीएनए Elute.
  2. Phenol के क्लोरोफॉर्म डीएनए समाधान 26 निकालें.
  3. यूवी absorbance या अन्य उपयुक्त तरीकों से जैसे डीएनए एकाग्रता और पवित्रता, निर्धारित करते हैं. यह प्रतिलेखन अनुवाद कुशल के लिए अत्यधिक शुद्ध डीएनए का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.

2. पतला लिपिड फिल्म की तैयारी

  1. शुष्क लिपिड पाउडर वजन और विलायक में भंग. 1 palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3 phosphocholine (POPC) के लिए, शेयर समाधान 40 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में क्लोरोफॉर्म में तैयार कर रहे हैं.
    नोट: कार्बनिक विलायकों हमेशा गिलास pipettes और बोतलों के साथ संभाला जाना चाहिए. दूसरे शब्दों में, प्लास्टिक कभी नहीं किया जाना चाहिए. स्टोर हैअधिमानतः आर्गन के तहत -20 डिग्री सेल्सियस पर हवा तंग, विलायक प्रतिरोधी एम्बर कांच की बोतलों में टॉक समाधान,.
  2. एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में विभाज्य 12 μmol POPC (40 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के 220 μl).
  3. पतली लिपिड फिल्म उत्पन्न करने के लिए एक रोटरी बाष्पीकरण (चित्रा 1) के साथ विलायक लुप्त हो जाना.
    1. सुरक्षित रूप से एक परिपत्र क्लिप के साथ आसवन ट्यूब दौर नीचे कुप्पी देते हैं और कुप्पी के रोटेशन शुरू.
    2. कंडेनसर तार के माध्यम से पानी का प्रचलन आरंभ. क्लोरोफॉर्म 61.2 की एक कम उबलते बिंदु डिग्री सेल्सियस सामान्य वायुमंडलीय दबाव में है क्योंकि एक गर्मी स्नान का उपयोग करना आवश्यक नहीं है,.
    3. प्रणाली पानी निकलने की टोंटी खुली है कि जाँच से वातावरण के लिए खुला है कि सुनिश्चित करें. वैक्यूम पंप को चालू करें और धीरे धीरे प्रणाली को वैक्यूम लागू करने के लिए पानी निकलने की टोंटी बंद.
    4. एक पतली लिपिड फिल्म एक अपारदर्शी फिल्म बनाने रोटरी वाष्पीकरण के दौरान दौर नीचे कुप्पी की दीवारों पर जमा किया जाता हैउस आंख से दिखाई दे रहा है. रोटरी वाष्पीकरण 0.5-2 घंटे के लिए जारी है. इस प्रक्रिया को रोकने के लिए, धीरे से, वैक्यूम दबाव जारी रोटेशन को रोकने, और दौर नीचे कुप्पी हटा दें.

3. लिपिड मेजबान और पुटिका Homogenization

  1. सीधे दौर नीचे कुप्पी में पतली लिपिड फिल्म के लिए 1 मिलीलीटर 18.2 MΩ एच 2 हे जोड़ें. अधिकतम गति पर सख्ती भंवर समाधान, लगभग 3,200 आरपीएम, लिपिड फिल्म आंखों से दिखाई है जो कांच, से detaches तक.
  2. एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में लिपिड फैलाव स्थानांतरण.
  3. सेट अप एक अंगूठी एक 5 मिमी टिप के साथ एक homogenizer धारण करने के लिए खड़े हो जाओ. सुरक्षित लिपिड फैलाव पकड़ को homogenizer के नीचे एक microcentrifuge स्टैंड रखें. 18.2 MΩ एच 2 ओ में नोक डुबो और कुछ सेकंड के लिए चलाकर homogenizer के dispersing तत्व कुल्ला.
  4. वें सुनिश्चित करने लिपिड फैलाव में सीधे dispersing तत्व रखेंनोक पर microcentrifuge ट्यूब के नीचे स्पर्श नहीं करता है. शक्ति स्तर 4 या 14,000 rpm पर 1 मिनट के लिए homogenize.

4. पुटिका बाहर निकालना और lyophilization

  1. एक बाहरी आवरण के होते हैं जो मिनी एक्सट्रूडर (चित्रा 2), और दो ​​Teflon आंतरिक झिल्ली का समर्थन करता है, दो O-अंगूठी, और एक Teflon असर घरों कि एक अनुचर अखरोट के कुछ हिस्सों को इकट्ठा करो.
    1. आंतरिक झिल्ली समर्थन के खांचे में दो O-अंगूठी रखें. Prewet दो फिल्टर और एक 400 एनएम झिल्ली. फिल्टर उन दोनों के बीच झिल्ली के साथ O-अंगूठी के अंदर Teflon के खिलाफ रखा जाएगा.
    2. झिल्ली O-अंगूठी के बीच में दो फिल्टर से घिरे झिल्ली के साथ extruder के बाहरी आवरण में समर्थन करता है रखें. आवरण अंदर Teflon असर प्लेस और अनुचर अखरोट देते हैं और हाथ से कस लें.
  2. दो सीरिंज कुल्ला और 18.2 MΩ पानी के साथ एक भरना. छोटे घंटे में सिरिंज सुई डालेंएक्सट्रूडर विधानसभा के दोनों छोर पर Teflon में Oles. सुई में आसानी से स्लाइड चाहिए, सुई मजबूर नहीं है. एक्सट्रूडर आवास और जकड़ना में सीरिंज के साथ एक्सट्रूडर सुरक्षित.
  3. धीरे धीरे एक सिरिंज के बाहर और दूसरे में पानी धक्का द्वारा extruder के माध्यम से पानी से गुजरती हैं. यह एक मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है. वर्तमान में कोई लीक कर रहे हैं सुनिश्चित करना है कि तीन मार्ग की कुल के लिए दोहराएँ. पानी की सिरिंज निकालें और पानी के निपटान के.
  4. नमूने के साथ एक सिरिंज भरें, extruder के लिए देते हैं, और इसके बाद के संस्करण 4.3 चरण में वर्णित के रूप में धीरे धीरे झिल्ली के माध्यम से पुटिका समाधान गुजरती हैं. 11 अंश की कुल के लिए 10x दोहराएँ. बाहर निकालना प्रक्रिया के रूप में आय, नमूना कम परेशान और झिल्ली भर में पुश करने के लिए आसान हो जाएगा. प्रतिरोध में अचानक कमी, हालांकि, आमतौर पर एक झिल्ली के rupturing इंगित करता है.
  5. Extruded पुटिका समाधान स्थानांतरण और microcentrifuge ट्यूबों में vesicles के 40 μl aliquots बनाते हैं.फ्लैश सूखी बर्फ या तो में या तरल नाइट्रोजन में प्रत्येक विभाज्य फ्रीज.
  6. 30 पर रात भर एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण डिग्री सेल्सियस के साथ प्रत्येक विभाज्य Lyophilize -20 डिग्री सेल्सियस पर lyophilized खाली vesicles के स्टोर

5. ट्रांसक्रिप्शन अनुवाद मशीनरी encapsulating

  1. प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रिया के घटकों के मिश्रण और RNase अवरोध की 20 इकाइयों को जोड़ने. बर्फ पर सेते हैं.
  2. डीएनए टेम्पलेट जोड़ें. एक नियंत्रण प्रतिक्रिया के लिए, 250 एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग mVenus की एनजी या एक T7 ट्रांसक्रिप्शनल प्रमोटर के पीछे एक समान फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक मजबूत ई. कोली राइबोसोम बाध्यकारी साइट की सिफारिश की है.
  3. RNase मुक्त पानी के साथ अंतिम मात्रा 25 μl के लिए ले आओ.
  4. कदम 5.3 में इकट्ठे प्रतिक्रिया के 10 μl के साथ lyophilized vesicles के हाइड्रेट एक विभाज्य (कदम 4.6 से). संक्षेप में भंवर मिश्रण पुटिका resuspended हैं जब तक. यह कम से कम 30 सेकंड लेना चाहिए.
  5. 3 के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया सेते0 मिनट पुटिका प्रफुल्लित करने के लिए अनुमति देने के लिए.
  6. 50 मिमी Tris-एचसीएल, 50 मिमी NaCl, पीएच 7.4 से 27.0 μl और 20.2 मिलीग्राम / एमएल proteinase लालकृष्ण DNase और RNase के 1.5 μl में vesicles के 1.5 μl जोड़कर 30 μl के अंतिम मात्रा से 20 गुना पुटिका मिश्रण पतला proteinase कश्मीर के लिए एक विकल्प extravesicular सामग्री नीचा करने के रूप में भी इस बिंदु पर जोड़ा जा सकता है.
  7. 37 में से कम से कम 2.5 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस

6. माइक्रोस्कोपी

  1. अलग अलग समय बिंदुओं पर vesicles और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन की प्रगति की जांच करते हैं. पुटिका 400 एनएम पुटिका बाहर निकालना के लिए इस्तेमाल किया झिल्ली के ध्यान में लीन होना आकार की तुलना में एक बड़ा व्यास होगा.
    1. एक मानक खुर्दबीन स्लाइड पर एक 20 एक्स 5 मिमी सिलिकॉन स्पेसर रखकर एक नमूना कक्ष तैयार. नमूना कक्ष में vesicles के पिपेट 10 μl. कक्ष के ऊपर एक siliconized गिलास को कवर पर्ची रखें.
    2. एक 63X तेल के फैलाव के साथ ओ पुटिका निरीक्षणशोषण फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग कर उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा आर समान उद्देश्य.

Representative Results

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी extravesicular सामग्री enzymatically अपमानित है क्योंकि कि प्रतिदीप्ति केवल (चित्रा 3), vesicles के अंदर मनाया जाता है पता चलता है. MVenus की अभिव्यक्ति के लिए, intravesicular प्रतिदीप्ति 37 डिग्री सेल्सियस कम 1.5 घंटा पूजा के बाद शुरू होता है और 6 घंटे के भीतर अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता तक पहुँचता है. अधिकतम तापमान और ऊष्मायन समय का इस्तेमाल विशिष्ट निर्माणों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक के तापमान पर निर्भर ढंग से काफी अलग तरह से परिपक्व. दूसरे शब्दों में, प्रोटीन के उत्पादन का अवलोकन प्रोटीन संश्लेषण और तह पर है लेकिन यह भी क्रोमोफोर गठन पर पूरी तरह निर्भर नहीं है. कुल मिलाकर प्रोटीन संश्लेषण प्रतिलेखन और अनुवाद 27 के लिए आवश्यक समाप्त घटकों की एक बाढ़ के लिए अनुमति देने के लिए झिल्ली प्रोटीन pores को शामिल करके बढ़ाया जा सकता है.

यह एक अनुरूप प्रतिलेखन transla बाहर ले जाने की सिफारिश की हैशोषण आनुवंशिक निर्माण कार्यात्मक है कि यह सुनिश्चित करने के लिए vesicles के अभाव में मोर्चे की प्रतिक्रिया. इस नियंत्रण प्रतिक्रिया और अधिक आसानी से प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी बजाय माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी है. चित्रा 4 एक निर्माण एन्कोडिंग mVenus की इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रिया में एक से पता चलता है. Unencapsulated प्रतिक्रियाओं समान intravesicular प्रतिक्रियाओं से काफी ज्यादा कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता दे. कुल intravesicular मात्रा extravesicular मात्रा (यानी एक कमजोर पड़ने प्रभाव) की तुलना में बहुत कम है क्योंकि यह encapsulation के दक्षता की वजह से है और.

चित्रा 1
चित्रा 1. रोटरी बाष्पीकरण और वैक्यूम पंप. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 2. आवास और extruder के कुछ हिस्सों को अलग से दिखाया जाता है. बाएं से दाएं, सिरिंज, अनुचर अखरोट, Teflon असर, आंतरिक झिल्ली एक दूसरे का सामना करना पड़ काला O-अंगूठी, extruder के बाहरी आवरण, और दूसरा सिरिंज के साथ समर्थन करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
. Liposomes में mVenus प्रोटीन के उत्पादन का आंकड़ा 3 प्रतिदीप्ति छवियों ए और सी:.. Multilamellar vesicles के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों 1.5 घंटे और 25 घंटे के बाद बी और और# 160, डी: mVenus का उत्पादन प्रतिदीप्ति (हरे रंग का) 1.5 और 2.5 घंटे के बाद क्रमशः द्वारा कल्पना है. स्केल बार 20 माइक्रोन है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. MVenus की इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद में nonencapsulated की इन विट्रो नियंत्रण प्रतिक्रिया में. प्रतिदीप्ति तीव्रता 4 घंटा से अधिक हर 5 मिनट मापा गया था. डेटा एक वास्तविक समय पीसीआर साधन के साथ हासिल किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

सेल मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, अग्रिम जटिल सेल सिस्टम की तरह बनाया जा सकता है, जिसमें से एक नींव रखी है. पुटिका 28 का पूरी तरह से परिभाषित घटकों 9 अंदर से प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी का पुनर्गठन पर्यावरण की दृष्टि से संवेदनशील कृत्रिम cells17, 18 के निर्माण में बाद में प्रयासों को सुविधाजनक बनाने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण था. इसी तरह, कृत्रिम कोशिका अध्ययन विकासवादी प्रक्रियाओं 4,29,30 की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है, यंत्रवत शाही सेना का विवरण और प्रोटीन संश्लेषण 22,31, चयापचय load32, 33 के प्रभाव, और वायरल कणों की 34 विधानसभा. महत्वपूर्ण बात है, पर्याप्त ज्ञान है कि अब बुनियादी सेलुलर समारोह इन पिछली रिपोर्टों और इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का पालन प्रयोगशाला में vesicles के अंदर का पुनर्गठन किया जा सकता है मौजूद है.

, वर्णित encapsulation के जनसंपर्क आसान होने के अलावाocedure कई फायदे हैं. उदाहरण के लिए, कई खाली, lyophilized पुटिका aliquots के अग्रिम में किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. प्रोटोकॉल कार्बनिक विलायकों, कठोर तापमान में परिवर्तन, या डायलिसिस की लंबी अवधि के अधीन नहीं जैविक अणुओं करता है. हम जरूरत के रूप में प्रक्रिया की नम्रता अतिरिक्त घटकों का समावेश की सुविधा होगी कि उम्मीद है. हम भी encapsulation या प्रतिलेखन अनुवाद दक्षता पर झिल्ली के लिपिड संरचना को बदलने के लिए प्रतिकूल प्रभाव देखा नहीं है. इसलिए, झिल्ली प्रोटीन, विशिष्ट morphologies, या दृश्य का समावेश करने के लिए उत्तरदायी लिपिड क़यास शोषण किया जा सकता है.

वर्णित विधि की प्रमुख सीमा परिणामस्वरूप vesicles के आकार या lamellarity में समरूप नहीं हो रहा है. कई अनुप्रयोगों के लिए, इन कठिनाइयों डेटा की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप नहीं करते. अगर जरूरत हालांकि, अतिरिक्त कदम संकीर्ण वें को शामिल किया जा सकता हैई आकार के वितरण और encapsulation के बाद इस तरह के बाहर निकालना के आगे दौर की झिल्ली की परतों, कमी, फ्रीज विगलन, या डायलिसिस 35. इन और अन्य समस्याओं को दरकिनार कि निस्संदेह बेहतर तरीके से विकसित किया जाएगा. तब तक, हम प्रोटोकॉल अच्छी तरह सेलुलर mimics के निर्माण के लिए अनुकूल होने के लिए यहाँ वर्णित हैं.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों Armenise-हार्वर्ड फाउंडेशन, मैरी क्यूरी Trentino COFUND (एसीएस), ट्रेंटो (Ecomm) के स्वायत्त प्रांत है, और धन के लिए CIBIO को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quick Spin Mini-prep kit Qiagen 27104
Spectrometer NanoDrop 1000 NDB767ND
POPC Avanti Polar Lipids 770557 MW 760 g/mol
Transition Temp -2 °C
CAS# 26853-31-6
Ethanol Sigma Aldrich 459836 Anhydrous, >99.5%
Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use Sigma Aldrich P3803-100mL Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA
Chloroform Biotech Grade Fluka 496189-1L Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer
Brown amber glass bottles VWR 89043-518 55X 48 mm
Rotary evaporator Buchi Rotovapor R-210/Sigma Z563846EU-1EA With jack and water bath, 29/32 joint 240 V
Analog vortex mixer VWR 945300 Speed 1,000-3,200 rpm
Homogenizer IKA T10 Basic Ultra-Turbax 3420000
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610020
Extruder filters Whatman 610014 drain disc 10 mm 
Extruder polycarbonate membrane 400 nm Whatman 61007 nuclepore polycarbonate 
Speed vacuum Labconco 7970011 Centritrap DNA concentrator
PURExpress kit New England Biolabs NRM #E6800S
RNAse inhibitor (40,000 U/ml) New England Biolabs #M0307S
Proteinase K (20.2 mg/ml) Fermentas #EO0491
Microscope Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera
RealTime CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)
Silicon press to seal  -Molecular Probe Life Technologies P18174 Resistant from  -25-30 °C
Siliconized glass circle cover slides Hampton Research HR3-231    Diameter= 22 mm
ImageJ NIH

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References

  1. Forster, A. C., Church, G. M. Towards synthesis of a minimal cell. Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).
  2. Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).
  3. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).
  4. Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes. J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).
  5. Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. Cellular imitations. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).
  6. Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. Approaches to chemical synthetic biology. FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).
  7. Noireaux, V., Shin, J. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).
  8. Fujiwara, K., Nomura, S. -iM. Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells. PLoS ONE. 8, e54155 (2013).
  9. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
  10. Hosoda, K., et al. Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction. Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).
  11. Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes. Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).
  12. Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).
  13. Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
  14. Caschera, F., et al. Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression. Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).
  15. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles. Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).
  16. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).
  17. Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop. Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).
  18. Martini, L., Mansy, S. S. Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression. Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Sunami, T., et al. Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter. Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).
  21. Saito, H., et al. Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes. ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).
  22. Lentini, R., et al. Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. , (2013).
  23. Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase. Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).
  24. Trochilin, V. P., Weissig, V. Liposomes: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (2003).
  25. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  27. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).
  28. Yu, W., et al. Synthesis of Functional Protein in Liposome. J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).
  29. Caschera, F., et al. Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles. Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).
  30. Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism. ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).
  31. Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes. ACS Synth. Biol. 10, (2012).
  32. Stögbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., Rädler, J. Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system. Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).
  33. Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system. BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).
  34. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).
  35. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of Large Monodisperse Vesicles. PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 80 सिंथेटिक जीव विज्ञान न्यूनतम सेल protocell कृत्रिम सेल सेल मुक्त, liposome पुटिका
सेलुलर Mimics के निर्माण के लिए vesicles में सेल मुक्त ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद मशीनरी की इनकैप्सुलेशन
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Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. … More

Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics. J. Vis. Exp. (80), e51304, doi:10.3791/51304 (2013).

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