Summary

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Published: November 03, 2014
doi:

Summary

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Abstract

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Introduction

En este protocolo, se describen los métodos eficaces para inhibir genes en líneas celulares de macrófagos de ratón utilizando siRNAs y controlar los efectos de estos tratamientos en la respuesta inmune innata. Estos procedimientos se realizan en formato de 96 pocillos, lo que permite pantallas de RNAi en la moda de mediano o alto rendimiento.

En respuesta a la infección, los seres humanos montar una respuesta inmune innata inmediata y una respuesta inmune adaptativa más lento pero más específico. Esta rápida respuesta inmune innata implica el reclutamiento y la activación de las células inmunes innatas fagocíticas incluyendo macrófagos 1. Macrófagos activados Clásicamente están implicados en las respuestas inflamatorias agudas y producen proteínas antimicrobianas y compuestos, citocinas y quimiocinas, y presentar antígenos 2,3. Macrófagos alternativamente activados desempeñan un papel en la regulación de la inmunidad, el mantenimiento de la tolerancia, la reparación de tejidos, la curación de heridas y 4-8. Debido a su amplia gama de funciones, Los macrófagos pueden desempeñar un papel en numerosas enfermedades, incluyendo la aterosclerosis, artritis, y cáncer 9. Así, el estudio de los macrófagos ha sido un área clave de la investigación durante algún tiempo en una amplia variedad de campos de la enfermedad.

A pesar de su importancia en la respuesta inmune innata, los macrófagos pueden ser un reto para trabajar con células. En particular, es difícil obtener la transfección eficiente utilizando reactivos de lípidos en los macrófagos sin toxicidad asociada 10,11. Además, incluso cuando siRNA se entrega de manera eficiente a los macrófagos, la robustez del gen inducida por RNAi desmontables a menudo puede ser bastante moderado y puede variar de un gen a gen.

Para superar estos desafíos técnicos, hemos optimizado la transfección y técnicas de derribo 12-16 en dos líneas celulares de macrófagos de ratón, RAW264.7 17 y 18 J774A.1. Este enfoque utiliza el sistema de traslado de 96 pocillos Amaxa Nucleofector para la transfección; este sistemautiliza una combinación de reactivos especializados y electroporación para transfectar células en formato de 96 pocillos 19. Después de la transfección, se describen los métodos para maximizar la recuperación celular y la viabilidad y para maximizar la posterior caída de genes inducida por siRNA. Para ilustrar la utilidad de este enfoque, se describe un protocolo para la entrega siRNA a estas líneas celulares de macrófagos, estimular estas células con lipopolisacárido (LPS), y controlar la respuesta inmune innata en el nivel de producción de varias citocinas pro-inflamatorias. Proporcionamos datos de la muestra en la que se dirigen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR), cuyos miembros detectar LPS y otros patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs), para regular la inmunidad innata.

Protocol

1. Mantenimiento de líneas celulares de macrófagos Crecer RAW264.7 y líneas de células J774A.1 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ºC en presencia de 5% de CO 2. Para ayudar a mantener la esterilidad, añadir 1% de penicilina / estreptomicina (pen / strep) a los medios de comunicación (aunque esto no es estrictamente necesario). Paso crítico: Asegúrese de que los macrófagos están creciendo en un estado saludable para la transfección ef…

Representative Results

Para demostrar la eficacia de la transfección usando este enfoque, que supervisó la captación de ARNsi marcado con FITC utilizando un citómetro de flujo (Figura 1). Para ilustrar la utilidad de nuestro enfoque para el seguimiento de la respuesta inmune innata, transfectadas siRNAs dirigidos a genes reguladores inmunes innatas conocidas en la línea celular de macrófagos RAW264.7, estimulamos las células con LPS, y luego supervisó la producción de las citoquinas pro-i…

Discussion

Numerosos estudios han sido publicados en los que los genes individuales han sido blanco de siRNA en macrófagos murinos. Mientras que la transfección mediada por lípidos ha sido utilizado para entregar siRNA a las líneas celulares de macrófagos sobre una base individual, estos métodos sufren de los efectos potenciales sobre la viabilidad, la caída limitada de genes, y la variabilidad del gen a gen. Para desarrollar ensayos más robustos que podrían ser utilizados para apuntar a genes de la moda de mediano o de a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.

Materials

Amaxa nucleofector 96-well shuttle system Lonza AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit Lonza V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line ATCC TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line ATCC TIB-67
siGenome smartpool siRNA Dharmacon varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool Dharmacon D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electrooration Invitrogen 13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS List Biological Laboratories 421
DMEM, high glucose Invitrogen 11995-065
RPM1-1640 Invitrogen 11875-093
Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) Fisher SV30010
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
96 well tissue culture plates Fisher 07-200-89
96 well round bottom sterile plates (not coated) Fisher 07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY406
Mouse TNFa Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY410
Fluorescein diacetate Sigma-Aldrich F7378
RLT Bufer Qiagen 79216
Rneasy mini kit Qiagen 74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit Invitrogen V-6694

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Cite This Article
De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).

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