Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

Published: February 10, 2014 doi: 10.3791/51307
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

Summary

يمكن أن تقنيات الاستشعار البيولوجي البصرية الكشف عن التغييرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما في الخلايا الحية وتسمح لأحد أن يتبع الاستجابات الخلوية في كل من الخلايا الفردية والسكان الخلايا. ووصف هذا البروتوكول الكشف عن التشكيل قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات في خلايا سليمة إلى جانب استخدام هذا النهج.

Abstract

القنوات الأيونية سيطرة على الخواص الكهربائية للخلايا العصبية وغيرها من أنواع الخلايا منفعل من خلال السماح بشكل انتقائي الأيونات في التدفق من خلال غشاء البلازما 1. لتنظيم استثارة الخلايا العصبية، يتم تعديل خصائص الفيزيائية الحيوية من القنوات الأيونية التي كتبها إشارات البروتينات والجزيئات، والتي غالبا ما ربط قنوات أنفسهم لتشكيل مغايرة التغصن 2،3 معقدة القناة. المقايسات التقليدية دراسة التفاعل بين القنوات والبروتينات التنظيمية تتطلب تسميات الخارجية التي يمكن أن يحتمل تغيير السلوك البروتين وتقلل من أهميتها الفسيولوجية للهدف، مع توفير القليل من المعلومات على مسار وقت التفاعلات في الخلايا الحية. أجهزة الاستشعار البصرية، مثل نظام X-هيئة العلوم البيولوجية BIND سكانر، استخدام خالية من التسمية التكنولوجيا الرواية، صدى الطول الموجي صريف (RWG) أجهزة الاستشعار البصرية، للكشف عن تغيرات في الرنانة الضوء المنعكس بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي. يسمح هذا الفحص الكشف عن النسبيةتغيير في كتلة داخل الجزء السفلي من الخلايا الحية تمسكا سطح جهاز الاستشعار البيولوجي الناتجة عن التغيرات التي يسببها يجند في التصاق الخلية والانتشار، سمية، والانتشار، والتغيرات في البروتين البروتين التفاعلات بالقرب من غشاء البلازما. وقد استخدمت أجهزة الاستشعار البصرية RWG للكشف عن تغيرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا التالية تفعيل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs)، مستقبلات التيروزين كيناز، وغيرها من مستقبلات سطح الخلية. ويمكن أيضا التغييرات التي يسببها يجند في أيون قناة البروتين التفاعلات دراستها باستخدام هذا الاختبار. في هذه الورقة، فإننا سوف تصف إجراء التجارب المستخدمة للكشف عن التشكيل من سلاك-B-تنشيط الصوديوم والبوتاسيوم (K نا) القنوات بواسطة GPCRs.

Introduction

دراسة الخلايا الحية في سياقها ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أمر حاسم لفهم الوظائف البيولوجية للأهداف الخلوية. ومع ذلك، المقايسات دراسة التفاعل بين القنوات وبروتينات حشوية التنظيمية، مثل فحوصات coimmunoprecipitation، وتوفير عموما القليل من المعلومات على مدار الساعة من التفاعلات في الخلايا الحية. غالبية المقايسات خلية مقرها الحالي قياس حدثا الخلوية محددة، مثل إزفاء من البروتين الموسومة fluorescently من الفائدة. هذه المقايسات تتطلب إدخال تعديلات على البروتينات المثيرة للاهتمام، والتي يمكن أن يحتمل تغيير السلوك البروتين وتقلل من أهميتها الفسيولوجية للهدف. المقايسات خلية مقرها موسع، والتي لا تتطلب التلاعب في النظام، وتوفير القياس المستمر من النشاط الخلوي والسماح للخلايا في الدراسات الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الدولة 4.

تم تصميم أجهزة الاستشعار البصرية لإنتاجتغيير قابلة للقياس في سمة من الضوء الذي يترافق إلى السطح الاستشعار. أجهزة الاستشعار البصرية التي تستخدم موجات زائل، والتي تشمل سطح مأكل صدى (SPR) والطول الموجي صدى صريف (RWG) التقنيات، وقد استخدمت في المقام الأول للكشف عن الانتماءات وحركية جزيئات ملزم لمستقبلات بيولوجية عن أداء وظائفها على سطح جهاز الاستشعار. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير أجهزة الاستشعار المتاحة تجاريا RWG للسماح للكشف عن التغير النسبي في الكتلة داخل الجزء السفلي من الخلايا الملتصقة على سطح مستشعر بدقة مكانية عالية (تصل إلى 3.75 ميكرون / بكسل) 5. ويمكن لهذه التغييرات في أجهزة الاستشعار كشف جماعية بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا الحية التي تنتج عن التحفيز، مثل التصاق الخلية والانتشار، سمية وانتشارها ومسارات الإشارات التي تسببها مجموعة متنوعة من مستقبلات سطح الخلية بما في ذلك G-البروتين مستقبلات جانب (GPCRs) 6 . أجهزة الاستشعار RWG كشف تشان النسبيةجنرال الكتريك في مؤشر الانكسار بوصفها وظيفة من التغير النسبي في الكتلة ضمن 150 نانومتر من جهاز الاستشعار البيولوجي 7. عندما ومطلي الخلايا إلى جهاز الاستشعار البيولوجي، وهذا التغير في الرقم القياسي للانكسار يعكس التغير في كتلة بالقرب من غشاء البلازما الخلية الناتجة عن التغير في الانضمام الخليوي الى جهاز الاستشعار البيولوجي. وهذا البروتوكول مناقشة الكشف عن التفاعلات قناة البروتين باستخدام أجهزة الاستشعار RWG.

تتكون مجموعة العمل الخاصة باللاجئين أنظمة الحصول على البيانات من عدة مكونات. لأن X-هيئة العلوم البيولوجية BIND الماسح الضوئي كان يستخدم لهذه التجارب، ونحن يجب الرجوع إلى مكونات هذا النظام على وجه الخصوص، والذي يتألف من قارئ لوحة، أجهزة الاستشعار المرتبطة بها، BIND المسح الضوئي البرمجيات الاستحواذ، وبرامج التحليل BIND عرض 8. وأجهزة الاستشعار الضوئية الكريستال، ويشار إليه فيما بعد أجهزة الاستشعار البصرية و، وتتكون من ترتيب الدوري لعازلة والمادية في 2 أو 3 أبعاد والذي يحول دون انتشار الضوء في محددةموجات والاتجاهات. وتستند هياكل الكريستال الضوئية على ظاهرة تسمى شذوذ وود. اكتشفت لأول مرة من قبل وود في عام 1902، وهذه الحالات الشاذة هي الآثار التي لوحظت في طيف الضوء الذي ينعكس من خلال حواجز شبكية حيود البصرية حيث تحدث تغيرات سريعة في شدة سيما أوامر حيود في بعض نطاقات التردد ضيقة. في عام 1962، قدم هيسيل وOliner نظرية جديدة من الشذوذ وود التي صريف فترة محدودة يولد طول موجة الرنين مكانة 9. في أجهزة الاستشعار البصرية وصفها هنا، وتستخدم الشذوذ وود لإنتاج جهاز الاستشعار البيولوجي RWG أنه عندما حفز مع الضوء الأبيض يعكس سوى نطاق ضيق جدا من الأطوال الموجية (عادة بين 850-855 نانومتر).

تتكون أجهزة الاستشعار الفردية من مادة البلاستيك المنخفض مؤشر الانكسار مع هيكل سطح الدورية التي المغلفة بطبقة رقيقة من ثاني أكسيد عازلة مادة التيتانيوم عالية الانكسار (تيو 2). عندما biosensأو مضاءة مع مصدر ضوء طول موجي واسع، صريف البصرية من البلورات الضوئية ويعكس نطاق ضيق من موجات الضوء التي تقاس في معمل الماسح BIND. ثم يتم حساب كثافة ذروة موجات تنعكس (قمة الطول الموجي القيمة، أو PWV) من إشارة. وPWV من تحولات الضوء على تغيير في معامل الانكسار نتيجة لزيادة أو نقصان في كتلة داخل القرب (~ 150 نانومتر) من سطح جهاز الاستشعار البيولوجي. يتم دمج أجهزة الاستشعار البصرية الى جمعية القياسية للعلوم البيولوجية (SBS) صفيحة ميكروسكوبية 384 جيدا لالمقايسات المستخدمة في هذه التجارب.

وتستخدم أجهزة الاستشعار RWV للكشف عن التغييرات على إضافة الإشارات الخارجية في الخلايا الحية 10. ومثقف الخلايا مباشرة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي RWG ويتم مراقبة التغير في الرقم القياسي المحلي من الانكسار عند العلاج مع المثيرات محددة. اتجاه التغيير في الكتلة في جهاز الاستشعار البيولوجي يمكن أن يكونتحديد، لأن يقاس زيادة في المؤشر المحلي من نتائج الانكسار من زيادة في الكتلة بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي وحيث أن زيادة PWV. على العكس من انخفاض في كتلة تنتج انخفاضا في PWV. التغيير في الكشف عن PWV يمكن أن تنجم عن العديد من الأحداث الخلوية، بما في ذلك التغيرات في التصاق الخلية والبروتين التوظيف / الإفراج عنهم، الإلتقام وإعادة التدوير، إيماس، موت الخلايا المبرمج، وإعادة ترتيب هيكل الخلية. على سبيل المثال، يمكن فحص كشف عن تغيرات في التفاعلات قناة البروتين بين قنوات البوتاسيوم وغيرها من مكونات حشوية أو هيكل الخلية. هذا الحدث، ومع ذلك، يجب أن تحدث داخل منطقة الكشف نانومتر ~ 150 بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي، وفي حالة وجود الخلية المرفقة، بالقرب من غشاء البلازما. يتم تنفيذ اكتساب الاستجابات الخلوية مع BIND المسح الضوئي البرمجيات ويتم إنشاء تمثيل صورة كل من الآبار 384 في لوحة SBS. هذا النظام لديه دقة تصل الى 3.75 ميكرون / بكسل، مما يسمح للكشف عن الأحداث في زنازين انفرادية، ويمكن استخدامها إما مع خطوط الخلايا (مثل الخلايا أو HEK293 CHO) أو مع أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الخلايا الأولية. تحليل الصور مع BIND عرض البرنامج يسمح للكشف عن الاستجابات الخلوية في كل من الفرد والسكان من الخلايا. كما يتم دمج أجهزة الاستشعار في مستوى SBS 384 جيدا microplates، ونظام قابل للتكيف بسهولة لفحص عالية الإنتاجية (HTS).

وقد سبق استخدام الرنين طول الموجة أجهزة الاستشعار البصرية صريف للكشف عن تغيرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا التالية تفعيل GPCRs 11. مختبرنا والمستنسخة اثنين من قنوات البوتاسيوم (K نا) تنشيط الصوديوم، سلاك-B والبقعة 12. وقد تبين أن نشاط كل القنوات سلاك-B والبقعة لتكون بقوة تتأثر التنشيط المباشر للبروتين كيناز C (PKC) 13. تفعيل البروتين Gα ف مستقبلات مزدوجة، مثل مستقبلات المسكارينية M1 وmGluR1 metabotropic الغلوتامات صeceptor، وينظم النشاط أكثر قدرة القناة من خلال تفعيل PKC. هذه القنوات K نا تسهم في التكيف العصبية خلال التحفيز المستمر وتنظيم دقة توقيت العمل إمكانات 14. ومن المعروف أن القنوات الركود للتفاعل مع مجموعة متنوعة من الجزيئات يشير حشوية، بما في ذلك FMRP، والهشة البروتين X التخلف العقلي 15،16. نتيجة طفرات في سلاك في ترحيل متعددة النوبات الجزئية من الطفولة (MMPSI)، وهو شكل بداية مبكرة من الصرع الذي ينتج تأخر في النمو الشديد 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثقافة الخلية (مقتبس من فليمينغ وكازماريك 18)

  1. خلايا الثقافة في وسائل الإعلام الملائمة لأكبر من 2 ولكن أقل من 10 مقاطع قبل استخدامها في هذا الاختبار. تزرع Untransfected HEK-293 الخلايا وHEK-293 الخلايا معربا عن ستابلي الفئران البروتين سلاك-B في واحدة نصف Dulbecco والمتوسطة معدلة النسر ونصف تستكمل يبوفيتش L-15 متوسطة 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني والمضادات الحيوية. يتم إضافة 500 ميكروغرام / مل Geneticin (G418) إلى HEK-293 الخلايا معربا عن ستابلي سلاك-B لتحديد للتعبير عن القناة سلاك. خلايا مرور في 70-90٪ التقاء بواسطة تفارق من الأطباق مع 0.25٪ التربسين-EDTA حل.

2. خارج الخلية مصفوفة (ECM) طلاء من تيو 2 384 جيدا لوحة biosensor البصرية مع فبرونيكتين وألبومين البيض

  1. إعداد خليط فبرونيكتين ECM وألبومين البيض عرقلة الحل
    1. يعد حل عمل fibronectفي في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع تركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين في 20.0 مل PBS. من تركيز الأسهم 1.0 ملغ / مل، إضافة 100 ميكرولتر إلى 20.0 مل PBS لتخفيف 200 أضعاف. الحل عمل فبرونيكتين يمكن aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية بعد التحضير.
    2. إعداد 5٪ محلول المخزون من ألبومين البيض الحرارة المعطل في الماء المعقم. تمييع ألبومين البيض في زراعة الأنسجة المياه الصف عقيمة عن حل 5٪ والحرارة تعطيل لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية. يبرد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة وتصفية العقيمة الحل. قسامة الحل ألبومين البيض 5٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    3. يعد حل العاملة 2٪ من ألبومين البيض عن طريق تمييع 5٪ محلول المخزون في برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، إضافة 12.0 مل من 5٪ محلول المخزون ألبومين البيض إلى 18.0 مل من برنامج تلفزيوني عن الحجم النهائي من 30.0 مل.
  2. 384 جيدا لوحة biosensor البصرية طلاء
    1. هيدرات لوحة تيو 2 مع 20.0 ميكرولتر / جيدزراعة الأنسجة المياه الصف معقمة لمدة 15 دقيقة. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية مع pipettor 16 قناة.
    2. غسل لوحة 1X مع 50.0 ميكرولتر PBS لكل بئر.
    3. إضافة 20.0 ميكرولتر من الحل العمل فبرونيكتين إلى كل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لإنشاء ECM.
    4. غسل لوحة 1X مع 50.0 ميكرولتر PBS لكل بئر.
    5. إضافة 40.0 ميكرولتر من الحل العمل ألبومين البيض إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمنع اللوحة.
    6. غسل 3X وحة مع 50.0 ميكرولتر PBS لكل بئر. ويمكن تخزين ECM المغلفة لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة.

3. البذر من الخلايا الضوئية على جهاز الاستشعار البيولوجي 384 جيدا لوحة

  1. إزالة وسائط النمو من الخلايا وإضافة التربسين لإزاحة الخلايا من لوحة. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة. ازالة وسائل الإعلام التربسين والخلايا resuspend في وسائل الاعلام النمو.
  2. باستخدام عدادة الكريات أو الآليمكافحة الخلايا، تحديد تركيز الخلايا.
  3. للحد من آثار التبخر أثناء التحضين، سيتم استخدام 50.0 ميكرولتر من متوسط ​​النمو لكل بئر. وينبغي أن تضعف الخلايا لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر في حجم 50.0 ميكرولتر من النمو المتوسط. لهذه التجارب، كانت مطلية 1،000 خلية / جيدا على جهاز الاستشعار البيولوجي.
  4. تسمح للخلايا المصنف لاحتضان بين عشية وضحاها في النمو المتوسطة عند 37 درجة مئوية في ظل الجو / 5٪ CO 2.

4. إعداد جهاز الاستشعار البيولوجي ومجمع لوحات لفحص RWG البصرية جهاز الاستشعار البيولوجي

  1. إزالة لوحة من الحاضنة وإزالة وسائط النمو من الخلايا. غسل الخلايا 1x أخرى مع هانكس محلول الملح المتوازن (HBSS). إضافة 25.0 ميكرولتر من HBSS إلى كل بئر.
  2. وضع لوحة جهاز الاستشعار البيولوجي على الماسح BIND وتسمح للخلايا لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة.
  3. إعداد لوحة المركبة منفصلة عن التي بروابط الفائدة سيكون الإعلاندائرة التنمية الاقتصادية على لوحة جهاز الاستشعار البيولوجي أثناء الفحص. لهذه المقايسات، تم إضافة 25.0 ميكرولتر من محلول يحتوي على مركب إلى كل بئر على لوحة جهاز الاستشعار البيولوجي لإجمالي حجم 50.0 ميكرولتر. على هذا النحو، تم إعداد المركبات في حل 2X في التركيز النهائي المطلوب.

5. إجراء الفحص البصري RWG جهاز الاستشعار البيولوجي

  1. أخذ قياس خط الأساس مع نظام الماسح الضوئي للآبار A1-P12 (نصف SBS لوحة 384 أيضا) باستخدام الحد الأقصى من القرار 3.75 ميكرون / بكسل لوسط 1.5 ملم من كل بئر باستخدام برنامج BIND المسح الضوئي. وهذا المسح الأساسية أن تأخذ حوالي 30 دقيقة.
  2. إضافة 25.0 ميكرولتر من الحلول مجمع إلى كل بئر للآبار A1-P12.
  3. أخذ قياس خط الأساس الآبار A13-P24.
  4. إضافة 25.0 ميكرولتر من الحلول مجمع إلى كل بئر للآبار A13-P24.
  5. أخذ القياس بالإضافة مركب آخر للآبار A1-P12، وتكرار للآبار A13-P24.

6. Analysis دمغ المصوغات البيانات مع BIND مشاهدة

  1. فتح البيانات BIND فحص لقياس خط الأساس في نظام التشغيل Windows، وانقر على زر "محرر الشبكة" لتمكين تحديد الخلية. يقوم البرنامج حساب مقاييس المصالح التي يحددها المستخدم.
  2. فتح "بلج انس"، والتي تشمل "الباحث عن خلية" وظيفة "الخط الخلفي". مجموعة المعلمات في "مكتشف الخلية" بحيث خلايا يمكن تمييزها من خلفية جهاز الاستشعار البيولوجي.
  3. تصدير ملف مخطط الخلية التي تحتوي على البيانات "الباحث عن خلية" لقياس خط الأساس.
  4. كرر الخطوات من 6،1-6،2 للبيانات بالإضافة مركب آخر.
  5. فتح "الخط الخلفي" في المكونات واستيراد خريطة خلية من قياس خط الأساس. يقوم البرنامج حساب التحول في PWV بين البيانات الأساسية ومجمع آخر.
  6. حدد "Δ خلية متوسط" لإخراج هذا التحول يعني في PWV للخلايا. ويمكن بعد ذلك يتم تصدير البيانات إلى Microsoft مريض بالحبش لمزيد من التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكانت المصنفة الركود-B ستابلي HEK-293 الخلايا والسيطرة untransfected HEK-293 الخلايا في الخلايا 1،000 / جيدا على 384 جيدا، ECM المغلفة لوحات RWG جهاز الاستشعار البيولوجي. وسجلت الصور من وسط 1.5 مم 2 للجهاز الاستشعار البيولوجي بدرجة وضوح 3.75 ميكرون / بكسل (الشكل 1). وقد تم توليد خرائط التدرج الكثافة الكتلة قبل 30 دقيقة وآخر بالإضافة إلى ذلك المركب مع البرنامج BIND المسح الضوئي. وقد استخدمت BIND عرض البرنامج لتحديد التحول في PWV على GPCR ناهض بالإضافة إلى ذلك بطرح إضافة مركب آخر PWV من PWV خط الأساس.

والذاتية M1 كلوريد المسكارينية ناهض مستقبلات carbamoylcholine (كرباكول) تم تطبيق 19 لكلا السيطرة untransfected HEK-293 والفئران سلاك-B التعبير عن ثابت أدى HEK-293 الخلايا في زيادة إيجابية في PWV (الشكل 2A). وقد أخذت مقاييس في 30 دقيقة، وكانت إشارات طبيعية للتخفيف فقط (HBSS) additiعلى. مقارنة مع الخلايا السيطرة، وكان سلاك-B الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل زيادة أكبر في ذروة التحول في PWV. أظهرت SFLLR-NH 2 trifluoroacetate الملح (SFLLR)، وهو خماسي الببتيد فخ N-المحطة التي يسلك النشاط ناهض ضد النوع من الاختزال البروتيني الذاتية مستقبلات تنشيط 1 (PAR1)، وأيضا الردود التفاضلية في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل untransfected وسلاك-B (الشكل 2B). وتبين هذه النتائج وجود قناة سلاك-B يزيد بشكل كبير من التحول في PWV التي تحدث عند تفعيل GPCRs الذاتية في الخلايا كلوة الجنين البشري، وإثبات جدوى استخدام هذا الاختبار لدراسة التفاعلات قناة البروتين.

الشكل 1
الشكل 1. تحليل الردود الخليوي في BIND عرض. صور الممثل BINDScanner د آتا ل-B سلاك ستابلي HEK-293 الخلايا A) من قبل وB) بعد تحليل الصور مع BIND مشاهدة البرامج "الباحث عن خلية" في المكونات. العتبات وضعت باستخدام "الباحث عن خلية" في المكونات لتحديد الخلايا من الخلفية. ب) المناطق هو مبين في الحمراء في تمثيل بكسل التعرف على أنها تنتمي إلى الخلايا والخطوط الصفراء تمييز الخلايا من لوحة خلفية رمادية. C) وهذا التحول في PWV يدويا للخلايا على SFLLR بالإضافة يتضح من الانحدار اللون، حيث يمثل الحمراء تحولا إيجابيا في PWV والأزرق يمثل اي تغيير. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

00px "/>
الشكل 2. التعبير عن سلاك-B يغير التحول في PWV التالية تفعيل GPCRs. أ) M1 المسكارينية ناهض مستقبلات كرباكول (500 ميكرومتر) أنتج تحولا في PWV التي هي أكبر في السعة في سلاك-B الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل من السيطرة HEK-293 الخلايا ( P <0.0001، N = 16 آبار / حالة). ب) تطبيق SFLLR (10 ميكرومتر)، وهو خماسي الببتيد فخ N-محطة التي يسلك النشاط ناهض ضد النوع من الاختزال البروتيني تنشيط مستقبلات الذاتية 1 (PAR1)، أنتج تحولا في استجابة PWV وهذا هو أكبر في السعة في الخلايا سلاك-B من transfected كلوة الجنين البشري في السيطرة-293 الخلايا (P <0.0001، N = 16 آبار / حالة). سجلت قياسات 30 دقيقة آخر مركب بالإضافة إلى ذلك، وكان تطبيع استجابة ليجند العازلة التحكم فقط. أشرطة الخطأ ± SEM. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ى رئيس (Z ') عامل هو طريقة إحصائية موحدة لقياس نوعية عالية الإنتاجية الفرز مقايسة 20، ولأن الفرز للمنبهات GPCR في هذا الاختبار وقع في SBS متوافق فحص 384 جيدا، ويوفر ممتازة مقياس لقوة وصحة هذا الاختبار 21. قيمة من الألف إلى الياء "من 1 إلى مقايسة مثالية نظريا مع عدد لا حصر له من نقاط البيانات مع الانحرافات المعيارية غير موجود. يعتبر قيمة من الالف الى الياء "من بين 0.5-1 مقايسة ممتازة لأغراض الفرز الفائق الإنتاجية، مع أقل من 0.5 يعتبر فحص بالمعلومات هامشيا. لهذه المجموعة البيانات، وZ 'القيمة المحسوبة باستخدام كرباكول على SFLLR كما الضوابط الإيجابية هو 0.79 و 0.81 على التوالي، مما يدل على هذا الاختبار هو قوي للغاية والنتائج التي تم الحصول عليها هي هامة للغاية.

خارج الخلية مصفوفة طلاء من 384 جيدا لوحة biosensor البصرية، بذر الخلية، وبالإضافة إلى ذلك المركبفي هذه التجارب أجريت يدويا مع 16 قناة Finnpipette (5-50 ميكرولتر). كما يتم إجراء هذا الاختبار على لوحة SBS، الروبوتية أنظمة أكثر تقدما التعامل مع السائل يمكن استخدامها في فحص إنتاجية عالية. ومع ذلك، عندما تكييف نظم مناولة السائل الأجهزة، ينبغي توخي الحذر لضمان أن نصائح ماصة لا تلمس سطح جهاز الاستشعار البيولوجي وهذا سوف يسبب الضرر للجهاز الاستشعار البيولوجي.

عند إضافة مركبات الذائبة في DMSO، يجب إجراء الفحص بحيث يتم عقد تركيز النهائي من DMSO في وسائل الإعلام فحص مستمر لتجنب حدوث تحول في PWV بسبب سمية DMSO إلى الخلية ("الصدمة DMSO"). على الرغم من أن خطوط مختلفة من الخلايا تستجيب بشكل مختلف لDMSO في هذا الاختبار، ونحن نوصي أن تركيز النهائي من DMSO لا تتجاوز 0.1-0.2٪ من حيث الحجم. وينبغي حضنت الخلايا في تركيز النهائي من DMSO في المخزن مقايسة خلال الخطوة موازنة درجة حرارة هذا البروتوكول من أجل تجنب solvenالتحولات التي يسببها ر في PWV.

وهناك مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية، قد يكون درس مع هذا الاختبار، على الرغم من تعظيم الاستفادة من مقايسة لكل خط الخلية يجب أن يؤديها. عند استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، يجب أن يتم تنفيذ تعظيم الاستفادة من عدد من الخلايا وخارج الخلية المصفوفة جهاز الاستشعار البيولوجي مواد الطلاء. وينبغي المصنفة الخلايا في مختلف الكثافات بين 1،000-15،000 خلية / جيدا وتعامل مع ناهض مستقبلات المعروفة لتحديد الكثافة تنتج أعلى Z '. مختلف مواد الطلاء ECM، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر فبرونيكتين، والكولاجين، وlaminin، إما وحدها أو مجتمعة، وينبغي اختبار للتأكد من أن الخلايا تظل ملتصقة إلى جهاز الاستشعار البيولوجي أثناء الفحص. المجاعة الخلية (عدم وجود المصل) قد تؤثر على الاستجابة الخلوية في هذا الاختبار، وكما يمكن إجراء مثل هذه التجارب في المصل خالية وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل لأغراض الفحص الأمثل الأولي. قرار عالية من تسمية BIND ماسحة الحركشف تمكن القياسات استجابة ليكون كميا في منخفض الكثافة الخلوية، منذ تحليل الاستجابات الخلوية يمكن أن يقتصر فقط تلك بكسل اتصلت بها الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، مجموعات سكانية فرعية من الخلايا ضمن خليط غير متجانس يمكن مسور استنادا إلى معايير متعددة (بما في ذلك حجم وقوة التصاق الخلية) وقياس الاستجابات الخلوية الفردية. أخذت معا، وهذه القدرات تجعل مثالية BIND سكانر للفحوصات التي تنطوي على الخلايا المستزرعة الأولية.

نظام الماسح الضوئي BIND يسمح القياسات التي يجب اتخاذها على مراحل زمنية محددة، وبالتالي قياسات الوقت الفاصل بين التغيرات في PWV يمكن تسجيلها. هذا مفيد بشكل خاص لقياس التغيرات في سلوك الخلية التي تحدث على مدى فترات زمنية أطول من تلك التي تعزى إلى التفاعلات قناة البروتين، بما في ذلك تكاثر الخلايا، انقسام الخلايا، والهجرة الخلية. ربط مشاهدة البرنامج يسمح لتحليل هذه الاستجابات الخلوية، ويمكن تحديد العديد من parameteالتمرير من التغيرات في بنية الخلية، بما في ذلك التغيرات في الانضمام الخلية، والتغيرات في حجم الخلية، والتغيرات في حركة الخلية، مما يسمح كل من التحليل الكمي والوقت الفاصل بين التصوير من هذه الأحداث. على سبيل المثال، وهذا النظام يمكن أن تستخدم لتحديد سعر الليفية التي تستجيب لعامل النمو يشير من خلال تتبع معدل الهجرة الخلية عبر بئر الفردية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ستيفن M. شامة هو موظف من X-هيئة العلوم البيولوجية.

Acknowledgments

المؤلفون ممتنون للدكتور يانغ يانغ يان في مختبر الدكتور فريد Sigworth في جامعة ييل للتبرع السخي من الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت الفئران البروتين سلاك-B. وبالإضافة إلى ذلك الكتاب ممتنون للدكتور Sigworth عن البرد الإلكترون المجهري نموذج التماثل من سلاك عرض في مقدمة الفيديو. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DH067517 وNS073943 إلى LKK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, High Glucose Life Technologies 11965-092
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415-064
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Geneticin G-418 Sulfate American Bioanalytical AB05057
HBSS Life Technologies 14025-092
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Albumin from chicken egg white Sigma-Aldrich A5378
DPBS Life Technologies 14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6
Carbamoylcholine chloride Sigma-Aldrich C4382
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt Sigma-Aldrich S8701
Finnpipette (5-50 µl) Thermo Scientific 4662090
BIND Scanner System X-BODY Biosciences N/A
384-well TiO2 coated plates X-BODY Biosciences TiO-96-CM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
  2. Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
  3. Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
  4. Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
  5. Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
  6. Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
  7. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
  8. Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
  9. Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
  10. Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
  11. Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
  12. Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
  13. Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
  14. Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
  15. Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
  16. Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
  17. Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
  18. Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
  19. Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
  20. Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  21. Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 84، وقنوات ايون، قناة البوتاسيوم، سلاك، G-بروتين المستقبلات إلى جانب (GPCRs)، خالية من التسمية الفرز، والفرز الفائق الإنتاجية (HTS)، والتفاعلات قناة البروتين، أجهزة الاستشعار البصرية
استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, M. R., Shamah, S. M.,… More

Fleming, M. R., Shamah, S. M., Kaczmarek, L. K. Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (84), e51307, doi:10.3791/51307 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter