Summary
光学生物传感器技术可检测的变化在质量近质膜在活细胞中，并允许1到跟随在这两个单个细胞和细胞群的细胞反应。这个协议将描述检测钾通道通过使用这种方法的G蛋白偶联受体在完整的细胞调制的。
Abstract
离子通道通过选择性地允许离子流通过质膜1控制神经元和其它可兴奋细胞类型的电性能。来调节神经细胞的兴奋性，离子通道的生物物理学性质通过信号转导蛋白和分子，这常常结合到通道本身以形成异聚复合信道2,3修改。传统的分析检查通道和调节蛋白之间的相互作用需要外源性标记，可以潜在地改变蛋白质的行为和减少靶的生理相关性，同时提供的信息很少的相互作用的时间过程中的活细胞。光学生物传感器，如X-BODY Biosciences公司的BIND扫描系统，使用了一种新的无标记技术，谐振波长光栅（RWG）的光学生物传感器，以检测共振改变反射光接近传感器。该测定法允许的相对的检测活细胞粘附于从细胞粘附配体诱导的变化和扩展性，毒性，增殖，并改变蛋白质 - 蛋白质相互作用的靠近质膜产生的生物传感器表面的底部部分内的质量变化。 RWG光学生物传感器已用于以下激活G蛋白偶联受体（GPCR），受体酪氨酸激酶，与其他细胞表面受体来检测附近的细胞的细胞膜的变化质量。在离子通道蛋白相互作用的配体诱导的变化，也可以使用该测定法的研究。在本文中，我们将描述用于检测臂-乙酸钠活化的钾（K Na）的通道由G蛋白偶联受体的调节的实验步骤。
Introduction
在他们的生理有关的上下文检查活细胞关键的是要了解目标细胞的生物学功能。然而，实验研究渠道和监管细胞质蛋白，如免疫沉淀测定法之间的相互作用，通常提供的信息很少在活细胞相互作用的时间过程。大多数当前的基于细胞的测定法测定特异性细胞事件，例如感兴趣的荧光标记蛋白的易位。这些测定中所需要的感兴趣的蛋白质的修饰，这可以潜在地改变蛋白质的行为和减少靶的生理相关性。非侵入性的基于细胞的测定法，它不需要操纵系统，提供细胞活性的连续测定，并允许细胞的研究，在其最生理学相关的状态4。
光学生物传感器的设计，生产一个可测量的变化在被耦合到所述传感器表面的光的特性。光学生物传感器，利用渐逝波，其中包括表面等离子体共振（SPR）和谐振波长光栅（RWG）技术，已被主要用于检测分子结合到其固定在传感器表面上的生物受体的亲和力和动力学。最近，市售的RWG生物传感器已被开发，以使细胞附着在传感器表面上的高空间分辨率（高达3.75微米/像素）5的底部部分内的质量的相对变化的检测。这些生物传感器可以检测到附近的活细胞所导致的刺激作用，如细 胞粘附和铺展性，毒性，增殖和由多种细胞表面受体，包括G蛋白偶联受体（GPCRs）的诱发信号转导通路的质膜变化6质量。 RWG生物传感器检测的相对瓒格中折射的作为内传感器7为150nm的质量的相对变化的函数的索引。当细胞接种到生物传感器，这种变化在折射指数反映的质量变化从靠近在蜂窝粘附到所述生物传感器的变化而产生的细胞的质膜上。该协议将讨论使用RWG生物传感器通道蛋白质相互作用的检测。
RWG数据采集系统由几个部分组成。因为X-BODY Biosciences公司BIND扫描仪被用于这些实验中，我们将参照部件为这个特定的系统，它由一个平板阅读器，相关联的生物传感器，BIND扫描采集软件，和BIND查看分析软件8。光子晶体生物传感器下文提及光学生物传感器组成之一个周期性排列以电介质材料2或三个维度可防止光传播特定波长和方向。光子晶体结构是基于这种现象叫伍德的异常。首先由伍德在1902年发现，这些异常都是在光的地方在特定衍射级的强度迅速变化发生在某些窄频带光衍射光栅反射光谱观察到的效果。 1962年，和•海斯尔提出Oliner木材的异常现象的新理论在有限的时间内光栅产生一个常设的谐振波长9。在这里所描述的光学生物传感器，伍德异常被用来产生一个RWG生物传感器的，当用白光刺激仅反映非常窄的波长频带（通常介于850-855纳米）。
个体的生物传感器包括一个低折射率的塑料材料与涂有薄薄的一层高折射电介质材料的二氧化钛（TiO 2的）的周期性表面结构。当BIOSENS或者被点亮以宽广的波长的光源，光子晶体的光学光栅反射一个狭窄的范围内这是用分光光度计在BIND扫描仪测量的光的波长。反射的波长（峰值波长值，或PWV）的峰强度，然后从该信号来计算。的光的变化后，在折射率变化的PWV作为生物传感器表面附近内的增加或减少的质量（〜150纳米）的结果。光学生物传感器被纳入一个标准学会生物分子科学（SBS）384 - 孔微量培养板用于这些实验中使用的测定法。
RWV生物传感器被用于在添加外源的信号来检测活细胞中的变化10。细胞直接培养到RWG生物传感器的表面，并且在折射的本地索引的变化是在与特定的刺激治疗监测。质量变化在生物传感器的方向可以是决定的，因为增加从附近的生物传感器的质量增加验光结果和本地索引是按增加PWV。相反，在大规模的减少产生的PWV下降。在检测到的脉搏波速度的变化会导致从众多的细胞事件，包括改变细胞粘附，蛋白质招募/释放，细胞内吞作用和回收，胞吐作用，细胞凋亡和细胞骨架重排。例如，该测定可检测钾通道和其它细胞质或细胞骨架成分之间变化的信道 - 蛋白质相互作用的。的情况下，但是，必须发生在接近传感器的〜150nm的检测区域内，并在附属小区，靠近质膜的情况下。采集细胞反应进行与BIND软件扫描并生成每个384口井的SBS板的图像表示。该系统具有高达3.75微米/像素的分辨率，可检测单个细胞的活动，并既可以用于与细胞系（例如HEK293或CHO细胞），或与多种生理上相关的原代细胞。在BIND View软件图像分析允许个人和细胞群体中的细胞反应的检测。作为生物传感器结合到标准的SBS 384孔板，该系统易于适应高通量筛选（HTS）。
共振波长的光栅的光学生物传感器已使用过以下激活的GPCR 11来检测附近的细胞质膜质量变化。我们实验室已经克隆了钠激活（K Na）的钾通道，斯莱克-B和油滑12。两个臂-B和油滑通道的活性已被证明是非常强烈的直接激活蛋白激酶C（PKC）13的的影响。 Gαq蛋白偶联受体，如M1毒蕈碱受体和mGluR1的代谢型谷氨酸为r的活化eceptor，有力地通过PKC活化调节通道活性。这K个钠通道有助于神经细胞适应持续刺激期间和调节动作的定时的准确度电势14。松弛渠道已知与多种胞质信号分子，包括FMRP，脆性X智力迟钝蛋白15,16的相互作用。突变松弛导致婴儿期（MMPSI），癫痫的早期发作的形式导致严重的发育迟缓17多个迁移部分性发作。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。细胞培养（从弗莱明和卡兹玛瑞克18改编）
- 培养的细胞在适当的介质为大于2且小于10的通道在该试验中使用之前。未转染的HEK-293细胞和HEK-293细胞的稳定表达大鼠松弛-B蛋白质是生长在一个半Dulbecco改良的Eagle培养基中，另一半Leibovitz的L-15培养基补充有10％热灭活的胎牛血清和抗生素。 500微克/毫升的遗传霉素（G418）加入到HEK-293细胞的稳定表达松驰-B来选择的时差信道的表达。传代细胞在70-90％汇合时通过离解离的菜肴用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液。
2。在TiO 2 384孔的光学生物传感器板与纤维连接蛋白和卵清蛋白的细胞外基质（ECM）涂层
- 纤连蛋白的ECM混合物和卵清蛋白封闭液的制备
- 准备fibronect的工作液在磷酸盐缓冲盐水（PBS）与20.0毫升的PBS 5微克/纤连蛋白毫升的最终浓度。从1.0毫克/毫升的浓度股票，加入100微升至20.0毫升的PBS为200倍稀释。纤连蛋白的工作液可以在制备后进行等分并储存在-20℃。
- 制备在无菌水热失活的卵清蛋白的5％的原液。在无菌组织培养级水稀释卵清蛋白为5％的溶液，并在60℃下热灭活30分钟冷却该溶液至室温，并无菌过滤的溶液。分装在4℃的5％卵清蛋白溶液与存储
- 通过稀释5％的储备溶液至PBS制备的卵清蛋白的2％工作液。例如，添加12.0毫升的5％卵清蛋白原液到18.0毫升的PBS为30.0毫升的最终体积。
- 384孔光学生物传感器板涂层
- 与20.0微升/孔的水合TiO 2的板的无菌组织培养级水中15分钟。下面的步骤应该具有16通道移液器进行。
- 与50.0微升PBS，每孔洗板1X。
- 添加20.0微升的纤连蛋白工作液到每个孔中并孵育2小时，在室温下创建的ECM。
- 与50.0微升PBS，每孔洗板1X。
- 添加40.0微升卵清蛋白工作液到每个孔中并孵育过夜，在4℃阻断板。
- 与50.0微升PBS，每孔洗板3倍。 ECM包被的板可以被存储在4℃下长达48小时。
3。细胞接种到384孔的光学生物传感器板
- 从细胞中除去生长培养基，并添加胰蛋白酶到从板移去细胞。收集细胞并离心以1,000×g离心1分钟。取出胰蛋白酶媒体和悬浮细胞在生长培养基。
- 使用血细胞计数器或自动细胞计数，测定细胞的浓度。
- 以减少蒸发的温育过程中的影响，50.0微升每孔的生长培养基将被使用。细胞应稀释至达到每孔细胞中的50.0微升生长培养基的体积所需的号码。对于这些实验，1,000个细胞/孔接种到生物传感器。
- 使接种的细胞在空气/ 5％CO 2下过夜孵育在生长培养基中，在37℃。
4。生物传感器和复合板的RWG光学生物传感器测定的制备
- 从培养箱中取出盘子并从细胞中除去生长培养基。洗涤细胞1倍，用Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。添加25.0微升HBSS中的每个孔中。
- 将生物传感器板上的BIND扫描器和使细胞平衡至室温1-2小时。
- 准备一个单独的复合板从利益的配体将是广告在试验过程中副执行干事到生物传感器板。对于这些测定，25.0微升含有溶液的化合物加入到每个孔中的生物传感器板为50.0微升的总体积。因此，在溶液中的化合物的2倍的所需最终浓度制备。
5。执行RWG光学生物传感器测定
- 采取的基线测量使用的3.75微米/像素的最大分辨率为中央1.5毫米每个使用BIND扫描软件很好的扫描仪系统，用于井A1-P12（在SBS 384孔板的一半）。这个基线扫描大约需要30分钟。
- 添加25.0微升的化合物溶液，每孔为孔A1-P12。
- 利用井A13-P24基线测量。
- 添加25.0微升的化合物溶液，每孔为孔A13-P24。
- 对井A1-P12后加入化合物计量，并重复井A13-P24。
6。一化验数据的nalysis与BIND查看
- 打开Bind分析数据，可在Windows的基线测量，并单击“网格编辑器”按钮，使小区选择。该软件将计算出由用户定义的兴趣量度。
- 打开“插件”，其中包括“手机搜索”和“底线型”功能。在“小区搜索”设置参数，使得细胞是来自生物传感器的背景区分开来。
- 导出其中包含“手机搜索”的数据为基准测量单元映射文件。
- 重复步骤6.1-6.2对复合后的另外的数据。
- 打开“底线型”插件，并从基线测量导入细胞的地图。该软件将计算出的背景和复合后的数据之间的转变PWV。
- 选择“Δ细胞平均”的意思转变为PWV电池的输出。这些数据可以被导出到Microsoft EXCEL作进一步分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
松弛-B稳定转染的HEK-293细胞，并控制未转染的HEK-293细胞接种于1000个细胞/孔于384孔，ECM涂覆的RWG生物传感器板。从中央1.5生物传感器的毫米2的图像被记录，分辨率为3.75微米/像素（ 图1）。质量密度梯度图生成和前30分钟后加入化合物与BIND的扫描软件。 BIND的查看软件被用来确定在G蛋白偶联受体激动剂除了此消彼长PWV减去PWV后加入化合物从基线PWV。
内源性毒蕈碱M1受体激动剂carbamoylcholine氯化物（氯化氨甲酰胆碱）19被施加到两个未转染的对照的HEK-293和大鼠松弛-B稳定表达的HEK-293细胞中导致PWV（ 图2A）的正增长。测量是在30分钟和信号被归一化到缓冲区只（HBSS）additi上。相较于对照细胞，松弛-B转染的细胞具有峰值移位PWV上升幅度较大。 SFLLR-NH 2三氟乙酸盐（SFLLR），N-末端五肽TRAP它显示激动剂活性对抗内源性GPCR的蛋白酶活化受体1（PAR1），也表现出在未转染的和松驰-B转染的细胞（ 图2B）的不同反应。这些结果表明，松弛-B信道的存在显著增加了发生在激活内源性GPCR的在HEK细胞的移位在PWV，并且证明了用该试验来研究信道 - 蛋白质相互作用的可行性。
图1。分析BIND查看细胞反应。BINDScanner的D代表图像 ATA松弛-B稳定转染HEK-293细胞A）之前和B）图像分析与BIND View软件“手机搜索”插件后。阈值是手动设置利用“手机搜索”插件，以确定从背景。B细胞）中以红色显示代表鉴定为属于细胞和黄线的像素区域区分细胞从灰板的背景。C）的 PWV的转变对于SFLLR后加入细胞所表现出的颜色渐变，其中红色代表PWV和蓝色的积极转变表示没有变化。图中标尺为100微米。 点击这里查看大图 。
00px“/>
图2。斯莱克-B的表达改变以下激活G蛋白偶联受体A）的货币供应量M1毒蕈碱受体激动剂氨甲酰胆碱（500微米）产生了移位的PWV是更大的幅度在农闲-B转染的细胞比对照HEK-293细胞的转移PWV（ SFLLR（10微米），N端陷阱五肽表现出激动剂活性对G蛋白偶联受体的内源性蛋白酶激活受体1（PAR1）的P <0.0001，N = 16孔/条件）B）应用，产生PWV响应的转变这是更大的振幅在松驰-B-转染的细胞比对照HEK-293细胞（P <0.0001，n = 16个孔/条件）。测量记录30分钟后加入化合物和配体反应被归到缓冲区只控制。误差线为±SEM。 点击这里查看大图 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在Z素（Z'）的因素是量化的高通量筛选测定法20的质量的普通统计方法，并且因为G蛋白偶联受体激动剂在此测定法的筛选中发生一个SBS兼容384孔分析，提供了极好的衡量这个实验21的鲁棒性和有效性。 1 A-Z'值表示理论上的理想实验与数据点与不存在的标准偏差无限多。 0.5-1之间AZ'值被认为是一个很好的检验为高通量筛选的目的，用低于0.5被认为是轻微翔实的分析。对于这个数据组，计算出的Z'值利用卡巴胆碱的SFLLR作为阳性对照分别为0.79和0.81，这表明该测定是高度可靠的和得到的结果是高度显著。
384孔光学生物传感器板，细胞接种和复合添加细胞外基质涂层这些实验中，用一种16通道Finnpipette（5-50微升）手动进行。作为该测定的是，SBS板进行的，更先进的机器人液体处理系统可以在高通量筛选中使用。然而，适应系统的液体处理仪器时，应当谨慎行事，以确保移液器吸头不要接触生物传感器表面，因为这会造成损害的生物传感器。
当加入溶于DMSO中的化合物，该法必须执行，使DMSO在检测培养基中的最终浓度保持恒定，以避免在PWV变化由于DMSO毒性的细胞（“DMSO冲击”）。虽然不同细胞系的差异响应于DMSO中在该试验中，我们建议的DMSO的最终浓度不超过容积的0.1〜0.2％。细胞应在本协议的温度平衡步骤，以避免瑟尔孵育在DMSO在测定缓冲液中的最终浓度的T诱导的变化在PWV。
细胞，包括原代细胞，有不同尺寸可以研究了该测定中，虽然必须进行测定每个细胞系的优化。当使用不同类型的细胞，应进行细胞和细胞外基质的生物传感器的表面涂料的数量最优化。细胞应接种不同密度1,000-15,000个细胞/孔之间以及与已知受体激动剂，以确定哪些生产密度最高的Z'处理。各种细胞外基质的表面涂层，包括但不限于纤连蛋白，胶原蛋白，层粘连蛋白和单独或组合地，应当为确保在试验过程中保持细胞粘附到所述生物传感器测试。细胞饥饿（缺乏血清的）可影响细胞应答在该测定中，并作为这样的实验可以在无血清和含血清的培养基测定初始优化目的来进行。高分辨率的扫描仪的BIND的自由标签检测使响应测量在低细胞密度进行量化，由于细胞应答的分析可以被限制为仅由细胞接触的像素。此外，细胞内的异质混合物的亚群可以基于多种参数（包括大小和细胞的粘附强度）门控和测量单个细胞应答。总之，这些功能使BIND的扫描仪非常适合涉及原代培养细胞实验。
BIND的扫描仪系统允许采取在指定的时间，路线测量，并因此改变PWV的延时测量可以被记录下来。这是用于测量所发生的超过比那些由于信道 - 蛋白相互作用，包括细胞增殖，细胞分裂和细胞迁移的更长的时间周期中的细胞行为变化是特别有用的。 BIND的查看软件允许这样的细胞反应的分析，并且可以量化各种说明参数改变细胞结构，包括改变细胞的黏附，改变细胞体积，并改变细胞的运动，使定量分析，而这些事件的时间推移成像的RS。例如，该系统可以被用来确定哪些成纤维细胞生长因子，通过跟踪细胞迁移的速率穿过个体以及信令作出响应的速度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
史蒂芬M. Shamah为X-BODY Biosciences公司的雇员。
Acknowledgments
作者感谢养养眼博士在弗雷德Sigworth博士在耶鲁大学的HEK293细胞稳定表达大鼠斯莱克-B蛋白质的慷慨捐赠实验室。此外，作者感谢Sigworth博士在视频介绍中显示松弛的低温电子显微镜同源模型。这项研究是由美国国立卫生研究院资助DH067517和NS073943到LKK支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
