Summary
Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método.
Abstract
Canais iônicos controlar as propriedades elétricas dos neurônios e outros tipos de células excitáveis, permitindo seletivamente íons a fluir através da membrana plasmática 1. Para regular a excitabilidade neuronal, as propriedades biofísicas de canais de iões são modificadas por proteínas e moléculas de sinalização, o que muitas vezes se ligam aos próprios canais de modo a formar um complexo do canal heteromérico de 2,3. Ensaios tradicionais que examinam a interacção entre os canais e as proteínas reguladoras requerem rótulos exógenos que podem potencialmente alterar o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo, enquanto proporciona pouca informação sobre o curso de tempo de interacções em células vivas. Biossensores ópticos, como o sistema X-CORPO Biociências BIND Scanner, usar uma tecnologia sem rótulo novela, ressonância comprimento de onda grade (GRT) biossensores ópticos, para detectar mudanças na luz refletida ressonante perto do biossensor. Este ensaio permite a detecção da relativaalterar em massa no interior da porção inferior das células vivas aderentes à superfície do biossensor, resultante do ligando alterações induzidas na adesão celular e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação, e as alterações nas interacções proteína-proteína, perto da membrana do plasma. RWG biossensores ópticas têm sido utilizadas para detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a activação de receptores acoplados à proteína (GPCRs), tirosina-quinases receptoras, e os outros receptores da superfície celular. As alterações induzidas pelo ligando de iões de interacções proteína-canal também pode ser estudada utilizando este ensaio. Neste artigo, vamos descrever o procedimento experimental usado para detectar a modulação da Slack-B potássio ativado por sódio (Na) K canais por GPCRs.
Introduction
Examinando as células vivas em seu contexto fisiologicamente relevante é crucial para entender as funções biológicas de alvos celulares. No entanto, os ensaios que examinam a interacção entre os canais e as proteínas citoplasmáticas de regulação, tais como ensaios de coimmunoprecipitation, geralmente fornecem pouca informação sobre o curso de tempo de interacções de células vivas. A maioria dos ensaios com base em células de corrente mede um evento celular específico, tal como a translocação de uma proteína de interesse fluorescente etiquetado. Estes ensaios requerem modificações das proteínas de interesse, o que pode, potencialmente, alteram o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo. Ensaios baseados em células não-invasiva, que não requerem a manipulação do sistema, proporcionam uma medição contínua da actividade celular e permitem estudos de células na sua mais fisiologicamente relevante estado 4.
Biossensores ópticos são projetados para produziruma mudança mensurável em uma característica da luz, que é acoplada à superfície do sensor. Biossensores ópticos, que utilizam ondas evanescentes, que incluem ressonância de plasma de superfície (SPR) e comprimento de onda de ressonância grade () RWG técnicas, têm sido utilizados principalmente para detectar as afinidades e cinéticas de moléculas de ligação aos seus receptores biológicos imobilizadas na superfície do sensor. Mais recentemente, biossensores RWG comercialmente disponíveis foram desenvolvidas para permitir a detecção da mudança relativa da massa dentro da porção inferior de células aderentes à superfície do sensor em alta resolução espacial (até 3,75 mM / pixel) 5. Estes biossensores podem detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática de células vivas que resultam da estimulação, tal como a adesão de células e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação e as vias de sinalização induzidas por uma variedade de receptores de superfície celular, incluindo a proteína G Os receptores acoplados (GPCRs) 6 . Biossensores RWG detectar a relação change no índice de refracção como uma função da alteração relativa na massa a cerca de 150 nm do biossensor 7. Quando as células são plaqueadas para o biossensor, esta alteração no índice de refracção reflecte a variação da massa perto da membrana plasmática da célula, resultante de uma mudança na adesão celular para o biossensor. Este protocolo irá discutir a detecção de interações proteína-canal utilizando biossensores RWG.
Sistemas de aquisição de dados RWG composto de vários componentes. Porque o X-CORPO Biociências BIND Scanner foi utilizada para estes experimentos, nos referiremos aos componentes para este sistema especial, que consiste em um leitor de placas, biossensores associados, software de aquisição de BIND Digitalizar e software BIND Ver análise 8. Os biossensores cristal fotónicas, referido daqui em diante como biossensores ópticos, são compostos de um arranjo periódico de um dieléctrico e o material em duas ou três dimensões, que impede a propagação da luz no específicacomprimentos de onda e as direcções. Estruturas de cristal fotônico são baseados em um fenômeno chamado de anomalia de Wood. Descoberto pela primeira vez por Wood em 1902, estas anomalias são efeitos observados no espectro de luz refletida por redes de difração óptica onde as variações bruscas de intensidade de determinadas ordens de difração ocorrem em determinadas faixas de freqüências estreitas. Em 1962, Hessel e Oliner apresentaram uma nova teoria de anomalias de madeira em que período finito grade gera um comprimento de onda de ressonância de pé 9. Nos biossensores ópticos descritos aqui, anomalias de madeira são utilizados para produzir um biossensor RWG que, quando estimuladas com luz branca reflecte apenas a banda estreita de comprimentos de onda (tipicamente entre 850-855 nm).
Biossensores individuais consistem de um material plástico de baixo índice de refracção, com uma estrutura de superfície periódica que é revestida com uma fina camada do material de dióxido de titânio dieléctrica de refracção elevado (TiO 2). Quando os biosensou é iluminada com uma fonte de luz de comprimento de onda larga, a grade óptica de cristais fotónicas reflecte uma estreita gama de comprimentos de onda da luz que é medida por um espectrofotómetro no scanner BIND. O pico de intensidade dos comprimentos de onda reflectidos (Comprimento de onda de pico do valor, ou PWV) é então calculado a partir do sinal. O VOP de luz muda sobre uma alteração no índice de refracção, como resultado de um aumento ou diminuição da massa dentro da proximidade (~ 150 nm) da superfície do biossensor. Biossensores ópticos são incorporados numa Sociedade padrão de Ciências Biomolecular (SBS) de 384 poços de microplacas para os ensaios utilizados nestas experiências.
Biossensores RWV são usadas para detectar alterações com a adição de sinais exógenos em células vivas 10. As células são cultivadas directamente sobre a superfície de um biossensor RWG e a mudança no índice de refracção do local é monitorado por meio de tratamento com estímulos específicos. A direção da mudança em massa no biosensor pode serdeterminada, porque o aumento do índice de refracção locais de resultados de um aumento da massa próximo do biossensor e é medido como um aumento na VOP. Inversamente, uma redução na massa produz uma diminuição na VOP. A mudança na VOP detectado pode ser resultado de vários eventos celulares, incluindo mudanças na adesão celular, proteínas de recrutamento / release, endocitose e reciclagem, exocitose, apoptose e do citoesqueleto rearranjo. Por exemplo, o ensaio pode ser detectar alterações em interacções proteína-canais entre os canais de potássio e outros componentes citoplasmáticos ou do citoesqueleto. O caso, no entanto, deve ocorrer dentro da zona de detecção nm ~ 150 perto do biossensor, e, no caso de uma célula em anexo, perto da membrana do plasma. Aquisição de respostas celulares é realizada com software BIND Scan e uma representação da imagem de cada um dos 384 poços na placa de SBS é gerado. Este sistema tem uma resolução de até 3,75 mM / pixel, permitindo a detecção de eventos em células isoladas, epode ser utilizado, quer com linhas celulares (tais como células CHO ou HEK293) ou com mais fisiologicamente relevante células primárias. A análise de imagem com o BIND Ver software permite a detecção de respostas celulares, tanto individual e as populações de células. Como os biosensores são incorporados padrão SBS microplacas de 384 poços, o sistema é facilmente adaptável para rastreio de alto rendimento (HTS).
Ressonância comprimentos de onda ópticos ralar biossensores foram previamente usados para detectar alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a ativação de GPCRs 11. O nosso laboratório clonou dois canais de potássio (K Na) ativado em sódio, Slack-B e Slick 12. A actividade de ambos os canais Slack-B e liso tem sido demonstrado ser muito fortemente influenciados pela activação directa de proteína quinase C (PKC) 13. A activação dos receptores acoplados à proteína q Gu, tais como o receptor muscarínico M1 e o mGluR1 metabotrópicos de glutamato receptor, potente regula a atividade do canal por meio da ativação da PKC. Estes canais de K de Na contribuir para a adaptação neuronal durante a estimulação prolongada e regular a precisão de tempo de potenciais de ação 14. Slack canais são conhecidos por interagir com uma variedade de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas, incluindo FMRP, a proteína X frágil Mental Retardation 15,16. Mutações no resultado Slack em vários Migrando crises parciais de Infância (MMPSI), uma forma de início precoce da epilepsia o que resulta em atraso grave de desenvolvimento 17.
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Protocol
1. Cultura de Células (Adaptado de Fleming e Kaczmarek 18)
- Células de cultura em mídia apropriada para maior do que 2, mas menos de 10 passagens antes do uso neste ensaio. Não transfectadas células HEK-293 e células HEK-293 expressando estavelmente a proteína de rato Slack-B foram cultivadas em meio de Eagle uma metade de Dulbecco Modificado e metade meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado calor e antibióticos. 500 ug / ml de geneticina (G418) é adicionado a células HEK-293 que expressam estavelmente Slack-B para seleccionar para a expressão do canal de folga. Células de passagem em confluência de 70-90% por dissociação a partir de pratos com uma solução de tripsina-EDTA a 0,25%.
2. Matriz Extracelular (ECM) de revestimento do TiO 2 placa de 384 poços biosensor óptico com fibronectina e ovalbumina
- Preparação da mistura de fibronectina ECM e solução de bloqueio ovalbumina
- Prepare uma solução de trabalho de fibronectem salina tamponada com fosfato (PBS) com uma concentração final de 5 ug / ml de fibronectina em 20,0 ml de PBS. A partir de uma concentração de estoque de 1,0 mg / ml, adicionar 100 ul de 20,0 ml de PBS por uma diluição de 200 vezes. A solução de trabalho de fibronectina podem ser divididos em alíquotas e armazenado a -20 ° C após a preparação.
- Prepara-se uma solução estoque de 5% de ovalbumina inactivado pelo calor em água estéril. Diluir ovalbumina em cultura de tecido, grau de água estéril para uma solução a 5% e aquece-inactivar durante 30 min a 60 ° C. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente e a filtração estéril da solução. Alíquota da solução de ovalbumina 5% e armazenar a 4 ° C.
- Preparar uma solução de trabalho de 2% de ovalbumina diluindo a solução de reserva de 5% em PBS. Por exemplo, adicionar 12,0 mL de uma solução de estoque de ovalbumina a 5% para 18,0 ml de PBS para um volume final de 30,0 ml.
- 384 poços da placa de revestimento do biosensor óptico
- Hidratar a placa de TiO 2 com 20,0 ul / poçocultura de tecidos de água de grau de estéril para 15 min. Os seguintes passos devem ser realizados com um pipetador de 16 canais.
- Lavar 1x placa com 50,0 ul de PBS por poço.
- Adicionar 20.0 ul da solução de trabalho de fibronectina a cada poço e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente, para criar a ECM.
- Lavar 1x placa com 50,0 ul de PBS por poço.
- Adicionar 40.0 ul da solução de trabalho de ovalbumina a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C para bloquear a placa.
- Lavar 3x placa com 50,0 ul de PBS por poço. Placas revestidas de ECM podem ser armazenadas a 4 ° C durante até 48 horas.
3. Sementeira de Células para a 384 poços Biosensor placa óptica
- Remover o meio de crescimento a partir das células e adicionar tripsina para desalojar as células da placa. Recolha das células e centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Remova a mídia de tripsina e Ressuspender as células em meio de cultura.
- Usando um hemocitómetro ou um automatizadocontador de células para determinar a concentração das células.
- Para minimizar os efeitos da evaporação durante a incubação, 50,0 mL de meio de crescimento por poço vai ser usado. As células devem ser diluído para atingir o número desejado de células por poço num volume de 50,0 ul de meio de crescimento. Para estas experiências, 1000 células / poço foram semeadas em biossensor.
- Permitir que as células semeadas a incubar durante a noite em meio de crescimento a 37 ° C sob ar / 5% de CO 2.
4. Preparação do biossensor e Compostas placas para o ensaio GRT Optical Biosensor
- Remova a placa do incubador e remover o meio de crescimento a partir das células. Lavar as células com 1x Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS). Adicionar 25.0 ul de HBSS a cada poço.
- Colocar a placa de biossensor no scanner BIND e permitir que as células atinjam a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
- Prepare um prato composto separado do que ligantes de interesse será added à placa biossensor durante o ensaio. Para estes ensaios, 25,0 uL de uma solução contendo o composto foi adicionado a cada poço na placa de biossensor para um volume total de 50,0 mL. Como tal, os compostos em solução foram preparadas em 2x a concentração final desejada.
5. Realizar o ensaio GRT Optical Biosensor
- Dê uma medição de linha de base com o sistema de scanner para poços A1-P12 (metade da SBS placa de 384 poços) com uma resolução máxima de 3,75 mM / pixel para a central de 1,5 milímetro de cada poço usando o software BIND Scan. Essa verificação de linha de base terá cerca de 30 min.
- Adicionar 25.0 ul de soluções de compostos em cada poço para poços A1-P12.
- Dê uma medida de referência de poços A13-P24.
- Adicionar 25.0 ul de soluções de compostos em cada poço para poços A13-P24.
- Dê uma medição disso pós composto por poços A1-P12, e repita para poços A13-P24.
6. Análise de Dados de Ensaio com BIND Ver
- Abra os dados do ensaio BIND para a medição da linha de base no Windows, e clique no botão "Grid Editor" para habilitar a seleção de células. O software calcula métricas de interesse definidas pelo utilizador.
- Abra o "Plug-ins", que incluem o "Finder celular" e função "Baseliner". Definir parâmetros em "Finder celular" para que as células se distinguem do fundo do biossensor.
- Exportar o arquivo de mapa de células que contém os dados "Finder celular" para a medição da linha de base.
- Repita os passos de 6,1-6,2 para postar dados de adição de composto.
- Abra o "Baseliner" plug-in e importar o mapa de células a partir da medição da linha de base. O software irá calcular a mudança na VOP entre os dados de base e pós compostos.
- Seleccionar "Δ celular médio" para a saída do deslocamento significativo em VOP para as células. Os dados podem ser exportados para o Microsoft ExcEL para posterior análise.
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Representative Results
Slack-B transfectadas estavelmente células HEK-293 transfectadas e controlam as células HEK-293 foram semeadas a 1000 células / poço em 384 bem-ECM, placas revestidas com biossensores RWG. Imagens da central de 1,5 milímetros 2 do biossensor foram gravadas com uma resolução de 3,75 mM / pixel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidade de massa foram gerados antes e 30 minutos após adição composto com o software BIND Scan. O BIND Ver software foi utilizado para determinar a mudança de VOP em cima disso agonista GPCR subtraindo-se a adição de pós PWV composto do PWV linha de base.
O cloreto de muscarínico M1 carbamoylcholine agonista do receptor endógeno (carbacol) 19 foi aplicado a ambos controlo não transfectadas células HEK-293 e de rato Slack-B expressando estavelmente células HEK-293 resultou em um aumento positivo no VOP (Figura 2A). As medidas foram realizadas em 30 min e os sinais foram normalizados para o buffer só (HBSS) comum, alémna. Em comparação com as células controle, as células transfectadas Slack-B tiveram um maior aumento no deslocamento do pico de VOP. SFLLR-NH2 sal trifluoroacetato (SFLLR), um pentapéptido TRAP N-terminal que apresenta actividade agonista contra GPCR protease endógena do receptor activado 1 (PAR1), também apresentaram respostas diferenciais em células transfectadas e não transfectadas Slack-B (figura 2B). Estes resultados mostram a presença do canal Slack-B aumenta significativamente a mudança de PWV que ocorre na ativação dos GPCRs endógenos em células HEK, e demonstrar a viabilidade do uso deste ensaio para estudar as interações proteína-canal.
Figura 1. Análise de respostas celulares em BIND View. Imagens representativas de BINDScanner d ata para Slack B transfectadas estavelmente células HEK-293 A) antes e B) após a análise de imagem com o BIND Ver software "Finder celular" plug-in. Limiares foram definidos manualmente utilizando o plug-in "Finder celular" para identificar as células de fundo. B) Áreas mostrados em vermelho representam em pixels identificados como pertencentes a células e linhas amarelas distinguir as células do cinza placa de fundo. C) A mudança de PWV para as células mediante SFLLR disso é mostrado por um gradiente de cor, onde o vermelho representa uma mudança positiva na VOP e azul representa nenhuma mudança. A barra de escala representa 100 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 2. Expressão da Slack-B altera a mudança na VOP após a ativação de GPCRs. A) M1 carbacol agonista do receptor muscarínico (500 M) produziu uma mudança na VOP que é maior em amplitude em Slack-B células transfectadas do que o controle de células HEK-293 ( P <0,0001, N = 16 poços / condição). B) Aplicação da SFLLR (10 uM), um pentapéptido TRAP N-terminal que apresenta actividade agonista em relação ao receptor endógeno da protease de GPCR activado 1 (PAR1), produziu um desvio na resposta VOP que é maior em amplitude em células transfectadas-B frouxos do que no controlo de células HEK-293 (P <0,0001, N = 16 poços / condição). As medidas foram registradas 30 min pós adição composto, ea resposta ligante foi normalizado para o buffer apenas controle. As barras de erro são ± SEM. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
O principal Z (Z ') é um factor de método estatístico comum para quantificar a qualidade de um ensaio de rastreio de alto rendimento de 20, e porque o rastreio de agonistas de GPCR neste ensaio ocorreram numa compatível ensaio de 384 cavidades SBS, proporciona uma excelente medida da robustez e validade deste ensaio 21. Valor AZ 'de 1 indica um ensaio teoricamente ideal, com um número infinito de pontos de dados com desvios padrão inexistentes. Valor AZ 'entre 0,5-1 é considerado um excelente ensaio para fins de rastreio de alto rendimento, com menos de 0,5 considerado um ensaio marginalmente informativo. Para este conjunto de dados, o valor calculado Z 'utilizando um carbacol SFLLR como controlos positivos é de 0,79 e 0,81 respectivamente, indicando que este ensaio é altamente resistente e os resultados obtidos são altamente significativos.
Revestimento de matriz extracelular da placa de 384 poços biosensor óptico, sementeira de células, e composto de adiçãonestas experiências foi realizada manualmente, com um de 16 canais Finnpipette (5-50 ul). Como este ensaio é realizado numa placa de SBS, sistemas de processamento de líquidos robóticos mais avançados podem ser utilizados em pesquisa de alto rendimento. No entanto, aquando da adaptação dos sistemas para instrumentação manipulação de líquidos, o cuidado deve ser exercido para garantir que as pontas de pipeta não toque a superfície do biossensor, pois isso pode causar danos ao biossensor.
Quando a adição de compostos dissolvidos em DMSO, o ensaio deve ser realizado de modo a que a concentração final de DMSO no meio de ensaio é mantida constante, para evitar um deslocamento na VOP, devido à toxicidade de DMSO para a célula ("choque DMSO"). Apesar de diferentes linhas de células são diferencialmente responsivo ao DMSO neste ensaio, recomenda-se que a concentração final de DMSO não exceda 0,1-0,2% em volume. As células devem ser incubados na concentração final de DMSO em tampão de ensaio durante a fase de equilíbrio de temperatura deste protocolo, a fim de evitar o solvendeslocamentos induzida por t em VOP.
Uma grande variedade de células, incluindo células primárias, pode ser estudada com este ensaio, embora a optimização do ensaio, para cada linha de células tem de ser executada. Ao usar diferentes tipos de células, a optimização do número de células e revestimentos de superfície do biosensor da matriz extracelular deve ser realizada. As células devem ser cultivadas a diferentes densidades entre 1,000-15,000 células / cavidade e tratados com um agonista do receptor conhecido para determinar qual a maior densidade produz Z '. Vários revestimentos superficiais ECM, incluindo mas não se limitando a fibronectina, o colagénio, a laminina e, isoladamente ou em combinação, devem ser testados para garantir que as células permanecem aderentes ao biossensor durante o ensaio. Fome celular (falta de soro) podem influenciar a resposta celular neste ensaio, e como tais experiências podem ser realizadas em meio isento de soro e meio contendo soro, para fins de optimização iniciais ensaio. A alta resolução da etiqueta do BIND Scanner livredetecção permite medições de resposta para ser quantificada a baixa densidade celular, uma vez que a análise de respostas celulares pode ser limitada aos pixels contactadas pelas células. Além disso, subpopulações de células dentro de uma mistura heterogênea pode ser fechado com base em vários parâmetros (incluindo o tamanho ea força da adesão celular) e medido para respostas celulares individuais. Tomados em conjunto, esses recursos fazem o ideal Scanner BIND para ensaios envolvendo células cultivadas primários.
O sistema Scanner BIND permite medições a serem tomadas ao longo de um curso de tempo especificado, e, por isso medidas de intervalo de tempo de mudanças na VOP pode ser gravado. Isto é particularmente útil para medir as mudanças no comportamento das células que ocorrem durante períodos de tempo mais longos do que aqueles devido às interações proteína-canal, incluindo a proliferação de células, a divisão celular e migração celular. O BIND Ver software permite a análise de tais respostas celulares, e pode quantificar numerosos parameters de mudanças na estrutura da célula, incluindo mudanças na adesão celular, alterações no volume celular e alterações na movimentação das células, permitindo que tanto a análise quantitativa e lapso de tempo de imagem desses eventos. Por exemplo, este sistema pode ser usado para determinar a taxa de fibroblastos que respondem à sinalização do factor de crescimento, acompanhando a taxa de migração de células através de um poço individual.
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Disclosures
Steven M. Shamah é um empregado de Biociências X-CORPO.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Yangyang Yan no laboratório do Dr. Fred Sigworth na Universidade de Yale para a generosa doação de células HEK293 expressando estavelmente rato proteína Slack-B. Além disso, os autores agradecem ao Dr. Sigworth para crio-microscopia eletrônica de modelo de homologia de Slack exibido na introdução de vídeo. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH Grants DH067517 e NS073943 para LKK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
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