Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل Published: September 1, 2014 doi: 10.3791/51312
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, American University, 2Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, NIH

Summary

مقايسة تشكيل أنبوب هو، طريقة للقياس لقياس سريع في المختبر الأوعية الدموية. يتم الجمع بين الخلايا البطانية مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على استخراج الغشاء القاعدي. يحدث تشكيل أنبوب خلال ساعات والأنابيب التي شكلت حديثا كميا بسهولة.

Abstract

الأوعية الدموية هي عملية حيوية للتنمية الأنسجة الطبيعية والتئام الجروح، ولكن يرتبط أيضا مع مجموعة متنوعة من الحالات المرضية. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن قياس الأوعية الدموية في المختبر بطريقة سليمة وقابلة للقياس الكمي سريعة. يتم خلط الخلايا البطانية الأولية أو خلدت مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على مصفوفة الغشاء القاعدي. وتشكل الخلايا البطانية الشعرية مثل الهياكل استجابة لإشارات عائية وجدت في وسائل الإعلام مشروطة. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع الخلايا البطانية التي تبدأ لمواءمة أنفسهم في حدود 1 ساعة والأنابيب التي تحتوي على التجويف تبدأ في الظهور في غضون 2 ساعة. أنابيب يمكن تصور باستخدام المجهر المقلوب على النقيض المرحلة، أو الخلايا يمكن علاجها calcein AM مسبق للفحص والأنابيب من خلال تصور أو مضان المجهري متحد البؤر. عدد المواقع فرع / العقد، وأعمدة / تنسجم، أو عدد أو طول أنابيب شكلت يمكن قياسها كميا بسهولة كمقياس للفي vitrس الأوعية الدموية. وباختصار، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الجينات والمسالك التي تشارك في تعزيز أو تثبيط الأوعية الدموية بطريقة سريعة واستنساخه، والكمية.

Introduction

الأوعية الدموية، وتطوير أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة مسبقا، أمر حيوي لمجموعة متنوعة من العمليات بما في ذلك نمو الجهاز، التطور الجنيني، والتئام الجروح 1-3. وضعت حديثا الأوعية الدموية، واصطف بواسطة الخلايا البطانية، والأكسجين العرض والمواد المغذية إلى الأنسجة، وتعزيز المراقبة المناعة من الخلايا المكونة للدم وإزالة النفايات 2،4. الأوعية الدموية هي ذات أهمية رئيسية أثناء التطور الجنيني والجنين. ومع ذلك، لا تزال هذه العملية نائمة في البالغين إلا في أوقات التئام الجروح ونمو الهيكل العظمي، والحمل أو أثناء الدورة الشهرية 1-3.

على مدى العقدين الماضيين، بدأت الآليات الجزيئية الرئيسية التي تنظم الأوعية الدموية في الظهور. الأوعية الدموية هو حدث ينظم بإحكام، متوازنة من إشارات المؤيد والأوعية بما integrins، كيموكينات، angiopoietins، وكلاء الاستشعار الأوكسجين، جزيئات صلي ومثبطات الذاتية 5. مرة واحدة proangإشارات iogenic مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF)، وعامل نمو البشرة (EGF) تنشيط الخلايا البطانية مستقبلات الخلايا البطانية تطلق البروتياز للحط من الغشاء القاعدي. الخلايا البطانية ثم تتكاثر وتهاجر، وتشكيل براعم بمعدل عدة مليمترات في اليوم الواحد 6،7.

ويرتبط الأوعية الدموية مع مختلف الحالات المرضية بما فيها السرطان، والصدفية، واعتلال الشبكية السكري، والتهاب المفاصل، والربو، واضطرابات المناعة الذاتية والأمراض المعدية، وتصلب الشرايين 8-10. نظرا لأهمية الأوعية الدموية في أمراض مختلفة، فهم الجينات والمسارات التي تنظم هذه العملية أمر بالغ الأهمية لتصميم علاجات أفضل.

مقايسة تشكيل أنبوب هو طريقة سريعة والكمي لتحديد الجينات أو مسارات المشاركة في الأوعية الدموية. وصف لأول مرة في عام 1988،المبادئ التي تقوم عليها هذا الاختبار هي أن الخلايا البطانية تحتفظ القدرة على الانقسام وتهاجر بسرعة استجابة لإشارات عائية 11-13. علاوة على ذلك، وبفعل الخلايا البطانية للتمييز وتشكيل الهياكل أنبوب يشبه عندما مثقف على مصفوفة من استخراج الغشاء القاعدي (BME). هذه الأنابيب تحتوي على تجويف تحيط بها الخلايا البطانية ترتبط معا من خلال المجمعات صلي. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع معظم أنابيب تشكيل في هذا الاختبار في غضون 2-6 ساعة تبعا لكمية ونوع المثيرات عائية.

عدة أنواع من الخلايا البطانية يمكن استخدامها لهذا الاختبار بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط الخلايا خلد 14،15. كان خط الخلية المستخدمة لهذا المقال الماوس 3B-11، ولكن نفس منهجية يمكن تطبيقها مع خطوط أخرى مثل الخلايا البطانية SVEC4-10 (الماوس) أو الخلايا البطانية الأولية مثل HUVEC (الإنسان) الخلايا. تبعا الذي يستخدم خط الخلية وما إذا كانت البطانية متتحول LLS أو غير تحولت، سوف تحتاج الأمثل التي ستجرى لتحديد الوقت المثالي اللازمة لتشكيل أنبوب المناسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. مجموعة من وسائل الإعلام مكيفة لاختبار إمكانات عائية

  1. تنمو الخلايا الأولية أو خلد لفحصها لاحتمال عائية أو مكافحة عائية في وسائل الإعلام مصل الأم أو منخفضة وجمع وسائل الإعلام مكيفة.
    1. بدلا من ذلك، استخدام وسائل الإعلام مشروطة فورا أو aliquoted وتخزينها في -80 درجة مئوية لعدة أشهر. استخدام nonconditioned الأصلي أو انخفاض مصل سائل الإعلام كعنصر تحكم السلبية، واستخدام وسائل الإعلام غير مكيفة كاملة النمو (10٪ FBS، أو التركيز المناسب) كعنصر تحكم إيجابية. بدلا من ذلك، لاختبار التحفيز والتشجيع المحتملة لتكوين الأوعية الدموية، ملحق الفحم جردت وسائل الإعلام التي تفتقر إلى عوامل النمو مع تركيزات معروفة من بروتينات معينة من الفائدة ومقارنة لوسائل الإعلام الحرة وحدها عامل النمو.

2. إعداد الخلايا البطانية قبل الفحص

  1. يومين قبل الفحص، مرور 3B-11 الخلايا في جديدة T-75 قارورة. عدد مرور خلايا ومهم. هذا الاختبار يعمل بشكل أفضل عندما الخلايا بين الممرات الثانية والسادسة. سوف الفحص لا تعمل بشكل جيد إذا تم استخدام الخلايا البطانية قبل الثانية أو بعد مرور العاشر.
  2. تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
  3. يوم واحد قبل الفحص، مصل تجويع خلايا 3B-11 على النحو التالي:
    1. وسائل الإعلام نضح من الخلايا 3B-11.
    2. إضافة خفضت وسائل الاعلام المصل DMEM تستكمل مع 0.2٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، البيروفات 1MM الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
    3. تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية.

3. إعداد الكواشف لفحص مسبق

ملاحظة: تركيزات BME تختلف اختلافا كبيرا تعتمد على الكثير. BME لا يعمل بشكل جيد إذا كان تركيز أقل من 10 ملغ / مل، لذلك يجب الاتصال بالشركة المصنعة BME قبل الشراء للتأكد مناقتناء الكثير تتركز بشكل كاف.

  1. انخفاض تذويب عامل النمو BME في الثلاجة. BME يتصلب عندما الحارة، لذلك يجب أن تبقى البارد قبل استخدامها. BME يمكن تخزينها تحت التبريد لبضعة أسابيع، أو aliquoted وتجميد في -80 درجة مئوية.
  2. ويفضل تقليل عامل نمو BME على BME التقليدي. وعدم وجود العوامل عائية في BME يسهل مراقبة تأثير العوامل التي من وسائل الإعلام مكيفة تحتوي على تشكيل الأنبوب.
  3. وسائل الإعلام ذوبان الجليد لفحصها.

4. إعداد الخلايا البطانية مباشرة قبل الفحص

  1. غسل 3B-11 الخلايا في DPBS.
    1. إذا كان المطلوب التصور مع مضان المجهري متحد البؤر أو قبل غسل 3B-11 الخلايا، إضافة calcein صباحا إلى الخلايا البطانية في وسائل الإعلام بتركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل. وضع calcein الخلايا المسمى في الظلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل بدء الفحص. حل الأسهم calceinيتم تخفيف AM في DMSO وcalcein مرة واحدة في وسائل الإعلام تركيز النهائي من DMSO يجب أن لا تتجاوز 0.1٪. بعد 30-45 دقيقة يغسل calcein صباحا من الخلايا (الخطوة 4.1 أعلاه) ومواصلة التجربة يتبع.
  2. يعرض للتريبسين الخلايا بإضافة 1 مل التربسين-EDTA إلى T-75 قارورة.
  3. بعد trypsinization كاملة، تحييد التربسين عن طريق إعادة التعليق الخلايا إلى الحجم النهائي من 10ML في DMEM، و 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، البيروفات 1MM الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
  4. تصفية الخلايا من خلال 100 ميكرون خلية مصفاة لإزالة كتل.
  5. عد الخلايا وResuspend الخلايا إلى تركيز النهائي من 7.5 × 10 6 خلية / مل في DMEM، و 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.

5. أنبوب تشكيل الفحص

  1. وضع 24 لوحة جيدا و 1 مل النصائح في الثلاجة أو على الجليد لمدة 20-30 دقيقة قبل تحميل لوحة بحيث BME لا بريمترسيخ aturely.
  2. الماصة 250 ميكرولتر من تقليل عامل نمو BME في كل بئر من 24 لوحة جيدا. تجنب خلق فقاعات من خلال عدم الاكتئاب ماصة إلى المحطة الأخيرة في حين الاستغناء. الحرص على أن يبقى ما يكفي BME في مركز البئر عندما أشكال الغضروف المفصلي. إذا كانت مصفوفة رقيقة جدا، وسوف تشكل الخلايا فقط أحادي الطبقة.
  3. احتضان 24 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة لترسيخ BME.
  4. مرة واحدة وقد وضعت BME، مزيج حوالي 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام مكيفة مع 10 ميكرولتر من معلق 3B-11 الخلايا (حوالي 75،000 الخلايا).
    1. ضبط مستوى الصوت وسائل الإعلام مكيفة وعدد الخلايا البطانية مطلي اعتمادا على نوع من الخلايا المستخدمة، واختبار التخفيفات المسلسل من وسائل الإعلام مكيفة لإثبات النشاط. إذا الخلايا مقارنة نمت في ظل ظروف مختلفة، وتطبيع حجم وسائل الإعلام مكيفة لعدد الخلايا التي استخدمت لشرط وسائل الإعلام.
  5. أنابيب فيلل يبدأ بتشكيل خلال 2-4 ساعة. اعتمادا على تركيز عامل عائية في وسائل الإعلام مكيفة، قد تحدث تشكيل أنبوب الذروة بين 3 و 12 ساعة وتوقيت الفحص سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل. إذا كان يعمل مع الخلايا البطانية الأولية بدلا من خلايا خلدت، تشكيل أنبوب الأولي قد يتأخر لعدة ساعات.
    1. وغالبا ما تبدأ أنابيب في التدهور خلال 18 ساعة وخلايا البطانية سيخضع لموت الخلايا المبرمج.
  6. في وقت الذروة تشكيل الأنبوب، وسائل الإعلام نضح بعناية من البئر لتجنب تعطيل شبكة أنبوب على BME.
    1. غسل كل بئر مع 1 مل DPBS، ثم نضح.
      1. لتصور فوري، إضافة 1 مل DPBS الطازجة إلى كل شبكة أنبوب جيدا والصورة باستخدام مجهر مقلوب تعلق على كاميرا رقمية، أو مضان / مجهر متحد البؤر إذا تم صبغ الخلايا مع calcein AM كما في 4.1.1.
      2. لإصلاح شبكة أنابيب لتصور لاحق، وإضافة 4٪ بارافورمالدهيد على كليستنشق جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        1. إزالة امتصاص العرق، ويغسل مرتين مع DPBS، ثم يضاف من 1mL DPBS الطازجة إلى كل بئر.
        2. مجهريا صورة قبل التثبيت كما القليلة أنابيب قد كسر خلال هذا الإجراء.

6. الكمي لشبكة أنابيب

  1. تحديد شبكة أنبوب في عدة طرق مختلفة اعتمادا على تفضيل المحقق، والعديد من برامج الكمبيوتر لديها القدرة على قياس المعلمات التالية: عدد الأنابيب. عدد الحلقات / تنسجم؛ عدد من المواقع فرع / العقد. طول الأنابيب.
  2. استخدام برنامج كمبيوتر تمثيلي مثل صورة J مع المساعد الأوعية الدموية محلل (16) لتقدير حجم شبكات الأنبوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم المصنفة الماوس 3B-11 الخلايا البطانية على طدت عامل انخفاض النمو BME - في هذا الاختبار، تم استخدام المنتج Matrigel - ويتبع مع مرور الوقت. كما هو مبين في الشكل 1، والعوامل المولدة للأوعية التي يفرزها إما الماوس أو الكيراتينية الليفية قادرة على إحداث تشكيل أنبوب مع مرور الوقت. تهاجر الخلايا البطانية وتبدأ في تشكيل فروع صغيرة في غضون 1-2 ساعة من الطلاء. تم التوصل إلى تشكيل أنبوب الحد الأقصى من 4-6 ساعة باستخدام وسائل الإعلام مشروطة الحصول عليها سابقا من الخلايا الكيراتينية. قبل 24 ساعة، ظلت بعض الفروع، ولكن العديد من الخلايا أصبح أفكارك وبدأ أنابيب إلى قطع الاتصال.

عدد الخلايا له تأثير عميق على تشكيل أنبوب (الشكل 2). عندما المصنف وجود العدد الكافي من الخلايا في المصفوفة، وعدد قليل أنابيب وتشكل الشبكة هو الحد الأدنى. والمزيد من الخلايا المصنفة، تصبح شبكة أنبوب أكثر اتساعا. ومع ذلك، في عالية جدا من التركيز، والخلايا تبدأ في أجمة أو تشكيلالطبقات الوحيدة، والاختلافات بين مجموعات العلاج تصبح ملثمين.

تشكيل أنبوب مع 3B-11 خلايا يعمل بشكل أفضل مع خلايا الممرات بين الثانية والسادسة. بعد مرور السادس، والخلايا لا تشكل اسعة باعتباره الشبكة؛ سوف الخلايا لا تشكل أي شبكة كبرى بعد مرور العاشر. وينبغي أن يكون الحد الأدنى من خلايا ممرين بعد احياء من تخزين النيتروجين السائل لضمان تشكيل أنبوب الكافي (الشكل 3). معدل نمو 3B-11 هو سريع حتى أن 25٪ من خلايا passaged يوم واحد سوف تسفر عن متكدسة قارورة في اليوم التالي.

يمكن أن كان صور موثقة بسهولة من خلال المرحلة النقيض المجهر باستخدام الأهداف بين 4X و 20X. ومع ذلك، إذا رغبت الصور الفلورسنت، calcein AM يمكن إضافة وتصور الشبكة من خلال أنبوب أو مضان المجهري متحد البؤر (الشكل 4). هناك العديد من الطرق المختلفة لكشف وتحديد تشكيل شبكة الأنبوب. وmetho الأكثر شيوعاس التحليل الكمي لإشراك عدد من أنابيب، والعقد، وأعمدة / تنسجم، أو طول الأنابيب. يمكن حساب هذه المعايير باليد أو يمكن القيام به من خلال برامج التصوير المختلفة، بما في ذلك المعاهد الوطنية للصحة يماغيج مع المساعد الأوعية الدموية محلل. وترد أمثلة على كل من هذه الأنواع من التحليل في الشكل 4.

الشكل 1
وكانت المصنفة رقم 1. ماوس 3B-11 أنبوب تشكيل خلية البطانية مع مرور الوقت. ما مجموعه 1 × 10 5 خلايا لكل بئر على انخفاض عامل النمو BME مع 350 ميكرولتر من وسائل الإعلام مشروط من أي الليفية أو الخلايا الكيراتينية. وسجلت تشكيل أنبوب على مدار 24 ساعة.

الشكل 2 < ر /> الشكل 2. تأثير على عدد الخلايا البطانية تشكيل خلية أنبوب. 3B-11 خلايا كانت المصنفة في الآبار بتركيزات تتراوح بين 5 × 04-02 أكتوبر × 10 5 مع 350 ميكرولتر من الخلايا الليفية أو القرنية مكيفة وسائل الإعلام، ومن ثم يتبع مع مرور الوقت. لاحظ عدم تشكيل أنبوب في الآبار مطلي مع 5 × 10 4 الخلايا والزحام من الخلايا في الآبار مطلي مع 2 × 10 5 خلايا.

الرقم 3
الرقم 3. تأثير عدد مرور على البطانية تشكيل خلية أنبوب. ما مجموعه وكانت المصنفة 1 × 10 5 خلايا لكل بئر على انخفاض عامل النمو BME في مرور 0، 1، أو كان ينظر 2. تشكيل الأنبوب الصغير قبل مرور 2.

4 "FO: محتوى العرض =" 5in "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51312 / 51312fig4highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 4. الإسفار التصوير المجهري والكمي لتشكيل الأنبوب. قبل بدء الفحص، الخلايا البطانية يمكن علاجها calcein AM من أجل رؤية الخلايا باستخدام مضان أو المجهري متحد البؤر. كانت هناك العديد من الطرق لقياس ذكرت شبكة أنبوب تشكيل، بما في ذلك حساب عدد من الأنابيب، حلقات / شبكات ومواقع فرع / العقد، أو طول الأنابيب. هنا، وتبين لنا كيف NIH J صورة مع البرنامج المساعد الأوعية الدموية يمكن استخدامها على calcein صباحا شبكة أنبوب الملون (A) للكشف عن العقد الإجمالية (الأحمر) / أنابيب (الوردي) / شبكة (الازرق) في تركيبة (B) واندمجت على شبكة (C). بالإضافة إلى ذلك، هذا البرنامج يمكن أن تستخدم لكشف فردي العقد (D)، والأنابيب (E)، أو شبكة (F) ومن ثم يمكن كميا (G

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تشارك الأوعية الدموية في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية. دراسة الآليات التي تشارك في تكوين الأوعية الدموية يتطلب استخدام المقايسات أن ألخص أهم الخطوات في الأوعية الدموية. والبطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ويقدم العديد من المزايا أكثر من فحوصات أخرى. فمن السهل أن انشاء، غير مكلفة نسبيا، وتنتج الأنابيب في غضون ساعات، وغير قابلة للقياس الكمي. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تكتمل في 24- أو 96 جيدا لوحات، وبالتالي يمكن استخدامها لفحص عالية الإنتاجية لتحديد العوامل التي تحفز أو تمنع تكوين الأوعية الدموية. على الرغم من أننا تستخدم 3B-11 الخلايا البطانية الماوس لتجاربنا، الفحص يمكن القيام بها مع مجموعة متنوعة من خطوط البطانية الإنسان أو الفئران، بما في ذلك HUVEC وSVEC.

لإجراء البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص، يتم خلط الخلايا البطانية مع وسائل الإعلام مشروط الذي يحتوي على العوامل المؤيدة أو الأوعية ومطلي على انخفاض عامل النمو مصفوفة الغشاء القاعدي. Endotheliخلايا آل تبدأ في مواءمة أنفسهم في حدود 1 ساعة والأنابيب التي تحتوي على التجويف تبدأ في الظهور في غضون 2 ساعة. يمكن تصور تشكيل أنبوب باستخدام مجهر مقلوب المرحلة النقيض من ذلك، أو calcein AM يمكن إضافتها في ختام الفحص وأنابيب تصور أو باستخدام مضان المجهري متحد البؤر.

قد يكون الأمثل النتائج في عدة طرق. أولا، يجب أن تكون الخلايا الأولية مثالي بين الممرات الثانية والسادسة. استخدام الخلايا قبل الثانية أو بعد مرور العاشر لا تكون مواتية لتشكيل أنبوب الأقصى. ثانيا، يحتاج عدد الخلايا إلى أن يكون الأمثل على أساس نوع من الخلايا وخط المستخدمة. فأرة الحاسوب 3B-11، وجدنا استجابة القصوى باستخدام 75،000-100،000 خلايا / جيد في 24 لوحة جيدا نمت مع الماوس القرنية والليفية مكيفة وسائل الاعلام. باستخدام عدد قليل جدا من الخلايا يؤدي إلى الحد الأدنى أو أي تشكيل الأنبوب، والكثير من النتائج الخلايا في تشكيل أحادي الطبقة أو التثاقل. وأخيرا، ينبغي أن تكون كمية سائل الإعلام مكيفة تستخدم العاديأوتوماتيكية لعدد الخلايا بدلا من تركيز البروتين. إذا باستخدام وسائل الإعلام طبيعية مع 10٪ FBS، فإن FBS تمثل الغالبية العظمى من تركيز البروتين تقاس من خلال فحص البروتين القياسية. فإن تركيز تبدو متطابقة تقريبا على الرغم من عدد من الخلايا، وبالتالي فإن تركيزات البروتينات يفرز خلال تكييف، بين العلاجات قد يكون متغير بدرجة كبيرة.

وباختصار، فإن الفحص تشكيل أنبوب هو طريقة سريعة واستنساخه وحساسة لقياس في المختبر من الأوعية الدموية. لها مزايا أكثر من فحوصات أخرى وهي طريقة مفيدة لتحديد الجينات والمسالك التي يحتمل أن تلعب دورا مهما في تنشيط أو تثبيط الأوعية الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث في جزء من برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان في المعاهد الوطنية للصحة، وNCI منح UA5CA152907.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate Corning 3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced BD Biosciences 354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x) Life Technologies 25030-081
Gibco pen strep Life Technologies 15140-122
Gibco DMEM (1x) Life Technologies 11965-092
Gibco DPBS (1x) Life Technologies 14190-144
Fetal Bovine Serum Atlas Biologicals F-0500-A
Calcein AM Life Technologies C3100MP
DMSO ATCC 4-X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
  2. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  3. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
  4. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
  5. Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
  6. Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
  7. Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
  8. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
  9. Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
  10. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
  11. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
  12. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
  13. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
  14. Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
  15. Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
  16. Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).

Tags

بيولوجيا السرطان، العدد 91، الأوعية الدموية، تشكيل الأنبوب، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، مصفوفة، 3B-11، واستخراج الغشاء القاعدي، tubulogenesis
البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DeCicco-Skinner, K. L., Henry, G.… More

DeCicco-Skinner, K. L., Henry, G. H., Cataisson, C., Tabib, T., Gwilliam, J. C., Watson, N. J., Bullwinkle, E. M., Falkenburg, L., O'Neill, R. C., Morin, A., Wiest, J. S. Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (91), e51312, doi:10.3791/51312 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter