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Biology

के लिए endothelial सेल ट्यूब गठन परख Published: September 1, 2014 doi: 10.3791/51312
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, American University, 2Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, NIH

Summary

ट्यूब गठन परख इन विट्रो angiogenesis को मापने के लिए एक तेज, मात्रात्मक विधि है. Endothelial कोशिकाओं वातानुकूलित मीडिया के साथ संयुक्त और तहखाने झिल्ली निकालने पर चढ़ाया जाता है. ट्यूब गठन घंटे के भीतर होता है और नवगठित नलिकाओं आसानी मात्रा निर्धारित.

Abstract

एंजियोजिनेसिस सामान्य ऊतक विकास और घाव भरने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, लेकिन यह भी रोग की स्थिति की एक किस्म के साथ जुड़ा हुआ है. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, angiogenesis एक तेज, quantifiable तरीके से इन विट्रो में मापा जा सकता है. प्राथमिक या अमर endothelial कोशिकाओं वातानुकूलित मीडिया के साथ मिलाया और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर चढ़ाया जाता है. endothelial कोशिकाओं वातानुकूलित मीडिया में पाया वाहिकाजनक संकेतों के जवाब में संरचनाओं की तरह केशिका के रूप में. ट्यूब गठन endothelial कोशिकाओं 1 घंटा और लुमेन युक्त नलिकाओं 2 घंटे के भीतर दिखाई शुरुआत के भीतर खुद के लिए पंक्ति में शुरुआत के साथ जल्दी होता है. ट्यूब एक चरण विपरीत उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखे जा सकते हैं, या कोशिकाओं प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना परख और ट्यूब से पहले calcein AM के साथ इलाज किया जा सकता है. शाखा साइटों / नोड्स की संख्या छोरों / meshes, या संख्या या गठन ट्यूब की लंबाई आसानी vitr में से एक उपाय के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैओ angiogenesis. संक्षेप में, यह परख जीन और एक, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और मात्रात्मक तरीके से पदोन्नति या angiogenesis के निषेध में शामिल कर रहे हैं कि रास्ते की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

एंजियोजिनेसिस, preexisting जहाजों से नई रक्त वाहिकाओं के विकास, 1-3 उपचार अंग विकास, भ्रूण विकास, और घाव सहित प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण है. नव ऊतकों को endothelial कोशिकाओं, आपूर्ति ऑक्सीजन और पोषक तत्वों से अटे रक्त वाहिकाओं, विकसित, hematopoietic कोशिकाओं द्वारा प्रतिरक्षा निगरानी को बढ़ावा देने और अपशिष्ट उत्पादों 2,4 हटा दें. एंजियोजिनेसिस भ्रूण और भ्रूण के विकास के दौरान प्रमुख महत्व का है. हालांकि, इस प्रक्रिया घाव भरने, कंकाल विकास, गर्भावस्था के समय के दौरान छोड़कर या मासिक धर्म चक्र 1-3 के दौरान वयस्क में निष्क्रिय बनी हुई है.

पिछले दो दशकों में, angiogenesis को विनियमित कि कुंजी आणविक तंत्र में उभरने के लिए शुरू कर दिया है. एंजियोजिनेसिस integrins, chemokines, angiopoietins, ऑक्सीजन संवेदन एजेंट, junctional अणुओं और अंतर्जात अवरोधकों 5 सहित समर्थक और antiangiogenic संकेतों से संतुलित एक कसकर विनियमित घटना है. Proang बारऐसे बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF), प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF), और epidermal वृद्धि कारक (EGF) के रूप में iogenic संकेतों endothelial सेल endothelial कोशिकाओं तहखाने झिल्ली नीचा करने के लिए proteases जारी रिसेप्टर्स को सक्रिय करें. endothelial कोशिकाओं तो दिन 6,7 प्रति कई मिलीमीटर की दर से अंकुरित गठन पैदा करना और विस्थापित.

Angiogenesis कैंसर, सोरायसिस, मधुमेह रेटिनोपैथी, गठिया, अस्थमा, autoimmune विकार, संक्रामक रोगों, और atherosclerosis 8-10 सहित विभिन्न रोग की स्थिति के साथ जुड़ा हुआ है. कारण विभिन्न रोगों में angiogenesis के महत्व, इस प्रक्रिया को बेहतर चिकित्सा विज्ञान के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है कि विनियमित जीन और रास्ते को समझने के लिए.

ट्यूब गठन परख angiogenesis में शामिल जीन या रास्ते का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक विधि है. सबसे पहले 1988 में वर्णित है,इस परख सिद्धांतों endothelial कोशिकाओं के विभाजन और वाहिकाजनक संकेतों 11-13 के जवाब में तेजी से विस्थापित करने की क्षमता बनाए रखने के लिए कर रहे हैं कि. इसके अलावा, endothelial कोशिकाओं अंतर और तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) के एक मैट्रिक्स पर जब सुसंस्कृत ट्यूब संरचनाओं की तरह फार्म करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. इन ट्यूबों junctional परिसरों के माध्यम से एक साथ जुड़े endothelial कोशिकाओं से घिरा हुआ एक लुमेन होते हैं. ट्यूब गठन के सबसे ट्यूब मात्रा और वाहिकाजनक उत्तेजनाओं के प्रकार के आधार पर 2-6 घंटे के भीतर इस परख में गठन के साथ जल्दी होता है.

Endothelial कोशिकाओं के कई प्रकार के प्राथमिक कोशिकाओं और अमर सेल लाइनों 14,15 सहित दोनों इस परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस लेख के लिए इस्तेमाल सेल लाइन माउस 3B-11 था, लेकिन एक ही पद्धति ऐसी HUVEC (मानव) कोशिकाओं के रूप में इस तरह के SVEC4-10 (माउस) के रूप में अन्य endothelial सेल लाइनों या प्राथमिक endothelial कोशिकाओं के साथ लागू किया जा सकता है. जो के आधार पर सेल लाइन का इस्तेमाल किया जाता है और endothelial CE चाहेLLS तब्दील या गैर बदल रहे हैं, अनुकूलन उचित ट्यूब गठन के लिए आवश्यक आदर्श समय की पहचान करने के लिए आयोजित किए जाने की आवश्यकता होगी.

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Protocol

वातानुकूलित मीडिया की 1. संग्रह वाहिकाजनक क्षमता के लिए टेस्ट

  1. देशी या कम सीरम मीडिया में वाहिकाजनक या विरोधी वाहिकाजनक क्षमता के लिए परीक्षण किया जा प्राथमिक या अमर कोशिकाओं के विकास और वातानुकूलित मीडिया इकट्ठा.
    1. वैकल्पिक रूप से, उपयोग तुरंत मीडिया वातानुकूलित, या aliquoted और कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में nonconditioned देशी या कम सीरम मीडिया का प्रयोग करें, और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर वातानुकूलित पूर्ण विकास मीडिया (10% FBS, या उचित एकाग्रता) का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, angiogenesis के संभावित stimulators परीक्षण करने के लिए, और ब्याज की विशेष प्रोटीन के ज्ञात सांद्रता के साथ वृद्धि कारकों की कमी के पूरक का कोयला छीन मीडिया अकेले वृद्धि कारक स्वतंत्र मीडिया से तुलना करें.

परख करने से पहले endothelial कोशिकाओं की 2. तैयारी

  1. परख करने के लिए दो दिन पहले, एक नया टी -75 फ्लास्क में पारित होने के 3 बी -11 कोशिकाओं. कोशिकाओं के बीतने संख्या महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं दूसरे और छठे अंश के बीच कर रहे हैं जब यह परख सबसे अच्छा काम करता है. परख endothelial कोशिकाओं दूसरे से पहले या दसवें पारित होने के बाद इस्तेमाल किया जाता है अच्छी तरह से अगर काम नहीं करेगा.
  2. DMEM में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
  3. निम्नानुसार एक दिन पूर्व परख करने के लिए, सीरम 3 बी -11 कोशिकाओं को भूखा:
    1. 3 बी -11 कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया.
    2. DMEM के जोड़ें कम सीरम मीडिया 0.2% FBS, 2 मिमी एल glutamine, 1mm सोडियम पाइरूवेट, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
    3. एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित.

परख करने से पहले अभिकर्मकों के 3 तैयारी

नोट: BME सांद्रता बहुत पर निर्भर अत्यधिक चर रहे हैं. एकाग्रता, एमएल / इसलिए बीएमई निर्माता सुनिश्चित करने के लिए खरीद करने से पहले संपर्क किया जाना चाहिए कम से कम 10 मिलीग्राम है अगर बीएमई अच्छी तरह से काम नहीं करता हैएक पर्याप्त रूप से ध्यान केंद्रित बहुत कुछ के अधिग्रहण.

  1. Defrost फ्रिज में वृद्धि कारक बीएमई कम कर दिया. जब गर्म बीएमई solidifies, ताकि इसका इस्तेमाल करने से पहले ठंडा रखा जाना चाहिए. बीएमई कुछ हफ्तों के लिए प्रशीतन तहत संग्रहीत, या aliquoted और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है.
  2. एक कम वृद्धि कारक बीएमई पारंपरिक बीएमई अधिक पसंद है. बीएमई में वाहिकाजनक कारकों की कमी यह आसान वातानुकूलित मीडिया ट्यूब गठन पर है से कारक है कि प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए कर देगा.
  3. पिघलना मीडिया परीक्षण किया.

परख करने के तुरंत पहले endothelial कोशिकाओं के 4 तैयारी

  1. धो 3 बी -11 DPBS में कोशिकाओं.
    1. प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी के साथ दृश्य वांछित है, 3 बी -11 कोशिकाओं को धोने से पहले, 2 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में मीडिया में endothelial कोशिकाओं को calcein AM जोड़ें. परख की शुरुआत करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर अंधेरे में calcein लेबल कोशिकाओं रखें. शेयर calcein भंगCalcein DMSO में और एक बार पूर्वाह्न 0.1% से अधिक नहीं होना चाहिए DMSO के मीडिया अंतिम एकाग्रता में पतला है. कोशिकाओं से 30-45 मिनट धोने calcein बजे के बाद (ऊपर 4.1 कदम) और प्रयोग इस प्रकार है के साथ जारी है.
  2. T-75 फ्लास्क 1 मिलीलीटर trypsin-EDTA जोड़कर कोशिकाओं Trypsinize.
  3. Trypsinization पूर्ण होने पर, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन एक अंतिम DMEM में 10ml की मात्रा 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, 1mm सोडियम पाइरूवेट, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन कोशिकाओं resuspending द्वारा trypsin बेअसर, और.
  4. 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर कोशिकाओं गुच्छों को दूर करने के लिए.
  5. 7.5 x 10 6 DMEM में कोशिकाओं / एमएल, 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं और resuspend कोशिकाओं की गणना, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन.

5 ट्यूब गठन परख

  1. पूर्व बीएमई प्रेम नहीं करता तो थाली लोड करने के लिए 20-30 मिनट के लिए फ्रिज में या बर्फ पर 24 अच्छी तरह से थाली और 1 मिलीलीटर सुझावों रखेंaturely जमना.
  2. Pipet 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में कम वृद्धि कारक बीएमई के 250 μl. वितरण जबकि अपने अंतिम पड़ाव तक पिपेट निराशाजनक नहीं द्वारा बुलबुले बनाने से बचें. पर्याप्त बीएमई अच्छी तरह से केंद्र जब meniscus रूपों में रहता है कि ध्यान रखना; मैट्रिक्स भी पतली है, तो कोशिकाओं केवल एक monolayer बनेगी.
  3. सीओ बीएमई जमना 2 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी तरह से थाली सेते हैं और 5%.
  4. बीएमई रखा है एक बार, resuspended 3 बी -11 कोशिकाओं (लगभग 75,000 कोशिकाओं) का 10 μl के साथ वातानुकूलित मीडिया के लगभग 300 μl मिश्रण.
    1. वातानुकूलित मीडिया और इस्तेमाल endothelial सेल प्रकार के आधार पर चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या की मात्रा समायोजित करें, और गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए वातानुकूलित मीडिया के धारावाहिक dilutions परीक्षण. तुलना की कोशिकाओं विभिन्न परिस्थितियों में हो गई है, तो मीडिया हालत का प्रयोग किया गया है जो कोशिकाओं की संख्या वातानुकूलित मीडिया मात्रा मानक के अनुसार.
  5. ट्यूब wilएल 2-4 घंटे के भीतर आकार लेने लगते हैं. वातानुकूलित मीडिया में वाहिकाजनक कारक एकाग्रता पर निर्भर करता है, शिखर ट्यूब गठन घंटा और परख के समय 3 और 12 के बीच अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी हो सकता है. बजाय अमर कोशिकाओं के प्राथमिक endothelial कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, प्रारंभिक ट्यूब गठन के कई घंटे की देरी हो सकती है.
    1. ट्यूब अक्सर apoptosis गुजरना होगा 18 घंटे और endothelial कोशिकाओं के भीतर खराब करने के लिए शुरू हो जाएगा.
  6. शिखर ट्यूब गठन के समय, अच्छी तरह से ध्यान से महाप्राण मीडिया बीएमई पर ट्यूब नेटवर्क में खलल न डालें से बचने के लिए.
    1. 1 मिलीलीटर DPBS, तो महाप्राण के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धो लें.
      1. तत्काल दृश्य के लिए, कोशिकाओं 4.1.1 के रूप में calcein AM साथ दाग रहे थे तो एक डिजिटल कैमरा, या प्रतिदीप्ति / confocal खुर्दबीन से जुड़ी एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से और छवि ट्यूब नेटवर्क से 1 मिलीलीटर ताजा DPBS जोड़ें.
      2. बाद में दृश्य के लिए ट्यूब नेटवर्क को ठीक, और प्रत्येक के लिए 4% paraformaldehyde जोड़ने के लिएअच्छी तरह से aspirated और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
        1. , Paraformaldehyde निकालें DPBS के साथ दो बार धोने, तो प्रत्येक अच्छी तरह से 1mL ताजा DPBS जोड़ें.
        2. कुछ ट्यूबों इस प्रक्रिया के दौरान तोड़ सकता है के रूप में पूर्व निर्धारण करने के लिए microscopically छवि.

ट्यूब नेटवर्क के 6 मात्रा

  1. अन्वेषक की पसंद के आधार पर कई अलग अलग तरीकों से ट्यूब नेटवर्क यों, और कई कंप्यूटर प्रोग्राम निम्नलिखित मानकों को मापने की क्षमता है: ट्यूबों की संख्या; छोरों / meshes की संख्या; शाखा साइटों / नोड्स की संख्या; ट्यूब की लंबाई.
  2. ऐसे ट्यूब नेटवर्क की मात्रा का ठहराव के लिए एंजियोजिनेसिस विश्लेषक प्लगइन 16 के साथ छवि जम्मू के रूप में प्रतिनिधि कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग करें.

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Representative Results

माउस 3 बी -11 endothelial कोशिकाओं जम कम वृद्धि कारक बीएमई पर वरीयता प्राप्त थे - इस परख में, उत्पाद Matrigel इस्तेमाल किया गया था - और समय के साथ पीछा किया. चित्र 1 में दिखाया गया है, या तो माउस केरेटिनकोशिकाओं या fibroblasts द्वारा स्रावित वाहिकाजनक कारकों समय के साथ ट्यूब गठन के उत्प्रेरण के लिए सक्षम हैं. Endothelial कोशिकाओं की ओर पलायन और चढ़ाना के 1-2 घंटे के भीतर छोटे शाखाओं आकार लेने लगते हैं. अधिकतम ट्यूब गठन के पहले से केरेटिनकोशिकाओं से प्राप्त वातानुकूलित मीडिया का उपयोग कर 4-6 घंटा तक पहुँच गया था. 24 घंटा से, कुछ शाखाओं बने रहे, लेकिन कोशिकाओं के कई apoptotic बन गया और ट्यूब काट करने के लिए शुरू किया.

सेल नंबर ट्यूब गठन पर एक गहरा प्रभाव (चित्रा 2) है. कोशिकाओं की संख्या अपर्याप्त है मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, कुछ ट्यूबों फार्म और नेटवर्क बहुत कम है. अधिक कोशिकाओं वरीयता प्राप्त हैं, ट्यूब नेटवर्क और अधिक व्यापक हो जाता है. हालांकि, एक एकाग्रता की बहुत अधिक में, कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट या फार्म शुरूmonolayers, और उपचार समूहों के बीच मतभेद नकाबपोश हो जाते हैं.

3 बी -11 कोशिकाओं के साथ ट्यूब गठन के दूसरे और छठे अंश के बीच कोशिकाओं के साथ सबसे अच्छा काम करता है. छठे पारित होने के बाद, कोशिकाओं के रूप में व्यापक एक नेटवर्क के रूप में नहीं है; कोशिकाओं दसवें पारित होने के बाद किसी भी बड़े नेटवर्क के रूप में नहीं होगा. प्रकोष्ठों पर्याप्त ट्यूब गठन (चित्रा 3) यह सुनिश्चित करने के लिए तरल नाइट्रोजन भंडारण से पुनर्जीवित करने के बाद दो मार्ग की एक न्यूनतम होनी चाहिए. 3 बी -11 की विकास दर कोशिकाओं का 25% मिला हुआ अगले दिन फ्लास्क निकलेगा एक दिन passaged कि इतनी तेजी से होता है.

छवियों को आसानी से 4X और 20X के बीच उद्देश्यों का उपयोग चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रलेखित किया जा सकता है. फ्लोरोसेंट छवियों वांछित हैं हालांकि, अगर calcein AM जोड़ा जा सकता है और ट्यूब नेटवर्क प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) के माध्यम से कल्पना. का पता लगाने और ट्यूब नेटवर्क के गठन यों कई अलग अलग तरीके हैं. सबसे आम methoविश्लेषण के डी एस ट्यूबों की संख्या की मात्रा का ठहराव शामिल, नोड्स, / meshes, या ट्यूब की लंबाई छोरों. इन मापदंडों के हाथ से गिना जा सकता है या एंजियोजिनेसिस विश्लेषक प्लगइन के साथ एनआईएच ImageJ सहित विभिन्न इमेजिंग कार्यक्रमों के माध्यम से किया जा सकता है. विश्लेषण के इन प्रकार के प्रत्येक के उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1 समय के साथ माउस 3 बी -11 endothelial सेल ट्यूब गठन. 1 x 10 5 कोशिकाओं की कुल fibroblasts या केरेटिनकोशिकाओं या तो से वातानुकूलित मीडिया के 350 μl के साथ कम वृद्धि कारक बीएमई पर अच्छी तरह से प्रति वरीयता प्राप्त थे. ट्यूब गठन के 24 घंटे के कोर्स पर दर्ज किया गया था.

चित्रा 2 < br /> चित्रा 2 endothelial सेल ट्यूब गठन पर सेल नंबर का प्रभाव. 3 बी -11 कोशिकाओं से 5 एक्स 10 4 तो fibroblast या keratinocyte वातानुकूलित मीडिया, और 350 μl के साथ 2 एक्स 10 5 से लेकर सांद्रता में कुओं में वरीयता प्राप्त थे समय के साथ पीछा किया. कुओं 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं के साथ चढ़ाया और वेल्स में कोशिकाओं की भीड़ 2 x 10 5 कोशिकाओं के साथ चढ़ाया में ट्यूब गठन की कमी नोट.

चित्रा 3
चित्रा 3 endothelial सेल ट्यूब गठन पर पारित होने के असर को. की कुल 1 x 10 5 कोशिकाओं बीतने 0, 1 में कम वृद्धि कारक बीएमई पर अच्छी तरह से प्रति वरीयता प्राप्त थे, या 2 छोटे ट्यूब गठन के पारित होने के 2 से पहले देखा गया था.

4 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 5in "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 51312 / 51312fig4highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 4 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और ट्यूब गठन की मात्रा का ठहराव. परख की शुरुआत से पहले, endothelial कोशिकाओं प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं कल्पना करने के क्रम में calcein AM के साथ इलाज किया जा सकता है. ट्यूब की संख्या की गणना सहित गठन ट्यूब नेटवर्क बढ़ाता के लिए कई सूचना दी तरीके से किया गया है, / meshes, शाखा साइटों / नोड्स, या ट्यूब की लंबाई छोरों. यहाँ, हम एंजियोजिनेसिस प्लगइन सॉफ्टवेयर के साथ एनआईएच छवि जम्मू एक calcein पर इस्तेमाल कुल नोड्स (लाल) का पता लगाने के दाग ट्यूब नेटवर्क (ए) हूँ जा सकता है कि कैसे संयोजन (बी) में / ट्यूब (गुलाबी) / जाल (नीला) दिखाने और विलय नेटवर्क पर (सी). इसके अतिरिक्त, इस कार्यक्रम को व्यक्तिगत रूप से (जी नोड्स (डी), ट्यूब (ई) का पता लगाने, या फिर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (एफ) के जाल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

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Discussion

एंजियोजिनेसिस शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं दोनों में शामिल है. Angiogenesis में शामिल तंत्र के अध्ययन के angiogenesis में प्रमुख कदम पुनरावृत्ति कि assays के उपयोग की आवश्यकता है. endothelial सेल ट्यूब गठन परख अन्य assays पर कई लाभ प्रदान करता है. यह सेट अप करने के लिए आसान है अपेक्षाकृत सस्ती है, घंटे के भीतर नलिकाओं का उत्पादन, और quantifiable है. इसके अलावा, यह 24 या 96 अच्छी तरह प्लेटें में पूरा किया जा सकता है, और इस तरह उत्तेजित कि कारकों की पहचान या angiogenesis को बाधित करने के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम अपने प्रयोगों के लिए 3 बी -11 माउस endothelial कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, परख HUVEC और SVEC सहित मानव या murine endothelial लाइनों की एक किस्म के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.

एक endothelial सेल ट्यूब गठन परख करने के लिये, endothelial कोशिकाओं समर्थक या antiangiogenic कारकों में शामिल है और कम वृद्धि कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के ऊपर चढ़ाया जो वातानुकूलित मीडिया के साथ मिश्रित कर रहे हैं. Endotheliअल कोशिकाओं घंटा और लुमेन युक्त नलिकाओं 2 घंटे के भीतर दिखाई शुरू 1 के भीतर खुद को संरेखित करने के लिए शुरू करते हैं. ट्यूब गठन के एक चरण विपरीत उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखे जा सकते हैं, या calcein AM प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना परख और ट्यूबों के समापन पर जोड़ा जा सकता है.

परिणाम कई मायनों में अनुकूलित किया जा सकता है. प्रथम, प्राथमिक कोशिकाओं दूसरे और छठे अंश के बीच आदर्श होना चाहिए. पूर्व दूसरे के लिए या दसवें पारित होने के बाद कोशिकाओं का प्रयोग अधिकतम ट्यूब गठन के लिए अनुकूल नहीं है. दूसरा, सेल नंबर का इस्तेमाल सेल प्रकार और रेखा के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए. माउस 3B-11 के लिए, हम माउस keratinocyte और fibroblast वातानुकूलित मीडिया के साथ हो गई एक 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह / 75,000-100,000 कोशिकाओं का उपयोग कर अधिक से अधिक प्रतिक्रिया मिल गया. बहुत कुछ कोशिकाओं का उपयोग कर एक monolayer या clumping के गठन में कम से कम या कोई ट्यूब गठन, और भी कई कोशिकाओं परिणामों में यह परिणाम है. अंत में, प्रयोग किया वातानुकूलित मीडिया की मात्रा सामान्य होना चाहिएसेल नंबर के बजाय प्रोटीन एकाग्रता के लिए ized. 10% FBS के साथ सामान्य मीडिया का इस्तेमाल करते हैं, तो FBS एक मानक प्रोटीन परख के माध्यम से मापा प्रोटीन एकाग्रता के बहुमत के लिए खाते में जाएगा. उपचार अत्यधिक चर हो सकता है के बीच एकाग्रता, भले ही कोशिकाओं की संख्या, और इसलिए कंडीशनिंग के दौरान स्रावित प्रोटीन की सांद्रता लगभग समान दिखेगा.

संक्षेप में, ट्यूब गठन परख angiogenesis के इन विट्रो मापन के लिए एक, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील तरीका है. यह अन्य assays अधिक फायदे हैं और संभावित सक्रियण या angiogenesis के निषेध में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि जीन और रास्ते निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी तरीका है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है, और NCI द्वारा UA5CA152907 अनुदान दिया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate Corning 3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced BD Biosciences 354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x) Life Technologies 25030-081
Gibco pen strep Life Technologies 15140-122
Gibco DMEM (1x) Life Technologies 11965-092
Gibco DPBS (1x) Life Technologies 14190-144
Fetal Bovine Serum Atlas Biologicals F-0500-A
Calcein AM Life Technologies C3100MP
DMSO ATCC 4-X

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References

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के लिए endothelial सेल ट्यूब गठन परख<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Angiogenesis के अध्ययन
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DeCicco-Skinner, K. L., Henry, G.… More

DeCicco-Skinner, K. L., Henry, G. H., Cataisson, C., Tabib, T., Gwilliam, J. C., Watson, N. J., Bullwinkle, E. M., Falkenburg, L., O'Neill, R. C., Morin, A., Wiest, J. S. Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (91), e51312, doi:10.3791/51312 (2014).

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