Summary
De buisvorming assay is een snelle, meetbare werkwijze voor het meten in vitro angiogenese. Endotheelcellen worden gecombineerd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan extract. Tube vorming gebeurt binnen enkele uren en nieuw gevormde buisjes gemakkelijk gekwantificeerd.
Abstract
Angiogenese is een belangrijke werkwijze voor normale ontwikkeling weefsel en wondgenezing, maar wordt ook geassocieerd met een verscheidenheid aan pathologische aandoeningen. Met dit protocol kan angiogenese worden gemeten in vitro in een snelle, kwantificeerbare wijze. Primaire of geïmmortaliseerde endotheel cellen gemengd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan matrix. De endotheliale cellen vormen capillaire structuren in reactie op angiogene signalen in geconditioneerd medium. De buis formatie optreedt snel met endotheelcellen beginnen zich aan te sluiten binnen 1 uur en-lumen met buisjes beginnen te verschijnen binnen 2 uur. Buizen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een fase-contrast omgekeerde microscoop, of de cellen worden behandeld met calceïne AM vóór de assay en pijpen gevisualiseerd door fluorescentie of confocale microscopie. Het aantal filialen / nodes, lussen / meshes of het aantal of lengte van buizen gevormde gemakkelijk worden gekwantificeerd als maat in vitro angiogenese. Samenvattend, kan deze test gebruikt worden om genen en routes die betrokken zijn bij de bevordering of remming van angiogenese in een snelle, reproduceerbare en kwantitatieve wijze identificeren.
Introduction
Angiogenese, de ontwikkeling van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande schepen, is essentieel voor een verscheidenheid van werkwijzen waaronder orgaangroei, embryonale ontwikkeling en wondgenezing 1-3. Nieuw ontwikkelde bloedvaten, bekleed met endotheelcellen, toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar weefsels bevorderen immuunbewaking door hematopoietische cellen en afvoer van afvalproducten 2,4. Angiogenese is van groot belang tijdens de embryonale en foetale ontwikkeling. Dit proces blijft slapende in de volwassen behalve in tijden van wondheling, skeletopbouw, zwangerschap of tijdens de menstruele cyclus 1-3.
In de afgelopen twee decennia de belangrijkste moleculaire mechanismen die angiogenese reguleren zijn begonnen te ontstaan. Angiogenese is een strak gereguleerde evenement, in evenwicht gehouden door pro-en anti-angiogene signalen waaronder integrines, chemokines, angiopoietinen, zuurstof sensing agenten, junctionele moleculen en endogene remmers 5. Zodra proangiogenic signalen zoals basis fibroblast groeifactor (bFGF), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), en epidermale groeifactor (EGF) activeert endotheliale celreceptoren de endotheelcellen proteasen de basale membraan degraderen. De endotheelcellen vervolgens prolifereren en migreren, die kiemen met een snelheid van enkele millimeters per dag 6,7.
Angiogenese is geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen zoals kanker, psoriasis, diabetische retinopathie, artritis, astma, auto-immuunziekten, infectieziekten en atherosclerose 8-10. Vanwege het belang van angiogenese in verschillende ziekten, het begrijpen van de genen en pathways die regelen dit proces is cruciaal voor de ontwikkeling van een beter therapeutica.
De buisvorming assay is een snelle en kwantitatieve werkwijze voor het bepalen van genen of routes die betrokken zijn bij angiogenese. Voor het eerst beschreven in 1988,de uitgangspunten van deze test zijn dat endotheelcellen behouden de mogelijkheid om te delen en snel migreren naar aanleiding van angiogene signalen 11-13. Verder worden endotheelcellen geïnduceerd te differentiëren en vormen buisvormige structuren indien gekweekt op een matrix van basaal membraan extract (BME). Deze buizen bevatten een lumen omringd door endotheelcellen elkaar verbonden door junctional complexen. Tube vorming gebeurt snel met de meeste buizen vormen in deze test binnen 2-6 uur, afhankelijk van de hoeveelheid en de aard van de angiogene stimuli.
Verschillende soorten endotheelcellen kan voor deze test zowel primaire cellen geïmmortaliseerde cellijnen 14,15. De cellijn die voor dit artikel was mouse 3B-11, maar dezelfde methode kan worden toegepast met andere endotheliale cellijnen zoals SVEC4-10 (muis) of primaire endotheelcellen zoals HUVEC (humane) cellen. Afhankelijk van de cellijn wordt gebruikt en of de endotheliale cells worden omgezet of niet-getransformeerde, zal optimalisatie moeten worden uitgevoerd om de ideale tijd nodig voor een goede vaatvorming identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Verzameling van geconditioneerde media te testen voor Angiogene Potentiële
- Grow primaire of geïmmortaliseerde cellen worden getest angiogene of anti-angiogene potentieel in natieve of lage serum media en laat de geconditioneerde media.
- Ook moet geconditioneerde media direct of in porties verdeeld en bewaard bij -80 ° C gedurende enkele maanden. Gebruik nonconditioned natieve of laag serum media als een negatieve controle, en gebruik maken van niet voorziene compleet groeimedium (10% FBS of geschikte concentratie) als een positieve controle. Als alternatief om potentiële stimulatoren van angiogenese te testen, aan te vullen houtskool gestript media ontbreekt groeifactoren met bekende concentraties van bepaalde eiwitten van belang en te vergelijken met alleen groeifactor vrije media.
2 Bereiding van endotheelcellen Vóór Assay
- Twee dagen vóór de assay, passage 3B-11 cellen in een nieuwe T-75 kolf. Passage aantal cellen is belangrijk. Deze test werkt het beste wanneer cellen tussen de tweede en zesde passages. De assay werkt niet goed wanneer endotheelcellen worden gebruikt voor de tweede of na de tiende passage.
- Kweek cellen gedurende 24 uur in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U / ml penicilline, en 100 ug / ml streptomycine.
- Een dag voorafgaand aan de test, serum verhongeren 3B-11 cellen als volgt:
- Zuig media uit de 3B-11 cellen.
- Voeg verminderde serum media DMEM gesupplementeerd met 0,2% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U / ml penicilline, en 100 ug / ml streptomycine.
- Kweek cellen nog eens 24 uur.
3 Bereiding van reagentia Vóór Assay
OPMERKING: BME concentraties zijn zeer variabel afhankelijk van veel. BME werkt niet goed als de concentratie lager is dan 10 mg / ml, dus de BME fabrikant moet vóór de aankoop om ervoor te zorgen worden gecontacteerdverwerving van een voldoende geconcentreerde veel.
- Ontdooi verminderde groeifactor BME in de koelkast. BME stolt wanneer warm, dus het moet koud bewaard voor gebruik. BME kunnen in de koelkast worden bewaard gedurende enkele weken, of in porties verdeeld en bij -80 ° C ingevroren.
- Een verminderde groei factor BME heeft de voorkeur ten opzichte van traditionele BME. Het ontbreken van angiogene factoren in de BME zal het gemakkelijker volgens welke factoren uit het geconditioneerde media op vaatvorming observeren.
- Dooi media te testen.
4 Bereiding van endotheelcellen onmiddellijk voor Assay
- Wash 3B-11 cellen in DPBS.
- Als visualisatie met fluorescentie of confocale microscopie gewenst, vóór het wassen 3B-11 cellen, voeg calceïne AM aan de endotheelcellen in media bij een uiteindelijke concentratie van 2 ug / ml. Plaats calceïne gelabelde cellen in het donker bij 37 ° C en 5% CO2 vóór de start van de analyse. Ontbinden voorraad calceïneAM in DMSO en wanneer calceïne wordt in media eindconcentratie van DMSO verdund mag niet meer dan 0,1%. Na 30-45 min wasbeurt calceïne AM uit de cellen (stap 4.1 hierboven) en ga verder met het experiment volgt.
- Trypsinize cellen door toevoeging van 1 ml trypsine-EDTA-T-75 kolf.
- Na behandeling met trypsine is voltooid, neutraliseren trypsine door resuspenderen cellen tot een eindvolume van 10 ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U / ml penicilline, en 100 ug / ml streptomycine.
- Filter cellen door 100 um cel zeef om klonten te verwijderen.
- Tellen cellen en resuspendeer cellen om een eindconcentratie van 7,5 x 10 6 cellen / ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U / ml penicilline, en 100 ug / ml streptomycine.
5 Tube Formation Assay
- Plaats 24-well plaat en 1 ml tips in koelkast of op ijs gedurende 20-30 minuten vóór het laden van de plaat, zodat de BME niet prematurely stollen.
- Pipetteer 250 ul minder groei factor BME in elk putje van een 24-well plaat. Voorkomen dat er luchtbellen door niet het indrukken van de pipet om de laatste stop tijdens doseren. Zorg ervoor dat er voldoende BME blijft in het midden van het goed wanneer de meniscus vormen; Als de matrix is te dun, zullen de cellen slechts een monolaag vormen.
- Incubeer plaat met 24 putjes bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 minuten te stollen BME.
- Zodra BME is ingesteld, meng ongeveer 300 ul geconditioneerde media met 10 pl geresuspendeerd 3B-11 cellen (ongeveer 75.000 cellen).
- Het volume van geconditioneerde media en aantal cellen uitgeplaat afhankelijk endotheliale gebruikte celtype, en test de seriële verdunningen van het geconditioneerde medium activiteit tonen. Als vergelijking cellen gekweekt onder verschillende omstandigheden normaliseren geconditioneerde media volume het aantal cellen die werden gebruikt om het medium conditioneren.
- Tubes Will beginnen te vormen binnen 2-4 uur. Afhankelijk angiogene factor concentratie in het geconditioneerde medium, kan Extra buisvorming optreden tussen 3 en 12 uur en de timing van de test moet worden geoptimaliseerd. Bij het werken met primaire endotheelcellen plaats van geïmmortaliseerde cellen kunnen initiële vaatvorming vertraagd door verscheidene uren.
- Buizen vaak beginnen afnemen binnen 18 uur en endotheliale cellen apoptose ondergaan.
- Bij de piek vaatvorming zorgvuldig aspireren media van de put naar de buis te verstoren netwerk op BME.
- Was elk putje met 1 ml DPBS, dan aspireren.
- Voor directe visualisatie, voeg 1 ml vers DPBS aan elk putje en beeld het buizennetwerk behulp van een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een digitale camera, of fluorescentie / confocale microscoop als de cellen werden gekleurd met calceïne AM zoals in 4.1.1.
- Aan de buis netwerk voor later visualisatie te repareren, en voeg 4% paraformaldehyde aan elkegoed afgezogen en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder paraformaldehyde, tweemaal spoelen met DPBS, voeg 1 ml vers DPBS aan elk putje.
- Microscopisch beeld van vóór de fixatie zo weinig buizen tijdens deze procedure kan breken.
- Was elk putje met 1 ml DPBS, dan aspireren.
6 Kwantificering van Tube Netwerk
- Kwantificeer de buis netwerk op verschillende manieren, afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker en verscheidene computer programma's vermogen de volgende parameters gemeten: aantal buizen; aantal lussen / mazen; aantal filialen / knooppunten; lengte van buizen.
- Gebruik vertegenwoordiger computerprogramma als Afbeelding J met het Angiogenese Analyzer plug 16 voor de kwantificering van de buis netwerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mouse 3B-11 endotheelcellen werden gezaaid op gestolde verlaagde growth factor BME - in deze assay, werd het product Matrigel bouw - en tijd gevolgd. Zoals getoond in figuur 1, angiogene factoren afgescheiden door een muis keratinocyten of fibroblasten kunnen induceren buisvorming tijd. Endotheelcellen migreren en beginnen om kleine takken binnen 1-2 uur in de platen te vormen. Maximale vorming buis werd bereikt met 4-6 uur met geconditioneerde media eerder verkregen uit keratinocyten. Door 24 uur, sommige takken bleven, maar veel van de cellen werd apoptotische en buizen begon te verbreken.
Cel nummer heeft een grote invloed op de vorming van buis (figuur 2). Wanneer een onvoldoende aantal cellen gezaaid op de matrix, paar buizen vormen en het netwerk is minimaal. Naarmate er meer worden uitgezet, de buis netwerk wordt meer uitgebreid. Echter, bij een te hoge concentratie van de cellen beginnen te klonteren of vormmonolagen, en de verschillen tussen de behandelgroepen worden gemaskeerd.
Tube formatie met 3B-11 cellen werkt het beste met cellen tussen de tweede en zesde passages. Na de zesde passage, hoeft cellen niet vormen zo uitgebreid een netwerk; cellen zal niet vormen geen grote netwerk na de tiende passage. De cellen moeten een minimum van twee passages hebben na de heropleving van vloeibare stikstof opslag voldoende buis vorming (figuur 3) te zorgen. Het groeitempo van de 3B-11 is zo snel dat 25% van de cellen gepasseerd op een dag zal opleveren een samenvloeiing van het destillaat de volgende dag.
Beelden kunnen eenvoudig worden gedocumenteerd door middel van fase-contrast-microscopie met behulp van doelstellingen tussen 4X en 20X. Indien fluorescentiebeelden gewenst calceïne AM worden toegevoegd en de buis netwerk gevisualiseerd door fluorescentie of confocale microscopie (figuur 4). Er zijn verschillende manieren voor het detecteren en kwantificeren tube netwerkvorming. De meest voorkomende methods van de analyse te betrekken kwantificering van het aantal buizen, knopen, lussen / mazen, of de lengte van de buizen. Deze parameters kunnen worden geteld met de hand of kan worden gedaan door middel van verschillende imaging programma's, met inbegrip van NIH ImageJ met het Angiogenese Analyzer plugin. Voorbeelden van elk van deze soorten analyses zijn getoond in figuur 4.
Figuur 1 Mouse 3B-11 endotheelcellen buisvorming tijd. Totaal 1 x 10 5 cellen per well op verkorte growth factor BME met 350 ui geconditioneerd medium van zowel fibroblasten of keratinocyten. De buisvorming werd opgenomen in de loop van 24 uur.
< br /> Figuur 2 Het effect van het aantal cellen op endotheelcel buisvorming. 3B-11 cellen werden geënt in putjes bij concentraties variërend van 5 x 04-2 oktober x 10 5 met 350 ul van fibroblasten of keratinocyten geconditioneerde medium en gevolgd in de tijd. Merk het gebrek aan vaatvorming in de putjes uitgeplaat met 5 x 10 4 cellen en de verdringing van cellen in de putjes uitgeplaat met 2 x 10 5 cellen.
Figuur 3 Het effect van passage nummer op endotheelcellen buisvorming. Totaal 1 x 10 5 cellen per well op verkorte groeifactor BME bij passage 0, 1 of 2 Little vorming buis werd eerder gezien passage 2.
4 "fo: content-width =" 5in "src =" / files / ftp_upload / 51312 / 51312fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 4 Fluorescentie microscopie imaging en kwantificatie van vaatvorming. Vóór de start van de analyse kan de endotheelcellen met calceïne AM worden behandeld om de cellen met behulp van fluorescentie of confocale microscopie visualiseren. Er zijn verscheidene werkwijzen gerapporteerd voor het kwantificeren van de gevormde buis netwerk, waaronder het tellen van het aantal buizen zijn, lijnen / mazen filiaalsites / nodes, of de lengte van de buizen. Hier laten we zien hoe NIH Afbeelding J met het Angiogenese plugin software kan worden gebruikt op een calceine AM gebrandschilderde buis netwerk (A) tot de totale nodes (rood) op te sporen / buizen (roze) / mesh (blauw) in combinatie (B) en samengevoegd on network (C). Bovendien kan het programma worden individueel detecteren knooppunten (D), buizen (E), of gaas (F) dat vervolgens kan worden gekwantificeerd (G
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Angiogenese is betrokken bij zowel de fysiologische en pathologische processen. Bestuderen mechanismen betrokken bij angiogenese vereist het gebruik van testen die de belangrijkste stappen in angiogenese recapituleren. De endotheelcel vaatvorming assay biedt verscheidene voordelen boven andere assays. Het is gemakkelijk op te zetten, is relatief goedkoop, produceert buisjes binnen enkele uren, en is meetbaar. Verder kan in 24-of 96-well platen voltooid en kan dus worden gebruikt voor high throughput screening om factoren te identificeren stimuleren of remmen angiogenese. Hoewel we gebruikten 3B-11 muis endotheelcellen onze experimenten, kan de test worden uitgevoerd met diverse humane of muizen endotheel lijnen, waaronder HUVEC en SVEC.
Om een endotheelcellen buis vorming analyse uit te voeren, worden endotheelcellen gemengd met geconditioneerde media die pro of anti-angiogene factoren bevat en vergulde over verminderde groeifactor basaal membraan matrix. Endothelial cellen beginnen zich aan te sluiten binnen 1 uur en-lumen met buisjes beginnen te verschijnen binnen 2 uur. De buisvorming kan worden gevisualiseerd met behulp van een fase-contrast omgekeerde microscoop, of calceïne AM kan worden toegevoegd aan het einde van de assay en pijpen gevisualiseerd via fluorescentie of confocale microscopie.
Resultaten kunnen worden geoptimaliseerd op verschillende manieren. Ten eerste moeten primaire cellen idealiter tussen de tweede en zesde passages. Gebruik van cellen voorafgaand aan de tweede of na de tiende passage niet bevorderlijk voor maximale vaatvorming. Ten tweede, het aantal cellen moet worden geoptimaliseerd op basis van het type en de stippellijn gebruikte cel. Voor mouse 3B-11, vonden we maximale respons met 75.000-100.000 cellen / putje in een plaat met 24 putjes gekweekt met muizen keratinocyten en fibroblasten geconditioneerde media. Het gebruik van te weinig cellen resulteert in minimale of geen buis vorming, en te veel cellen resulteert in de vorming van een monolaag of klonteren. Tenslotte moet de hoeveelheid geconditioneerde media gebruikt normaalseerd op het aantal cellen in plaats van eiwit concentratie. Bij gebruik van gewone media met 10% FBS, zal de FBS verantwoordelijk voor het merendeel van de eiwitconcentratie gemeten door een standaard eiwit assay. De concentratie zal er nagenoeg identieke hoewel aantal cellen en derhalve de concentratie van de eiwitten uitgescheiden tijdens het conditioneren, tussen behandelingen zeer variabel kan zijn.
Samengevat, de buisvorming assay is een snelle, reproduceerbare en gevoelige werkwijze voor het in vitro meten van angiogenese. Het heeft voordelen boven andere assays en is een nuttige methode om genen en pathways die mogelijk een belangrijke rol in de activatie of remming van angiogenese bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Cancer Institute van de National Institutes of Health, en door het NCI verlenen UA5CA152907.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Costar 24-well tissue culture-treated plate | Corning | 3524 | |
| BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Gibco 0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Gibco L-glutamine 200 mM (100x) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco pen strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gibco DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Gibco DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Kerbel, R. S.
- Folkman, J.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
- Carpentier, G.
