Framställning av DNA-tvärbundet Polyacrylamide Hydrogeler

Summary

Vårt laboratorium har utvecklat DNA-tvärbunden polyakrylamid hydrogeler, ett dynamiskt hydrogelsystem, för att bättre förstå effekterna av modulerande vävnad styvhet på cellfunktion. Här ger vi scheman, beskrivningar och protokoll för att förbereda dessa hydrogel.

Abstract

Mechanobiology är ett framväxande vetenskapsområde som behandlar den kritiska roll fysiska signaler för att styra cell morfologi och funktion. Till exempel är effekten av vävnad elasticitet på cellfunktionen ett större område i mechanobiology forskning eftersom vävnaden styvhet modulerar med sjukdomen, utveckling, och skadan. Statiska vävnadsliknande material eller material som inte kan förändra styvhet när celler är pläterade, övervägande används för att undersöka effekterna av vävnads styvhet på cellfunktioner. Även information som samlats in från statiska studier är värdefullt, dessa studier tyder inte på den dynamiska karaktären hos den cellulära mikromiljö in vivo. För att bättre hantera effekterna av dynamisk styvhet på cellfunktion, utvecklade vi ett DNA-tvärbunden polyakrylamid hydrogel systemet (DNA geler). Till skillnad från andra substrat, DNA-geler har möjlighet att minska eller öka i styvhet efter tillverkning utan stimuli. DNA-geler består av DNA crosslbläck som polymeriseras i en polyakrylamid ryggrad. Lägga till och ta bort tvärbindningar via leverans av enkelsträngat DNA möjliggör tidsmässiga, rumsliga och reversibel styrning av gel elasticitet. Vi har visat i tidigare rapporter som dynamisk modulering av DNA-gel elasticitet påverkar fibroblaster och neuron beteende. I den här rapporten och video, erbjuder vi ett schema som beskriver DNA gel tvärbindningsmekanismer och steg-för-steg-instruktioner om förberedelser DNA geler.

Introduction

Statiska och dynamiska substrat finns två kategorier av biomaterial som utvecklats för att studera effekterna av vävnadselasticitet eller stelhet på cellfunktion. Statiska substrat inte kan ändra sina fysiska egenskaper när de tillverkas och / eller en gång celler stryks. Polyakrylamid (PA) geler var de första tvådimensionella, statiska substrat som syntetiserades för mechanobiology utredningar ^5,17. PA geler är lätt att förbereda, billig, mångsidig, och kan tillverkas med ett brett utbud av elastiska moduler. Även om dessa tekniska fördelar gör PA geler en allmänt vedertagen substrat, statiska substrat är inte ett tecken på den dynamiska karaktären av den extracellulära matrix (ECM) och omgivande cellmiljö in vivo. Exempelvis undergår ECM styvhets förändringar som ett resultat av skada, utveckling, eller sjukdom. Dynamiska substrat därför gynnas som vävnadsliknande substrat modeller i mechanobiology studier <sup> 22,24,25.

Många syntetiska, har naturliga, två-dimensionell, tredimensionella, statiska och dynamiska biomaterial tagits fram för att efterlikna vävnads styvhet ^{1,3,6,16,23,26.} Några dynamiska substrat kräver värme, UV, elektrisk ström, joner och pH-förändringar för att ändra deras mekaniska egenskaper ^{2,4,7,8,12,15,16,} men dessa stimuli kan begränsa hydrogel bio-ansökan. DNA-tvärbunden polyakrylamid hydrogeler (DNA geler) är dynamiska tvådimensionella elastiska substrat. DNA tvärbindningar möjliggör tids, rumslig och reversibel modulering av DNA-gel styvhet genom tillsats av enkelsträngat DNA (ssDNA) till media eller buffert ^{9-11,13,14,18,21.} Till skillnad från de tidigare nämnda dynamiska geler där stimuli tillämpas för modulering av elasticitet, DNA-geler förlitar sig på spridning av tillämpad ssDNA för ändring av elasticitet. Därför är den övre gelytan, där celler odlas, är det första området moduleras eftersom hastigheten of elasticitet modulering är beroende av den gel tjocklek.

DNA-geler liknar deras PA gel motsvarigheter i att de har en polyakrylamid ryggrad, men de bis-akrylamid tvärbindningar ersätts med tvärbindningar består av DNA (figur 1). Två ssDNA (SA1 och SA2) hybridiserar med en tvärbindnings sträng (L2) för att kompensera DNA tvärbindningar i gelen. SA1 och SA2 har olika sekvenser som både innehåller en Acrydite modifiering vid 5'slutet för effektiv inkorporering i PA-nätverket. För beredning av geler, SA1 och SA2 är individuellt polymeriseras till ett PA ryggrad och därefter är den polymeriserade SA1 och SA2 blandas. L2, tvärbind, läggs till i SA1 och SA2 blandning. L2 bassekvensen kompletterar både SA1 och SA2 sekvenser och L2 hybridiserar med SA1 plus SA2 för att bilda DNA-tvärbindningar. Initial, DNA gel elasticitet bestäms både L2 koncentrationer och tvärbindning (tabellerna 1 </strong> och 2). DNA-geler som innehåller lika stökiometriska mängder L2, SA1 och SA2 är de styvaste geler eftersom SA1 och SA2 är 100% tvärbunden med L2 (betecknad som 100% geler). Lägre koncentrationer av L2 resultat i en lägre andel av DNA tvärbindning och därför är mjukare DNA geler. Gel så låga som 50% tvärbunden (betecknad som 50% geler) har konstruerats ^9-11.

Figur 1 DNA gel tvärbindning och uncrosslinking schema ^{9-11,13,14,18,21} Steg 1:. SA1 (röd) och SA2 (blå) är individuellt polymeriseras i en polyakrylamid ryggrad (svart). Efter polymerisation är SA1 och SA2 polymeriserade lösningar blandas. Steg 2: L2 (grön) tillsättes och hybridiserar med SA1 plus SA2 för att bilda de tvärbindningar i gelén. Steg 3: R2 hybridiserar med than toehold av L2. Steg 4: toehold hybridisering av R2 driver unzipping av L2 från SA1 och SA2.

Till skillnad från PA-geler, kan DNA-geler stelna och mjuka efter syntes. Därför kan celler odlas på DNA-geler utsättas för dynamiska styvhetsändringar. Att styva cell vidhäftande geler, kan L2 sättas till odlingsmedia låga procentuella geler för att öka andelen tvärbindningar. För att mjuka upp cell vidhäftande geler, kan L2 tas bort för att minska andelen tvärbindningar ^10,13,21. L2 har en ytterligare toehold sekvens vid 3'-änden för att tillåta L2 till uncrosslink från SA1 och SA2 (tabell 1). Borttagning av L2 åstadkommes genom hybridisering av en återföring sträng heter R2. R2 är komplementär med den fulla längden av L2 och hybridiserar först med L2 toehold. Toehold hybridisering propels unzipping av L2 från SA1 och SA2, vilket eliminerar tvärbindning och minskar gel styvhet.

I denna rapport ochvideo, steg-för-steg-instruktioner finns för beredning av hårdnande och mjukgörande DNA geler. Medan 100% och 80% gel preparat beskrivs, kan detta protokoll anpassas för att skapa DNA-geler av andra ursprungliga och slutliga tvärbundna procentsatser. I allmänhet är 100% och 80% geler beredda, immobiliseras på täckglas, funktionaliserad, och ympades med celler. L2 sättes till mediet av 80% geler och R2 sätts till medierna av 100% geler, 48 h efter utstrykning. Tillsatsen av L2 till media stelnar 80% geler till 100% tvärbunden, medan tillägg av R2 till media mjuknar 100% geler till 80% tvärbunden. Förstyvade geler betecknas som 80 → 100% geler och mjuk geler betecknas som 100 → 80% geler i texten. För kontroll eller statiska geler, ssDNA bestående av Ts eller As levereras till en annan uppsättning av 100% och 80% geler. Efter minst två dagar efter elasticitet modulation kan celler bearbetas och analyseras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page = "always"> DNA-tvärbindning # Av baser Sequence (toehold) Modifiering Smälttemperaturen _(Tm, ° C) Kommentarer 5 '→ 3' Design 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34,9 SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23,6 L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 En 10 bp toehold sekvensen ingår. R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 är komplementär till L2 Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46,9 SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40,2 L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65,9 En 12 bp sekvens toehold ingår. R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65,9 R2 är komplementär till L2 Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55 SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56,6 L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68,8 Toehold ingår inte. Kontroll Kontroll 20-40 AAA AAA (etc.) eller TTT TTT (mm)

Tabell 1. bassekvenser för ssDNA ^{9-11,13,14,18,21.} Cellulär och mekaniska studier har använt flera different tvärbindnings mönster för att skapa DNA-geler med en rad statiska och dynamiska mekaniska egenskaper. Parametrarna module i tvärbindnings designen är bassekvens och sekvenslängden eller cross längd. Fet och kursiverade teckensnitt illustrera baspaming mellan SA1 och L2 och mellan SA2 och L2.

	Design
	1			2			3
Akrylamid Koncentration (%)	10			10			10	4
SA1 plus SA2 hybridiserades till L2 (% tvärbunden)	50	80	100	50	80	100	100	100
<strong> Elasticitet (kPa, medelvärde ± SEM)	6,6 ± 0,6	17,1 ± 0,8	29,8 ± 2,5	5,85 ± 0,62	12,67 ± 1,33	22,88 ± 2,77	25,2 ± 0,5	10,4 ± 0,6

Tabell 2. Youngs modul (E) av DNA-geler ^{9-11,13,14,18,21.} Akrylamid koncentration, tvärbindningsprocent och tvärbindningslängd kan moduleras i DNA-geler. Motiv 1, 2, och 3 har 20, 28, och 40 bp tvär längder, respektive. 100% geler för alla mönster har liknande moduler som anger tvärbindningslängden påverkar inte gel elasticitet. Men variationer i koncentration akrylamid förändrar DNA gel elasticitet.

Protocol

OBS: Hela protokollet från gelpreparat till cellbearbetningen tar minst sex dagar. Beräknad tid för gelpreparat är 8 timmar plus ett O / N inkubation. Beräknad tid för gel immobilisering och DNA glödgning är 8 timmar plus ett O / N sköljsteg. Beräknad tid för gel funktion är 2 tim. Dags för cell plätering och tillväxt är beroende av kultur typ och applikation, men det krävs minst fyra dagar. 1 Beredning av DNA-Gel OBS: Förbered DNA geler i tre dis…

Representative Results

Innan våra studier, var cell-ECM interaktioner observerats på statiska kompatibla biomaterial eller irreversibla och enkelriktade dynamiska substrat. Dessa substrat inte alltid motsvarar den dynamiska karaktären hos den cellulära mikromiljö. Vårt arbete skiftar befintliga tekniska paradigm genom att ge en mer fysiologisk modell för att studera cell ECM interaktioner på mjukgörande och hårdnande dynamiska biomaterial. I tidigare studier har vi analyserat effekterna av dynamiska substrat på celler genom att und…

Discussion

Förmågan av DNA-geler för att mjuka upp eller stelna före och efter celladhesion gör dem till en idealisk modell för att studera betydelsen av dynamiska vävnad styvhet på cellfunktion. Samtliga tre konstruktioner har använts i mekaniska och biologiska studier. Men alla tre motiv har liknande elasticiteter vid olika tvär procenttal, vilket indikerar tvärbindningslängden påverkar inte DNA-gel elasticitet (tabell 2). Däremot påverkar koncentrations akrylamid elasticitet. Dessa mönster kan s…

Materials

ssDNA	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium			Any brand.
100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com	T9285
10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	93290	TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	BP14021	Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	A3678	Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	T9281	Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12-mm diameter round coverglass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com	12-545-82
				Norland optical adhesive 72	Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com	NOA72
24-well tissue culture plate			Any brand.
				Microcentrifuge tubes			Any brand.
Sulfo-SANPAH	ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com	C111 or 22589	Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37°C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	P6407	Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I	Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com	13813	Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 X 60 cover glass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	12-544-G
Positive-displacement pipette	Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com	F148504
Heat block	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	11-718
UV light source			Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer			Any brand.
Nitrogen gas	GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/	NI 5.0UH-R