Fremstilling af DNA-tværbundet polyacrylamid Hydrogeler

Summary

Vores laboratorium har udviklet DNA-tværbundet polyacrylamid hydrogeler, et dynamisk hydrogel-system, for bedre at forstå virkningerne af modulerende væv stivhed på celle funktion. Her giver vi skemaer, beskrivelser og protokoller for at forberede disse hydrogeler.

Abstract

Mechanobiology er en ny videnskabelig område, der omhandler kritiske rolle fysiske signaler i at lede celle morfologi og funktion. For eksempel effekten af ​​væv elasticitet på celle funktion er et stort område af mechanobiology forskning, fordi væv stivhed modulerer med sygdom, udvikling og skade. Statiske vævsbaseret efterligne materialer eller materialer, der ikke kan ændre stivhed, når celler er belagt, er hovedsagelig anvendes til at undersøge virkningerne af væv stivhed på cellefunktioner. Mens oplysninger indsamlet fra statiske undersøgelser er værdifulde, disse undersøgelser er ikke udtryk for den dynamiske karakter af den cellulære mikromiljø in vivo. For bedre at imødegå konsekvenserne af den dynamiske stivhed på celle funktion, har vi udviklet en DNA-tværbundet polyacrylamid hydrogel-system (DNA geler). I modsætning til andre dynamiske substrater DNA geler har evnen til at øge eller mindske stivhed efter fremstilling uden stimuli. DNA-geler består af DNA crossltrykfarver, der polymeriseres i en polyacrylamid rygrad. Tilføjelse og fjernelse af tværbindinger via levering af enkeltstrenget DNA tillader tidsmæssige, rumlige og reversibel kontrol gel elasticitet. Vi har vist i tidligere rapporter, at dynamisk graduering af DNA gel elasticitet påvirker fibroblast og neuron adfærd. I denne rapport og video, giver vi en skematisk, der beskriver DNA-gel tværbin- mekanismer og trin-for-trin instruktioner om forberedelse DNA geler.

Introduction

Statiske og dynamiske substrater er to kategorier af biomaterialer, som blev udviklet til at studere virkningerne af vævets elasticitet eller stivhed på cellefunktion. Faste substrater er i stand til at ændre deres fysiske egenskaber, efter at de er fremstillet og / eller når cellerne udplades. Polyacrylamid (PA) geler var de første to-dimensionale, statiske substrater, der blev syntetiseret til mechanobiology undersøgelser ^5,17. PA geler er nemt at forberede, billig, alsidig og kan fremstilles med en bred vifte af elasticitetsmoduler. Selvom disse tekniske fordele gør PA geler anvendes en fælles substrat, statiske substrater er ikke udtryk for den dynamiske karakter af den ekstracellulære matrix (ECM) og omgivende cellulære miljø in vivo. For eksempel ECM undergår stivhed ændringer som følge af skade, udvikling eller sygdom. Dynamiske substrater er derfor begunstiget som væv-efterligne substrat modeller i mechanobiology undersøgelser <sup> 22,24,25.

Talrige syntetisk, har naturlige, to-dimensionelle, tre-dimensionelle, statiske og dynamiske biomaterialer blevet udviklet til at efterligne væv stivhed ^{1,3,6,16,23,26.} Nogle dynamiske substrater kræver varme, UV, elektrisk strøm, ioner og pH-ændringer for at ændre deres mekaniske egenskaber ^{2,4,7,8,12,15,16,} men disse stimuli kan begrænse hydrogel bio-ansøgning. DNA-tværbundet polyacrylamid hydrogeler (DNA geler) er dynamiske todimensionale elastiske substrater. DNA-tværbindinger mulighed for tidsmæssige, rumlige og reversibel modulering af DNA-gel-stivhed ved tilsætning af enkeltstrenget DNA (ssDNA) til medier eller puffer ^{9-11,13,14,18,21.} I modsætning til de førnævnte dynamiske geler hvor stimuli ansøgt om graduering af elasticitet, DNA geler stole på udbredelsen af ​​anvendt ssDNA til ændring af elasticitet. Derfor øvre gel overfladen, hvor celler dyrkes, er det første område moduleres fordi satsen of elasticitet modulation afhængig af gelen tykkelse.

DNA-geler svarer til deres PA gel kolleger i, at de har en polyacrylamid rygrad, men de bis-acrylamid tværbindinger er erstattet med tværbindinger sammensat af DNA (Figur 1). To ssDNAs (SA1 og SA2) hybridiserer med en tværbinder streng (L2) for at gøre op DNA tværbindingerne af gelen. SA1 og SA2 har forskellige sekvenser, som både indeholder et Acrydite modifikation ved 5'ende for effektiv inkorporering i PA-netværket. Til fremstilling af geler, SA1 og SA2 er individuelt polymeriseres til et PA-rygrad og efterfølgende den polymeriserede SA1 og SA2 blandes sammen. L2, tværbinderen tilsættes til SA1 og SA2 blanding. L2 basesekvens er komplementær til både SA1 og SA2-sekvenser og L2 hybridiserer med SA1 plus SA2 at danne DNA tværbindingerne. Indledende DNA gel elasticitet bestemmes af både L2 koncentrationer og tværbinding (tabel 1 </strong>, og 2). DNA-geler, der indeholder lige støkiometriske mængder af L2, SA1 og SA2 er de stiveste geler fordi SA1 og SA2 er 100% tværbundet ved L2 (betegnet som 100% geler). Lavere koncentrationer af L2 resulterer i en lavere procentdel af DNA-tværbinding og derfor, blødere DNA geler. Geler så lave som 50% tværbundet (betegnet som 50% geler) er blevet konstrueret ^9-11.

Figur 1. DNA-gel-tværbinding og uncrosslinking skematisk ^{9-11,13,14,18,21} Trin 1:. SA1 (rød) og SA2 (blå) er individuelt polymeriseres i en polyacrylamid rygrad (sort). Efter polymerisering er SA1 og SA2 polymeriserede løsninger blandet sammen. Trin 2: L2 (grøn) tilsættes, og hybridiserer med SA1 plus SA2 at danne tværbindinger i gelen. Trin 3: R2 hybridiserer med than fodfæste L2. Trin 4: fodfæste hybridisering af R2 fremdriftsmiddel unzipping L2 fra SA1 og SA2.

I modsætning PA geler kan DNA geler stivne og blødgøre efter syntese. Derfor kan celler dyrket på DNA-geler underkastes dynamiske stivhed ændringer. For at afstive celle-klæbende geler, kan L2 sættes til dyrkningsmediet af lave procentvise geler til at øge procentdelen af ​​tværbindinger. At blødgøre celle-klæbende geler, kan L2 fjernes for at sænke den procentdel af tværbindinger ^10,13,21. L2 har en ekstra fodfæste sekvens ved 3'ende for at tillade L2 uncrosslink fra SA1 og SA2 (tabel 1). Fjernelse af L2 opnås ved hybridisering af en tilbageførsel streng kaldet R2. R2 er komplementær til den fulde længde af L2 og hybridiserer først med L2 fodfæste. Fodfæste hybridisering fremdriftsmiddel unzipping L2 fra SA1 og SA2, hvilket eliminerer krydsbinding og reducerer gelen stivhed.

I denne rapport ogvideo, trin-for-trin instruktioner om tilberedning af afstivende og blødgørende DNA geler. Mens 100% og 80% Gel præparater er beskrevet, kan denne protokol skræddersys til at skabe DNA-geler af andre indledende og afsluttende tværbundne procenter. I almindelighed er 100% og 80% geler fremstilles, immobiliseret på dækglas, funktionaliseret og podet med celler. L2 sættes til mediet af 80% geler og R2 sættes til mediet på 100% geler, 48 timer efter udpladning. Tilføjelsen af ​​L2 til medier stivner 80% geler til 100% tværbundet, hvorimod tilsætning af R2 til medier blødgør 100% geler til 80% tværbundet. Afstivede geler er udpeget som 80 → 100% geler og blødgjort geler er betegnet som 100 → 80% geler i teksten. Til kontrol eller statiske geler, ssDNA bestående af Ts eller som leveres til et andet sæt af 100% og 80% geler. Efter mindst to dage efter elasticitet graduering kan celler behandlet og analyseret.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within-page = "altid"> DNA-tværbinding # Af baser Sekvens (fodfæste) Ændring Smeltetemperaturen (T _m ° C) Kommentarer 5 '→ 3' Design 1 SA1 10 GCA FTT TTG C 5'Acrydite 34.9 SA2 10 GTC AGA ATG A 5'Acrydite 23.6 L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 En 10 bp fodfæste sekvens er inkluderet. R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 er et supplement til L2 Design 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5'Acrydite 46,9 SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5'Acrydite 40.2 L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65,9 En 12 bp-sekvens fodfæste er inkluderet. R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT KAG A 65,9 R2 er et supplement til L2 Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5'Acrydite 55 SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5'Acrydite 56.6 L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA FTT CCG T 68,8 Fodfæste er ikke inkluderet. Kontrol Kontrol 20-40 AAA AAA (osv), eller TTT TTT (mm)

Tabel 1. Base sekvenser for ssDNA ^{9-11,13,14,18,21.} Cellulær og mekaniske undersøgelser har udnyttet flere different tværbindinger motiver til at generere DNA-geler med en række statiske og dynamiske mekaniske egenskaber. Parametrene moduleret i krydsbindinger design er basesekvens og sekvens længde eller tværbinde længde. Fed og kursiv skrifttyper illustrerer baseparring mellem SA1 og L2 og mellem SA2 og L2.

	Design
	1			2			3
Acrylamid Koncentration (%)	10			10			10	4
SA1 plus SA2 hybridiseret til L2 (% tværbundet)	50	80	100	50	80	100	100	100
<strong> Elasticitet (kPa Mean ± SEM)	6,6 ± 0,6	17,1 ± 0,8	29,8 ± 2,5	5,85 ± 0,62	12,67 ± 1,33	22,88 ± 2,77	25,2 ± 0,5	10,4 ± 0,6

Tabel 2. Youngs modul (E) af DNA-geler ^{9-11,13,14,18,21.} Akrylamid koncentration crosslink procent og crosslink længde kan moduleres i DNA-geler. Design 1, 2 og 3 har 20, 28, og 40 bp tværbindinger længder hhv. 100% geler til alle designs har lignende moduler indikerer crosslink længde påvirker ikke gel elasticitet. Men variationer i acrylamid koncentration ændre DNA-gel-elasticitet.

Protocol

BEMÆRK: Hele protokol fra gelfremstillingen til celle behandlingen tager mindst seks dage. Estimeret tid til forberedelse gel er 8 timer plus en O / N inkubation. Estimeret tid for gel immobilisering og DNA udglødning er 8 timer plus en O / N skylningstrin. Estimeret tid for gel funktionalisering er 2 timer. Tid til celleudpladning og vækst er afhængig af kultur art og anvendelse, men et minimum på fire dage er påkrævet. 1. Fremstilling af DNA Gels BEMÆRK: …

Representative Results

Forud for vores undersøgelser blev celle-ECM interaktioner observeret på statiske kompatible biomaterialer eller irreversible og ensrettede dynamiske substrater. Disse substrater ikke nøjagtigt afspejler den dynamiske karakter af den cellulære mikromiljø. Vores arbejde flytter de eksisterende tekniske paradigmer ved at give en mere fysiologisk model til at studere celle-ECM interaktioner på blødgøring og afstivende dynamiske biomaterialer. I tidligere undersøgelser, vi analyserede virkningerne af dynamiske subs…

Discussion

Evnen af ​​DNA-geler til at blødgøre eller stivne før og efter celleadhæsion gør dem til en ideel model for at undersøge den rolle, dynamisk væv stivhed cellefunktion. Alle tre motiver er blevet anvendt i mekaniske og biologiske undersøgelser. Men alle tre motiver har lignende elasticitet på forskellige tværbindinger procenter angiver tværbinder længde påvirker ikke DNA-gel-elasticitet (tabel 2). I modsætning hertil acrylamid fusion påvirker elasticitet. Disse mønstre kan variere i t…

Materials

ssDNA	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium			Any brand.
100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com	T9285
10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	93290	TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	BP14021	Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	A3678	Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	T9281	Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12-mm diameter round coverglass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com	12-545-82
				Norland optical adhesive 72	Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com	NOA72
24-well tissue culture plate			Any brand.
				Microcentrifuge tubes			Any brand.
Sulfo-SANPAH	ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com	C111 or 22589	Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37°C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	P6407	Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I	Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com	13813	Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 X 60 cover glass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	12-544-G
Positive-displacement pipette	Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com	F148504
Heat block	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	11-718
UV light source			Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer			Any brand.
Nitrogen gas	GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/	NI 5.0UH-R