Summary
प्रोटोकॉल विवरण दूसरी हार्मोनिक पैदा नैनोकणों के साथ इन विट्रो लेबलिंग मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रदान की जाती हैं. बहु photon माइक्रोस्कोपी और हृदय समूहों में उनके भेदभाव से hESC जांच के लिए तरीके भी प्रस्तुत कर रहे हैं.
Abstract
इस कल्पना की प्रयोग में, प्रोटोकॉल विवरण दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी नैनोकणों (HNPs) के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो लेबलिंग (hESC) के लिए प्रदान की जाती हैं. उत्तरार्द्ध हाल ही में बहु फोटॉन इमेजिंग के लिए जैविक नमूने लेबलिंग के लिए शुरू की जांच की एक नई परिवार हैं. HNPs उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर कोई प्रतिबंध के साथ दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी के nonlinear ऑप्टिकल प्रक्रिया द्वारा उत्तेजना प्रकाश की आवृत्ति को दोगुना करने में सक्षम हैं.
बहु फोटान (लंबी अवधि हवा तरल संस्कृतियों के रूप में बनाए रखा) हृदय समूहों में hESC भेदभाव के तरीके के आधार पर विस्तार से प्रस्तुत कर रहे हैं. विशेष रूप से, 3 डी में हृदय ऊतक पिटाई की 3 डी निगरानी के दौरान अलग HNPs की तीव्र दूसरी हार्मोनिक (एसएच) के उत्सर्जन को अधिकतम करने के बारे में सबूत दिखाया गया है. 3 डी विस्थापन पैटर्न को पुनः प्राप्त करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवियों का विश्लेषण भी विस्तृत है.
Introduction
Nonlinear माइक्रोस्कोपी प्रणाली, अपने निहित तीन आयामी सेक्शनिंग क्षमताओं के लिए धन्यवाद, तेजी से लगभग अवरक्त में दो photon अवशोषण बैंड के साथ फोटो स्थिर fluorophores के लिए मांग शुरू हो रहा है. केवल वर्ष के पिछले कुछ में, प्रतिदीप्ति आधारित लेबल (रंजक, क्वांटम डॉट्स, ऊपर से परिवर्तित नैनोकणों), एक अलग इमेजिंग पद्धति लेबल के रूप में स्वाभाविक nonlinear नैनोकणों के एक उपन्यास परिवार के उपयोग का शोषण किया गया है, यानी के विकास के पूरक हैं विशेष रूप से बहु photon माइक्रोस्कोपी के लिए विकसित किया गया है जो हार्मोनिक नैनोकणों (HNPs). अकार्बनिक noncentrosymmetric क्रिस्टल के आधार पर ये लेबल, उत्तेजना आवृत्ति की एसएच पैदा ऑप्टिकल विपरीत डालती: निकट अवरक्त स्पंदित उत्तेजना प्रकाश का एक अंश में कनवर्ट करके उदाहरण के लिए दिखाई नीले प्रकाश में (λ = 800 एनएम) (λ / 2 = 400 एनएम) . हाल के दिनों में कई लेखकों लोहा iodate फे (आईओ सहित विभिन्न सामग्रियों का परीक्षण किया
इस कल्पना की प्रयोग में, प्रोटोकॉल विवरण unfunctionalized HNPs साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो लेबलिंग (hESC) के लिए प्रदान की जाती हैं. कोलाइडयन निलंबन के संश्लेषण और तैयारी पिछले एक प्रकाशन में और उसमें संदर्भ 16 में विस्तृत है और इस काम के दायरे से परे है. (लंबी अवधि हवा तरल संस्कृतियों के रूप में बनाए रखा) हृदय समूहों में बहु photon माइक्रोस्कोपी और उनके भेदभाव से hESC जांच के लिए तरीके में प्रस्तुत कर रहे हैं. मानव ईएससी निलंबन में कॉलोनी के टुकड़े की ईबी गठन के द्वारा या चित्र 1 ए में सचित्र के रूप में, वैकल्पिक रूप से, Aggrewell प्लेट का उपयोग ईबीएस में एकल कक्षों के एकत्रीकरण के लिए मजबूर या तो दो अलग अलग तरीकों, में तथाकथित embryoid निकायों (ईबीएस) के भीतर अंतर करने के लिए जाने जा सकते हैं . polytetrafluoroethylene पर हृदय कोशिकाओं के समूहों पिटाई संवर्धन (PTFE) झरझरा फिल्टर कारकोंआगे की पढ़ाई (कार्रवाई क्षमता के उदाहरण के लिए electrophysiological माप) के लिए अपने लंबी अवधि के रखरखाव ilitates.
स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की उत्तेजना स्रोत HNPs की दूसरी हार्मोनिक इमेजिंग प्रदर्शन करने की जरूरत सत्ता शिखर तक पहुंचने के लिए (नमूना पर 300 FSEC से छोटी एक नाड़ी की अवधि के साथ) ultrashort दालों देने में सक्षम होना चाहिए. उदाहरण के लिए, इमेजिंग के लिए सबसे आम उपयोग FSEC स्रोत tunable तिवारी हैं: नीलम लेज़रों. नीलमणि पंप अवरक्त ऑप्टिकल पैरामीट्रिक Oscillators: वैकल्पिक रूप से, अन्य ultrafast पराबैंगनीकिरण उदाहरण अर्बियम आयन 17, क्रोम forsterite 18 या तिवारी के लिए नियोजित किया जा सकता है. माइक्रोस्कोप अधिमानतः एक नहीं बल्कि उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य के साथ सुसज्जित किया जा सकता है. बहुत महत्वपूर्ण, पिछले माप, और उद्देश्य बदल दिया जाता है हर समय के लिए, यह काम पर लेजर पल्स पूर्व कंप्रेसर की सेटिंग्स को अनुकूलित करके सेट अप (लेंस) में फैलाव उपस्थित कम करने के लिए अनिवार्य हैचुनाव की तरंग दैर्ध्य. प्रोटोकॉल में विस्तृत इस प्रक्रिया, लेजर पल्स फोकल हवाई जहाज़ पर सीमित अवधि को बदलने (यानी कम से कम संभव के रूप में) करने के लिए संभव के रूप में बंद है और नमूना nonlinear प्रतिक्रिया है कि अधिकतम सुनिश्चित करता है.
प्रोटोकॉल के अंत में वर्णित छवि विश्लेषण के लक्ष्य की पहचान करने और हृदय समूहों पिटाई की लयबद्ध संकुचन के साथ जुड़े 3 डी HNPs आंदोलनों में ट्रैक करने के लिए है. छवि विमान में ट्रैकिंग नैनोकणों बस लगातार फिल्म फ्रेम में अपने पदों की पहचान के द्वारा एहसास हो रहा है. अक्षीय आंदोलन पर जानकारी निकालने के लिए, अक्षीय विस्थापन के एक समारोह के रूप में nonlinear तीव्रता प्रतिक्रिया की पूर्व अंशांकन अनिवार्य है. लंबी अवधि के माप, नमूना अक्षीय स्थिति के एक सक्रिय interferometric नियंत्रण के लिए ध्यान दें कि थर्मल और / या यांत्रिक drifts की उपस्थिति में अंशांकन वक्र की वैधता बनाए रखने के लिए आवश्यक है.
Trac को यहां इस्तेमाल HNPsसमुच्चय के भीतर ई पिटाई कोशिकाओं niobate पोटेशियम ऑक्साइड (KNbO 3) पर आधारित हैं, लेकिन अन्य उपलब्ध nonlinear nanomaterials के Staedler एट अल 16 के काम में विस्तार से समीक्षा कर रहे हैं.
अब तक की जांच की nanomaterials के अधिकांश के nonlinear ऑप्टिकल क्षमता बहुत तुलना कर रहे हैं. KNbO 3 के लिए चुनाव अनिवार्य रूप से कोलाइडयन समाधान का अच्छा स्थिरता और यहां तक कि काफी उच्च एकाग्रता और लंबे प्रदर्शनी बार 16 में कई मानव कोशिका लाइनों पर परीक्षण अपनी अच्छी biocompatibility, से प्रेरित था.
इस कार्य के लिए नियोजित nanomaterial की नवीनता को देखते हुए, फ्लोरोसेंट / luminescent जैव मार्करों की तुलना में HNPs की मुख्य विशेषताओं लेखकों द्वारा एहसास एक छोटी मूल कंप्यूटर वीडियो एनीमेशन में दिखाया गया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. संस्कृति और मानव ईएससी के विस्तार
- तैयार करें नॉकआउट DMEM युक्त (प्रधानमंत्री कहा जाता है) सेल प्रसार मध्यम 20% नॉकआउट सीरम, 1% सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1% एल glutamine 200 मिमी, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 3.5 μl β-mercaptoethanol के साथ पूरक.
- 8 मिलीग्राम प्रधानमंत्री माध्यम में मानव ईएससी (hESC) पिघलना और DMSO के पूरक ठंड मध्यम त्यागने के लिए 115 XG पर उन्हें 5 मिनट अपकेंद्रित्र.
- (केवल 24 घंटे ऊष्मायन) विगलन पर apoptosis को रोकने और सेल अस्तित्व में सुधार करने के लिए 10 मिमी रॉक अवरोध करनेवाला युक्त PM माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- Pluripotency के रखरखाव के लिए वांछित एकाग्रता (4-10 एनजी / एमएल) में प्रधानमंत्री को बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) जोड़ें.
- पहले से / 2 सेमी 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में चढ़ाया फीडर कोशिकाओं चमड़ी विकिरणित मानव पर hESC (γHFF) (चित्रा 1 ए), थाली.
- जब आवश्यक सी के अंश हटाने,, मध्यम दैनिक परिवर्तन औरolonies एक लम्बी तेजी से कटौती पाश्चर पिपेट का उपयोग आकांक्षा से अलग करने के लिए शुरू.
- Enzymatically एक सप्ताह बीतने कालोनियों बार:
- मध्यम निकालें और 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कालोनियों धो लो.
- पीबीएस निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 10 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल पर गर्म collagenase चतुर्थ की अच्छी तरह से प्रति 0.5 मिलीलीटर के साथ उन्हें सेते हैं.
- 2 मिलीलीटर 3 मिनट के लिए 115 XG पर नए प्रधानमंत्री और अपकेंद्रित्र में कॉलोनी टुकड़े ले लीजिए.
- वैकल्पिक रूप से, कालोनियों scraping द्वारा यंत्रवत् passaged जा सकता है:
- मध्यम निकालें और 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कालोनियों धो लो.
- मैन्युअल StemPro EZPassage रोलर खुरचनी उपकरण (चित्रा 1 बी) का उपयोग कालोनियों परिमार्जन.
- कॉलोनी टुकड़े ले लीजिए और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 115 XG पर 3 मिनट के लिए फिर अपकेंद्रित्र.
- ΓHFF पर या प्लेट टुकड़े embryoid निकायों (ईबीएस) में भेदभाव के लिए उन्हें प्रक्रिया.
2. मानव ईएससी भेदभावप्रोटोकॉल
- तैयार करें नॉकआउट DMEM का उपयोग भेदभाव मध्यम (डीएम) 2% HyClone सीरम, 1.0% सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1.0% एल glutamine 200 मिमी, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 3.5 μl β-mercaptoethanol के साथ पूरक.
- मध्यम निकालें और 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कालोनियों धो लो.
- निलंबन में कॉलोनी के टुकड़े की ईबी गठन:
- पीबीएस निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 10 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल पर गर्म collagenase चतुर्थ की अच्छी तरह से प्रति 0.5 मिलीलीटर के साथ उन्हें सेते हैं.
- 2 मिलीलीटर 3 मिनट के लिए 115 XG पर नए डीएम और अपकेंद्रित्र में कॉलोनी टुकड़े ले लीजिए.
- 4 दिन (चित्रा 1C) के लिए अल्ट्रा कम लगाव 6 अच्छी तरह प्लेटें (अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर) में निलंबन में संस्कृति उन्हें.
- लीजिए और 0.1% जिलेटिन लेपित 24 अच्छी तरह प्लेटें (लगभग 3 ईबीएस / अच्छी तरह से) (चित्रा -1) पर नवगठित ईबीएस थाली.
- वैकल्पिक रूप से, Aggrewell प्लेट का उपयोग ईबीएस में एकल कक्षों का एकत्रीकरण मजबूर:
- निकालें पीबीएस औरAccutase (0.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) का उपयोग एकल कक्षों में कालोनियों को अलग कर देना.
- 1.2 x 10 6 / एमएल पर डीएम में अपकेंद्रित्र और resuspend कोशिकाओं.
- 1 दिन (चित्रा 1 बी ') के लिए Aggrewell चैम्बर प्रति 2 मिलीलीटर जोड़ें.
- नवगठित ईबीएस (चित्रा 1C ') लीजिए और 0.1% जिलेटिन लेपित 24 अच्छी तरह प्लेटें (लगभग 3 ईबीएस / अच्छी तरह से) पर उन्हें थाली.
- Cardiomyocytes (15-30 दिन) के समूहों पिटाई की उपस्थिति जब तक हर 2-3 दिनों डीएम बदलें.
HNPs साथ क्लस्टर और लेबल पिटाई की 3. हवा तरल 3 डी संस्कृतियों
- पहचानें और मैन्युअल सामान्य रूप से एक लम्बी तेजी से कटौती पाश्चर पिपेट का उपयोग, संस्कृति के 2-4 सप्ताह बाद प्रदर्शित होने, पिटाई cardiomyocytes (चित्रा -1) के समूहों को काटना.
- 6 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 1F) पर रखा जाएगा कि डालने के प्रति जमा 4 PTFE फिल्टर.
- पूर्वी वायु कमान के शीर्ष पर डीएम माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ेंज अच्छी तरह से.
- प्रत्येक PTFE फिल्टर (चित्रा 1E) पर एक विच्छेदित पिटाई क्लस्टर, अधिकतम 4/well, प्लेट (चित्रा 1F ') प्रति यानी 24 समुच्चय जोड़ें.
- हर 2-3 दिनों डीएम मध्यम बदलें.
- समूहों लेबल करने के लिए, (170 माइक्रोन मोटी) की धड़कन क्लस्टर युक्त PTFE फिल्टर हटाने और 3.5 सेमी गिलास नीचे पकवान पर डाल दिया.
- 30 मिनट के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में HNP के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
4. गैर रैखिक ऑप्टिकल इमेजिंग
- नमूना तैयार. HNP लेबलिंग (3.6 कदम देखें), उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों के काम दूरी के साथ संगत एक 170 माइक्रोन मोटी गिलास नीचे पकवान पर PTFE फिल्टर पर पूरे फर्क जल्दी hEBs या (संकुचन उपस्थिति पर विच्छेदित) हृदय की धड़कन समूहों या तो स्थानांतरण के बाद. वैकल्पिक रूप से, गिलास नीचे पकवान 0.1% जिलेटिन के साथ पूर्व में लिपटे करने के लिए समूहों पिटाई का प्रत्यक्ष कोटिंग लागू होते हैं.
- एक पर स्थानांतरण नमूनेसभी में एक स्थिर तापमान, आर्द्रता और समय की विस्तारित अवधि में सीओ 2 नियंत्रण सुनिश्चित करने के चैम्बर incubating के साथ सुसज्जित खुर्दबीन.
- प्रारंभिक निरीक्षण, छवि के बाद सफेद रोशनी रोशनी के तहत व्यापक क्षेत्र इमेजिंग के माध्यम से नमूना आगे की जांच के लिए चयन किया जाएगा कि भेदभाव ईबीएस या सक्रिय पिटाई समूहों के भीतर ब्याज की संरचनाओं की पहचान करने के लिए.
- सेल NADH से autofluorescence और HNPs से एसएच एक साथ प्राप्त किया जा करने के लिए है, आणविक अवशोषण मैच के लिए एक छोटा लेजर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (यानी 720 एनएम) की स्थापना की. आधा उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर केंद्रित एक संकीर्ण बैंड पास वर्णक्रमीय फिल्टर का प्रयोग (यानी, λ = 360 ± 10 एनएम) एसएच पता लगाने के लिए, और एक दूसरे autofluorescence पता लगाने के लिए.
- सबसे पहले हृदय क्लस्टर के समग्र आकारिकी के पुनर्निर्माण और कई दिखाई HNP साथ क्लस्टर मात्रा भीतर एक छवि विमान का चयन करने के लिए एक तेजी से, कम संकल्प, तीन आयामी स्कैन प्रदर्शनएस.
- यदि आवश्यक हो, सबसे अच्छा नमूना है ऑप्टिकल गुण मिलान करने के लिए स्वतंत्र रूप से उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को बदलने या एक आईआर तरंगदैर्ध्य (यानी, 790 एनएम) के साथ ऊतकों में गहरी photobleaching, फोटो क्षति और छवि को बचने के लिए और (यानी, 395 एनएम तदनुसार दूसरी हार्मोनिक फिल्टर की जगह ). नमूना पर जमा HNPs की दूसरी हार्मोनिक संकेत अधिकतम द्वारा पसंद की कार्यप्रणाली तरंग दैर्ध्य में लेजर पल्स पूर्व कंप्रेसर की सेटिंग्स को अनुकूलित.
- वास्तविक समय में हृदय क्लस्टर संकुचन पर नजर रखने के लिए दो आयामी छवियों की उच्च गति के अधिग्रहण की अनुमति, ऐसे गुंजयमान मोड के रूप में सबसे तेजी से मोड में माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल स्कैनर स्थापित करने के लिए.
- जैसे छवि के विपरीत और अधिग्रहण की गति, के बीच सबसे अच्छा समझौता के रूप में सेटिंग्स चुनें:
- स्कैन औसत: 4
- पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय: 0.1 μsec
- छवि दर: प्रति सेकंड 3.75 फ्रेम (एफपीएस)
- लेजर शक्ति केन्द्र स्थान के अनुसार निकाला जाता हैize और स्कैनिंग गति. (उद्देश्य के द्वार पर मापा) 50 मेगावाट 0.1 μsec पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय और सेल व्यवहार्यता संरक्षण योजना एपीओ 20X NA 0.75 उद्देश्य के लिए एक विशिष्ट मूल्य है.
5. छवि विश्लेषण
- अक्षीय अंशांकन प्रक्रिया. एक नंगे सब्सट्रेट पर जमा एक भी HNP का चयन करें. एसएच तीव्रता अधिकतम करने के लिए (nanoparticle का अक्षीय स्थिति IE) फोकस समायोजित करें. HNP के एक समारोह के रूप में एसएच तीव्रता संबंधित अंशांकन वक्र प्राप्त करने के लिए खुर्दबीन मंच का अक्षीय स्थिति फोकल हवाई जहाज़ से ऑफसेट एक नियंत्रित तरीके में भिन्नता है. योजना एपीओ 20X NA 0.75 उद्देश्य के लिए इस अंशांकन प्रक्रिया के उत्पादन चित्रा 4C में सूचना दी है.
- सभी वीडियो फ्रेम में मौजूद HNPs चुने और उनके आवधिक आंदोलनों का निर्धारण. इस प्रक्रिया को आसानी से ब्याज की एक परिभाषित क्षेत्र में संकेत अधिकतम तीव्रता स्थानों के लिए मांग एक कस्टम कोड द्वारा उदाहरण के लिए, स्वचालित और किया जा सकता हैअलग फ्रेम के बीच में उन्हें जोड़ने (छवि प्रसंस्करण उपकरण बॉक्स के 'क्षेत्र सहारा' समारोह का उपयोग बी मैटलैब R2009 में लिखा एक उदाहरण कोड प्रस्तुत किया जाता है).
- गैर लगातार मिल HNPs 5.1 कदम पर स्थापित अंशांकन वक्र का उपयोग अक्षीय विस्थापन में अलग फ्रेम में उनकी तीव्रता modulations परिवर्तित करके, ऑप्टिकल अक्ष के साथ आगे बढ़ के साथ जुड़े बाहर के विमान विस्थापन की मात्रा का ठहराव का आकलन करें. इस प्रक्रिया अक्षीय आंदोलनों के लिए उपयोग देता है, लेकिन पूर्ण दिशा (ऊपर या नीचे) निर्धारित करने के लिए प्रयोग नहीं किया जा सकता है ध्यान दें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
पिछले confocal इमेजिंग द्वारा पिटाई गतिविधि का आकलन करने के लिए, PTFE फिल्टर के nonlinear ऑप्टिकल प्रतिक्रिया की सावधान लक्षण वर्णन उच्च एकाग्रता (1 मिलीग्राम / एमएल) में अकेले या HNPs की उपस्थिति में, या तो प्रदर्शन किया गया था. मैं) नंगे सब्सट्रेट दो फोटान उत्साहित प्रतिदीप्ति बहुत कमजोर है और प्रासंगिक जैविक नमूने मापने नहीं रोका जा सकता, और द्वितीय) पृथक HNPs से एसएच उत्सर्जन आसानी से महामारी जांच मोड में सब्सट्रेट के माध्यम से इमेजिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है: यह है कि यह सुनिश्चित किया गया था (चित्रा 2). उद्देश्य 3 डी विस्थापन की मात्रा का ठहराव के लिए संदर्भ नियंत्रण के लिए गया था.
चित्रा 3 में, HNP लेबल हृदय संरचनाओं और ईबीएस प्रदर्शित कर रहे हैं. गहन नीले एसएच स्पॉट पृथक HNP से स्टेम जबकि लाल (चित्रा 3), पीला (आंकड़े 3B और 3 सी) और, ग्रीन (चित्रा 3 डी) रंग, NADH autofluorescence के अनुरूप हैं. यह पुलिस के लिए दिलचस्प हैक्वांटम डॉट्स की तरह या ऊपर रूपांतरण नैनोकणों अन्य नैनोकणों आधारित विधियों, की तुलना में इस तकनीक को और अपेक्षाकृत विरल लेबलिंग द्वारा प्राप्त बहुत अच्छा ऑप्टिकल विपरीत बाहर int. अध्ययन में मौजूद है, बहुत तीव्र अलग लेबल होने कई स्वतंत्र व्यक्ति कण गतिविधियों पर नज़र रखने और स्टेम सेल व्युत्पन्न संरचनाओं के सामूहिक आंदोलन के पुनर्निर्माण के लिए फायदेमंद था.
चित्रा 3B एक HNP लेबल हृदय की धड़कन क्लस्टर का एक टुकड़ा देखने को दिखाता है. ऐसी 3 डी संरचनाओं तो इस मामले में, एनपी गति को हल करने के लिए उच्च अधिग्रहण की गति की दर बनाए रखने के लिए मूवी 1 रिपोर्ट में. सेल HNP कुल में संकुचन पैटर्न पर नजर रखने के लिए उच्च गति से दर्ज किया जा सकता है, समग्र अधिग्रहण संवेदनशीलता पर्याप्त नहीं था HNPs से एसएच उत्सर्जन के साथ सेल autofluorescence रिकॉर्डिंग के लिए.
छवि विश्लेषण के आवेदन आद्य की धारा 5 में वर्णितफिल्म फ्रेम के कलाकारों की टुकड़ी के लिए लागू कर्नल व्यक्ति HNP मोशन (दिशा, विमान और बाहर के विमान विस्थापन, आवृत्ति) के बारे में जानकारी निकालने में सक्षम बनाता है. इस विश्लेषण (चित्रा 4) के परिणाम में और बाहर के विमान गति (फूरियर 4B चित्रा में परिणत देखें) के लिए एक ही हृदय क्लस्टर के भीतर, आवृत्ति स्थिर है और विस्थापन कुछ micrometers के आदेश के हैं, जो इंगित करता है (चित्रा -4 ए में पांच एनपीएस की अनुकरणीय विस्थापन का संकेत तीर की लंबाई दोलनों की अधिक से अधिक बढ़ाव के अनुरूप).
चित्रा 1. हृदय की धड़कन समूहों में hESC के भेदभाव और दूसरी हार्मोनिक इमेजिंग माइक्रोस्कोपी. Undifferentiate के लिए HNPs नैनोकणों के साथ लेबलिंगडी hESC कालोनियों (ए) 1) StemPro EZPassage उपकरण (बी) का उपयोग करते हुए छोटे टुकड़ों में कटौती और अनियमित ईबीएस (सी) के रूप में निलंबन में जाने, या 2) एकल कक्षों में अलग और Aggrewell प्रणाली (बी का उपयोग reclustered या तो थे ) ') नियमित ईबीएस (सी फार्म करने के लिए'. ईबीएस (सी या सी ') के दोनों प्रकार के निलंबन में 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे और तब जिलेटिन लेपित व्यंजन का पालन किया. Cardiomyocytes (डी) के समूहों बैरंग तो स्वयं हवा तरल 3 डी संस्कृतियों (एफ और एफ ') की अनुमति देने के लिए सम्मिलित करता है पर जमा PTFE फिल्टर पर एक छुरी और सुसंस्कृत (ई) का उपयोग विच्छेदित किए गए. (पैनलों एक के लिए स्केल सलाखों, बी, बी' , सी और सी ': 100 मीटर, पैनल डी और ई के लिए:. 250 माइक्रोन) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
अकेले PTFE फिल्टर का चित्रा 2. PTFE सब्सट्रेट ऑप्टिकल लक्षण वर्णन. (ए) उज्ज्वल क्षेत्र छवि. इस पर नियंत्रण के माप (13 मेगावाट) के लिए आवेदन किया बल्कि उच्च लेजर तीव्रता की तुलना में एक कमजोर प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करता है जो PTFE फिल्टर, (बी) दो photon छवि. (सी और डी) नंगे सब्सट्रेट करने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता में HNPs युक्त एक बूंद पानी को जोड़ने के बाद, उनके एसएच उत्सर्जन आसानी से अपेक्षाकृत कम लेजर तीव्रता (2 मेगावाट) में फिल्टर के माध्यम से हासिल किया जा सकता है. डी में, फिल्टर पर फैल नैनोकणों के एक 3 डी छवि दिखाया गया है. (स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
HNP की चित्रा 3. Multiphoton इमेजिंग. हृदय संरचनाओं और ईबीएस लेबल (ए) एक मार क्लस्टर के दो photon प्रतिदीप्ति संकेत लाल रंग में प्रदर्शित किया जाता है और HNPs से एसएच संकेत नीले रंग में दिखाया गया है. रंग अलग वर्णक्रमीय फिल्टर से लैस चार nondescanned photomultipliers द्वारा मापा तीव्रता के अनुरूप हैं. (ब्लू 395 ± 11 एनएम, हरी 485 ± 20 एनएम, पीला 531 ± 40 एनएम, और लाल 607 ± 70 एनएम). यह क्लस्टर 720 एनएम और 8.8 मेगावाट का एक मतलब सत्ता के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक 10X उद्देश्य से PTFE झरझरा फिल्टर के माध्यम से सीधे उतारी थी. (बी) एक z ढेर से निकाले एक HNP लेबल हृदय संरचना का एक टुकड़ा देखें. (सी) एक EB PTFE के माध्यम से imaged (ए, बी और सी के लिए स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन). एक apoch का उपयोग Z-स्कैन से खंगाला HNPs साथ लेबल एक ईबी (डी) एक 3 डी छवि,romatic 40X NA 1.25 पानी विसर्जन उद्देश्य (पैमाने पर पट्टी: 50 माइक्रोन). HNPs अच्छी तरह से आंदोलन विश्लेषण की अनुमति, पूरे ईबी और हृदय क्लस्टर चारों ओर फैले हुए हैं.
चित्रा 4. पिटाई क्लस्टर और में विमान HNPs विस्थापन (काले रंग में दिखाया गया है एसएच संकेत) के vectorial विश्लेषण की फिल्म (ए) व्यक्ति के फ्रेम. तीर की लंबाई दोलनों की अधिक से अधिक बढ़ाव के अनुरूप हैं. (बी) फूरियर एक ही हृदय क्लस्टर के भीतर, आवृत्ति के लिए लगातार दिखा रहा है कि एनपीएस दोलनों के बदलने में (काला लाइन) और मोशन (नारंगी बिंदीदार रेखा) के विमान से बाहर और 0.4 हर्ट्ज से मेल खाती है. अक्षीय विस्थापन में HNP तीव्रता में परिवर्तित किया जाता है (सी) अंशांकन वक्र (prot की धारा 5 देखेंocol). सर्किलों: प्रयोगात्मक datapoints.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
स्टेम सेल अनुसंधान के लिए नैनो का आवेदन एक अपेक्षाकृत नया है, लेकिन तेजी से विस्तार क्षेत्र है. इस विषय पर विभिन्न समीक्षा लेख से कहा, नैनोकणों के उपयोग से कम नहीं रचना की, प्रोटीन और जीन के intracellular वितरण करने के लिए, (इन विट्रो और इन विवो दोनों में) ट्रैकिंग सेल से लेकर विभिन्न अनुसंधान कार्यों को पूरा करने के लिए लागू किया जा सकता है विशिष्ट भेदभाव की तरजीही उत्तेजना / निषेध के लिए biomimetic सेलुलर वातावरण 19,20 रास्ते. अवरक्त उत्तेजना उपयोग करने की संभावना आधारित तकनीक प्रतिदीप्ति के संबंध में पैठ बढ़ा गहराई की ओर जाता है, हालांकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण, ऑप्टिकल ट्रैकिंग और करने के लिए सीमित है; ऑप्टिकल इमेजिंग पूरे शरीर को बढ़ाया नहीं जा सकता और इसलिए चुंबकीय पहचान 21 से पूरित किया जाना चाहिए. पिछला प्रकाशित काम कई दृष्टिकोण में, हृदय सेल समूहों की संरचना और आंदोलन का आकलन करने से पता चलाफ्लोरोसेंट रंजक 22, क्वांटम डॉट्स 23,24 द्वारा समेत लेबलिंग, सुपर समचुंबक लौह ऑक्साइड 25 नैनोकणों, और ऊपर रूपांतरण फ्लोरोसेंट कणों 26-28. इन nanoprobes के संबंध में HNPs के फायदे समय की विस्तारित अवधि में वृद्धि हुई, इमेजिंग प्रवेश, autofluorescence के लिए सम्मान के साथ विपरीत वृद्धि के लिए तरंगदैर्ध्य tunability अधिक विरंजन के अभाव के साथ जुड़े रहे हैं. इस दृष्टिकोण से प्राप्त किया जाता है कि अजीब विरल सेल लेबलिंग (यानी चित्रा 3 डी में हम एक 100 माइक्रोन पक्ष क्यूब में लगभग 160 एनपीएस गिनती) बहुत अच्छी तरह से उच्च स्थानिक में 3 डी मानव ईएससी व्युत्पन्न हृदय समूहों में सेल संकुचन का पता लगाने के लिए अनुकूल निकला संकल्प.
nanomaterial का चुनाव खूंटी में लिपटे KNbO 3 तक सीमित नहीं है, लेकिन संभवत: अन्य functionaliti शामिल कर सकते हैं जो noncentrosymmetric क्रिस्टल संरचनाओं, प्रदर्शित नैनोकणों के एक अमीर परिवार शामिल कर सकते हैंतों (चुंबकीय रेडियोधर्मी) मल्टी मॉडल का पता लगाने की इजाजत दी. इसके अलावा, इस तरह के खूंटी में लिपटे HNPs आगे विशेष रूप से चुनिंदा विशेष सेल subpopulations को लक्षित करने के क्रम में epitopes या बंधनकारी प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित किया क्रियाशील किया जा सकता है. दूसरी ओर, यहां प्रस्तावित इमेजिंग दृष्टिकोण एक ultrafast लेजर स्रोत से लैस एक खुर्दबीन स्कैनिंग की आवश्यकता है. इस काम से परिकल्पित किया जा सकता है एक प्राकृतिक अनुवर्ती विस्तारित अवधि में प्रतिरोपित कोशिकाओं के समावेश और कार्यक्षमता का पालन करने के लिए इन विट्रो में और आगे देशी ऊतकों में 3 डी biomaterials और मचान संरचनाओं में लेबल की कोशिकाओं के एकीकरण की निगरानी कर रहा है.
फिल्टर संदूषण का जोखिम के बिना समर्थन वापस उनके डालने पर बहाल किया जा सकता है के रूप में 3 डी समुच्चय असर PTFE फिल्टर का उपयोग करने का एक लाभ यह हमारे मामले में, के रूप में, दिनों और हफ्तों में कई मापन प्रदर्शन करने की संभावना है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, PTFE फिल्टर भी कार्रवाई बर्तन का दोहराव आकलन सक्षमबहु इलेक्ट्रोड सरणियों का उपयोग entials.
लगभग अवरक्त में बहु - फोटान उत्तेजना के लिए कोशिका क्षति थ्रेसहोल्ड पहले König एट अल 29 से कम से कम 1 TW / 2 सेमी करने के लिए निर्धारित किया गया है. हमारे अध्ययन में, एक 0.75 एनए 20x उद्देश्य का उपयोग, लागू तीव्रता König के काम (80 μsec) की तुलना में TW / 2 सेमी (0.26 TW / 2 सेमी) और कम पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय (0.1 μsec) के तहत बनी हुई संभावना को सुनिश्चित करता है जिंदा और फर्क नमूना संरक्षित करने के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों यूरोपीय FP7 अनुसंधान परियोजना NAMDIATREAM (NMP4 ला 2010-246479, http://www.namdiatream.eu) और INTERREG चतुर्थ फ्रांस-स्विट्जरलैंड नाओमी परियोजना से आंशिक धन स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H.
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
