Harmonic Nanopartikler for regenerativ Forskning
Summary
Protokoll detaljer er gitt for in vitro merking humane embryonale stamceller med andre harmoniske generere nanopartikler. Metoder for hESC etterforskning av multi-foton mikroskopi og deres differensiering i hjerte klynger blir også presentert.
Abstract
I dette visualisert eksperiment, er protokoll detaljer fastsatt in vitro merking av humane embryonale stamceller (hESC) med andre harmoniske generasjons nanopartikler (HNPs). Sistnevnte er en ny familie av prober har nylig introdusert for merking av biologiske prøver for multi-foton-avbildning. HNPs er i stand til å doble frekvensen av eksiteringslys med ikke-lineær optisk prosess med andre harmonisk generering uten noen begrensning med hensyn til eksitasjonsbølgelengde.
Multi-foton baserte metoder for hESC differensiering inn i hjerte klynger (opprettholdt så lenge varige luft flytende kulturer) er presentert i detalj. Spesielt er bevis på hvordan å maksimere den intense andre harmoniske (SH) utslipp av isolerte HNPs under 3D overvåkning av slo hjertevev i 3D er vist. Analysen av de resulterende bildene for å hente 3D fortrengning mønstre er også beskrevet.
Introduction
Ikke-lineære mikroskopi systemer, takket være deres iboende tredimensjonale snitt evner, har i økende grad utløst etterspørselen etter fotostabile fluoroforene med to-foton absorpsjonsspor i nær-infrarødt. Bare i de siste par årene, for å utfylle utviklingen av fluorescens-basert etiketter (fargestoffer, kvanteprikker, opp-konvertering nanopartikler), en annen bildebehandling metodikken har vært å utnytte bruken av en roman familie av iboende lineære nanopartikler som etiketter, dvs. harmoniske nanopartikler (HNPs) som er spesielt utviklet for multi-foton mikroskopi. Disse etiketter, basert på uorganiske noncentrosymmetric krystaller, utøve optisk kontrast generere SH av eksitasjonsfrekvens: for eksempel ved å konvertere en brøkdel av nær infrarødt pulset eksitasjon lys (λ = 800 nm) til synlig blått lys (λ / 2 = 400 nm) . Flere forfattere i den siste tiden har testet forskjellige materialer, inkludert jern iodate Fe (IO <sub> 3) 3 1, kalium niobate (KNbO 3) 2, litium niobate (Linbo 3) 3, barium titanat (Batio 3) 4,5, kaliumfosfat titanyl (KTiOPO4, KTP) 6-8, og sinkoksid (ZnO ) 5,9,10. Sammenlignet med fluorescerende prober, HNPs besitter en rekke attraktive egenskaper, som for eksempel fullstendig fravær av bleking og blinker, smale utslipp band, eksitasjon bølgelengde tunability (fra ultrafiolett til infrarødt), orientering gjenfinning evne, og koherent optisk respons. Disse unike egenskapene har nylig blitt forklart i to omfattende gjennomgang papirer 11,12. Muligheten for å jobbe i det infrarøde spektral-regionen, noe som øker bildedybden ved å minimere spredning og absorpsjon, også drastisk begrenser utvalget foto degradering 13,14. Videre er uendelig foto stabilt signal garantert av HNPs gjør dem ideelle prober for langsiktig celle sporing, som jeger spesielt attraktivt for regenerativ medisin programmer 15.
I dette visualisert eksperiment, er protokoll detaljer fastsatt in vitro merking av humane embryonale stamceller (hESC) med unfunctionalized HNPs. Syntese og utarbeidelse av kolloidale suspensjoner er beskrevet i en tidligere publikasjon og i referansene der 16 og er utenfor rammen av dette arbeidet. Metoder for hESC etterforskning av multi-foton mikroskopi og deres differensiering i hjerte klynger (opprettholdt som langsiktig luft flytende kulturer) er presentert. Menneskelig ESC kan la å differensiere innenfor såkalte embryoid organer (EBS) på to forskjellige måter, enten ved EB dannelsen av koloni fragmenter i suspensjon eller, alternativt, tvunget aggregering av enkeltceller i EBS bruker Aggrewell plate, som illustrert i figur 1A . Dyrking slo klynger av hjerteceller på polytetrafluoretylen (PTFE) porøse filtre facilitates deres langsiktig vedlikehold for videre studier (for eksempel elektrofysiologiske målinger av aksjonspotensialer).
Den magnetisering kilden til scanning mikroskop bør være i stand til å levere Ultra pulser (med en pulsvarighet som er mindre enn 300 fsec på prøven) for å nå den toppeffekt som trengs for å utføre andre harmoniske avbildning av HNPs. For eksempel, den vanligste fsec-kilde brukes til bildebehandling er tunbare Ti: Sapphire lasere. Alternativt kan andre superraske lasere anvendes, for eksempel erbium ion 17, krom forsterite 18 eller Ti: safir pumpet infrarød optisk parametriske oscillatorer. Mikroskopet kan utstyres med et objektiv med fortrinnsvis en ganske høy numerisk apertur. Veldig viktig, før målinger, og hver gang målet er erstattet, er det obligatorisk å minimere spredning stede i set-up (linser) ved å optimalisere innstillingene for laserpuls pre-kompressor på arbeidsbølgelengde av valget. Denne prosedyren, som beskrevet i protokollen, sikrer at laserpulsen er så nær som mulig til den trans begrenset varighet (dvs. kortest mulig) ved fokalplanet og maksimerer prøven ikke-lineær respons.
Målet med bildeanalyse beskrevet på slutten av protokollen er å identifisere og spore i 3D HNPs bevegelser knyttet til de rytmiske sammentrekninger av juling hjerte klynger. Sporing nanopartikler i bildeplanet er rett og slett realisert ved å identifisere sine posisjoner i etterfølgende filmrammer. For å trekke ut informasjon for aksial bevegelse, er en forutgående kalibrering av den ikke-lineære responsen intensitet som en funksjon av aksial forskyvning obligatorisk. Legg merke til at for langtidsmåling, et aktivt interferometrisk kontroll av prøven aksiale stilling er nødvendig for å opprettholde gyldigheten av kalibreringskurven i nærvær av termiske og / eller mekaniske fonner.
De HNPs brukes her til trace slo celler i aggregater er basert på kalium niobate oksid (KNbO 3), men andre tilgjengelige ikke-lineære nanomaterialer er i arbeidet med Staedler et al 16 gjennomgått i detalj.
De ikke-lineære optiske effektiviteten av de fleste av nanomaterialer er undersøkt så langt er veldig sammenlignbare. Valget for KNbO tre ble i hovedsak motivert av god stabilitet av kolloidalt løsning og sin gode biokompatibilitet, testet på flere humane cellelinjer selv ved relativt høy konsentrasjon og lang utstillings ganger 16.
Gitt nyheten av nanomaterial ansatt for dette arbeidet, er de viktigste kjennetegnene på HNPs som sammenlignet med lysrør / selvlysende biomarkører vist i en kort opprinnelige datamaskinen videoanimasjon realisert av forfatterne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelsen av nanoteknologi til stamcelleforskning er et relativt nytt, men raskt voksende feltet. Som påpekt av flere oversiktsartikler om emnet, kan bruk av nanopartikler bli anvendt for å utføre forskjellige forskningsoppgaver, som strekker seg fra celle sporing (både in vitro og in vivo), for intracellulær levering av proteiner og gener, ikke minst på dannelsen av biomimetic cellulære miljøer for fortrinnsrett stimulering / hemming av spesifikke differensiering trasé 19,20. Fre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne delvis finansiering fra det europeiske FP7 Research Project NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) og INTERREG IV Frankrike-Sveits NAOMI prosjektet.
Materials
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37°C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | CFI Plan Fluor 10x | NA 0.30, WD 16 mm |
| CFI Plan Apo 20x | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40x | NA 1.25, WD 0.18mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
