Summary
Protokoll detaljer er gitt for in vitro merking humane embryonale stamceller med andre harmoniske generere nanopartikler. Metoder for hESC etterforskning av multi-foton mikroskopi og deres differensiering i hjerte klynger blir også presentert.
Abstract
I dette visualisert eksperiment, er protokoll detaljer fastsatt in vitro merking av humane embryonale stamceller (hESC) med andre harmoniske generasjons nanopartikler (HNPs). Sistnevnte er en ny familie av prober har nylig introdusert for merking av biologiske prøver for multi-foton-avbildning. HNPs er i stand til å doble frekvensen av eksiteringslys med ikke-lineær optisk prosess med andre harmonisk generering uten noen begrensning med hensyn til eksitasjonsbølgelengde.
Multi-foton baserte metoder for hESC differensiering inn i hjerte klynger (opprettholdt så lenge varige luft flytende kulturer) er presentert i detalj. Spesielt er bevis på hvordan å maksimere den intense andre harmoniske (SH) utslipp av isolerte HNPs under 3D overvåkning av slo hjertevev i 3D er vist. Analysen av de resulterende bildene for å hente 3D fortrengning mønstre er også beskrevet.
Introduction
Ikke-lineære mikroskopi systemer, takket være deres iboende tredimensjonale snitt evner, har i økende grad utløst etterspørselen etter fotostabile fluoroforene med to-foton absorpsjonsspor i nær-infrarødt. Bare i de siste par årene, for å utfylle utviklingen av fluorescens-basert etiketter (fargestoffer, kvanteprikker, opp-konvertering nanopartikler), en annen bildebehandling metodikken har vært å utnytte bruken av en roman familie av iboende lineære nanopartikler som etiketter, dvs. harmoniske nanopartikler (HNPs) som er spesielt utviklet for multi-foton mikroskopi. Disse etiketter, basert på uorganiske noncentrosymmetric krystaller, utøve optisk kontrast generere SH av eksitasjonsfrekvens: for eksempel ved å konvertere en brøkdel av nær infrarødt pulset eksitasjon lys (λ = 800 nm) til synlig blått lys (λ / 2 = 400 nm) . Flere forfattere i den siste tiden har testet forskjellige materialer, inkludert jern iodate Fe (IO
I dette visualisert eksperiment, er protokoll detaljer fastsatt in vitro merking av humane embryonale stamceller (hESC) med unfunctionalized HNPs. Syntese og utarbeidelse av kolloidale suspensjoner er beskrevet i en tidligere publikasjon og i referansene der 16 og er utenfor rammen av dette arbeidet. Metoder for hESC etterforskning av multi-foton mikroskopi og deres differensiering i hjerte klynger (opprettholdt som langsiktig luft flytende kulturer) er presentert. Menneskelig ESC kan la å differensiere innenfor såkalte embryoid organer (EBS) på to forskjellige måter, enten ved EB dannelsen av koloni fragmenter i suspensjon eller, alternativt, tvunget aggregering av enkeltceller i EBS bruker Aggrewell plate, som illustrert i figur 1A . Dyrking slo klynger av hjerteceller på polytetrafluoretylen (PTFE) porøse filtre facilitates deres langsiktig vedlikehold for videre studier (for eksempel elektrofysiologiske målinger av aksjonspotensialer).
Den magnetisering kilden til scanning mikroskop bør være i stand til å levere Ultra pulser (med en pulsvarighet som er mindre enn 300 fsec på prøven) for å nå den toppeffekt som trengs for å utføre andre harmoniske avbildning av HNPs. For eksempel, den vanligste fsec-kilde brukes til bildebehandling er tunbare Ti: Sapphire lasere. Alternativt kan andre superraske lasere anvendes, for eksempel erbium ion 17, krom forsterite 18 eller Ti: safir pumpet infrarød optisk parametriske oscillatorer. Mikroskopet kan utstyres med et objektiv med fortrinnsvis en ganske høy numerisk apertur. Veldig viktig, før målinger, og hver gang målet er erstattet, er det obligatorisk å minimere spredning stede i set-up (linser) ved å optimalisere innstillingene for laserpuls pre-kompressor på arbeidsbølgelengde av valget. Denne prosedyren, som beskrevet i protokollen, sikrer at laserpulsen er så nær som mulig til den trans begrenset varighet (dvs. kortest mulig) ved fokalplanet og maksimerer prøven ikke-lineær respons.
Målet med bildeanalyse beskrevet på slutten av protokollen er å identifisere og spore i 3D HNPs bevegelser knyttet til de rytmiske sammentrekninger av juling hjerte klynger. Sporing nanopartikler i bildeplanet er rett og slett realisert ved å identifisere sine posisjoner i etterfølgende filmrammer. For å trekke ut informasjon for aksial bevegelse, er en forutgående kalibrering av den ikke-lineære responsen intensitet som en funksjon av aksial forskyvning obligatorisk. Legg merke til at for langtidsmåling, et aktivt interferometrisk kontroll av prøven aksiale stilling er nødvendig for å opprettholde gyldigheten av kalibreringskurven i nærvær av termiske og / eller mekaniske fonner.
De HNPs brukes her til trace slo celler i aggregater er basert på kalium niobate oksid (KNbO 3), men andre tilgjengelige ikke-lineære nanomaterialer er i arbeidet med Staedler et al 16 gjennomgått i detalj.
De ikke-lineære optiske effektiviteten av de fleste av nanomaterialer er undersøkt så langt er veldig sammenlignbare. Valget for KNbO tre ble i hovedsak motivert av god stabilitet av kolloidalt løsning og sin gode biokompatibilitet, testet på flere humane cellelinjer selv ved relativt høy konsentrasjon og lang utstillings ganger 16.
Gitt nyheten av nanomaterial ansatt for dette arbeidet, er de viktigste kjennetegnene på HNPs som sammenlignet med lysrør / selvlysende biomarkører vist i en kort opprinnelige datamaskinen videoanimasjon realisert av forfatterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Kultur og Utvidelse av menneskelig ESC
- Klargjør celleforplantningsmedium (kalt PM) som inneholder Knockout DMEM supplert med 20% Knockout serum, 1% MEM ikke-essensielle aminosyrer, 1% L-glutamin 200 mM, 1% penicillin-streptomycin, og 3,5 pl β-mercaptoethanol.
- Tine menneskelig ESC (hESC) i 8 ml PM medium og sentrifuger dem 5 min ved 115 xg å forkaste DMSO-supplert frysemedium.
- Tilsett 1 ml av PM medium inneholdende 10 mM Rock inhibitor for å forhindre apoptose og forbedre celleoverlevelse etter tining (24 timers inkubasjon bare).
- Til basis fibroblast vekstfaktor (bFGF) til PM ved den ønskede konsentrasjon (4-10 ng / ml) for opprettholdelse av pluripotency.
- Plate den hESC på bestrålt human forhud mater celler (γHFF) (figur 1A), på forhånd belagt med en konsentrasjon på 2 x 10 4 celler / cm 2.
- Endre medium daglig, og, når det er nødvendig, fjerne deler av colonies begynner å differensiere ved aspirasjon ved hjelp av en langstrakt kraftig kuttet Pasteur pipette.
- En gang i uken, passage kolonier enzymatisk:
- Fjern medium og vaske kolonier med 2 ml PBS.
- Fjern PBS og inkubere dem med 0,5 ml per brønn av varm IV kollagenase ved 1 mg / ml i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Samle koloni fragmenter i 2 ml ny PM og sentrifuger ved 115 xg i 3 min.
- Alternativt kan kolonier være passaged mekanisk ved avskraping:
- Fjern medium og vaske kolonier med 2 ml PBS.
- Manuelt skrape kolonier bruker StemPro EZPassage roller skrape verktøy (Figur 1B).
- Samle koloni fragmenter og sentrifuger deretter i 3 min ved 115 x g for å fjerne supernatanten.
- Plate fragmenter på γHFF eller behandle dem for differensiering i embryoid organer (EBS).
2. Menneskelig ESC DifferensieringProtokoll
- Klargjør differensiering medium (DM) ved hjelp Knockout DMEM supplert med 2% Hyclone serum, 1,0% MEM ikke-essensielle aminosyrer, 1,0% L-glutamin 200 mM, 1% penicillin-streptomycin, 3,5 mL β-mercaptoethanol.
- Fjern medium og vaske kolonier med 2 ml PBS.
- EB dannelsen av koloni fragmenter i suspensjon:
- Fjern PBS og inkubere dem med 0,5 ml per brønn av varm IV kollagenase ved 1 mg / ml i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Samle koloni fragmenter i 2 ml ny DM og sentrifuger ved 115 xg i 3 min.
- Kultur dem i suspensjon i ultra-low vedlegg 6-brønn plater (2 ml per brønn) for 4 dager (figur 1C).
- Samle og plate de nydannede EBS på 0,1% gelatin-belagt 24-brønners plater (ca 3 EBS / vel) (figur 1D).
- Alternativt tvunget aggregering av enkeltceller i EBS bruker Aggrewell plate:
- Fjern PBS ogdissosiere kolonier inn i enkeltceller ved hjelp av accutase (0,5 ml / brønn).
- Sentrifuger og resuspender celler i DM på 1,2 x 10 6 / ml.
- Tilsett 2 ml pr Aggrewell kammer for 1 dag (figur 1B).
- Samle nydannede EBS (Figur 1C ') og plate dem på 0,1% gelatin-belagt 24-brønners plater (ca 3 EBS / brønn).
- Endre DM hver 2-3 dager før utseendet av å slå klynger av cardiomyocytes (15-30 dager).
Tre. Air-flytende 3D Kulturer av Slo Clusters og merking med HNPs
- Identifisere og manuelt dissekere klynger av juling cardiomyocytes (figur 1D), normalt vises etter 2-4 uker med kultur, ved hjelp av en langstrakt kraftig kuttet Pasteur pipette.
- Innskudds fire PTFE filtre per innsats som vil bli plassert på en 6-brønns plate (figur 1F).
- Tilsett 1 ml av DM medium på toppen av EACt godt.
- Legg en dissekert slo klynge på hver PTFE filter (figur 1E), maksimal 4/well, dvs. 24 aggregater per plate (figur 1F ').
- Endre DM medium hver 2-3 dager.
- Å merke klynger, fjerne PTFE filter inneholder juling klyngen og sette den på 3,5 cm glassbunn fatet (170 mikrometer tykk).
- Tilsett 1 ml av HNP ved en konsentrasjon på 50 ug / ml i 30 min.
4. Ikke-lineære optiske Imaging
- Prøveopparbeidelse. Etter HNP merking (se trinn 3.6), overføre enten hele differensierende tidlige hEBs eller hjerte juling klynger (dissekert på sammentrekning utseende) på PTFE filter over en 170 mikrometer tykt glass-bunn fatet kompatibel med arbeidsavstanden av høye numerisk apertur mål. Alternativt, påfør en direkte belegg for å slå klynger til glass-bunn fatet pre-belagt med 0,1% gelatin.
- Overfør prøvene til enalt-i-ett mikroskop utstyrt med rugende kammer sikrer stabil temperatur, fuktighet og CO 2 kontroll over lengre perioder.
- Etter innledende inspeksjon, image prøven via bredt felt bildebehandling under hvitt lys belysning for å identifisere strukturer av interesse innenfor differensierte EBS eller aktive juling klynger som vil bli valgt for ytterligere undersøkelser.
- Hvis celle autofluorescence fra NADH og SH fra HNPs må samtidig kjøpt, satt en kortere laser eksitasjon bølgelengde (dvs. 720 nm) for å matche den molekylære absorpsjon. Bruk en smal båndpass spektral filter sentrert til halve eksitasjon bølgelengde (dvs. λ = 360 ± 10 nm) for å oppdage SH, og en annen for å oppdage autofluorescence.
- Først utføre en rask, lav oppløsning, tredimensjonal skanning for å gjenoppbygge den generelle morfologi av hjerte klyngen og velg et bildeplan innenfor klyngen volum med flere synlige HNPs.
- Hvis det er nødvendig, endrer eksitasjonsbølgelengde fritt for å tilpasse prøven er optiske egenskaper eller for å unngå fotobleking, skader foto og bilde dypere inn i vev med en IR bølgelengde (dvs. 790 nm) og erstatte den andre harmoniske filter tilsvarende (dvs. 395 nm ). Optimal innstillingene av laserpulsen pre-kompressoren ved arbeidsbølgelengden av valget ved å maksimere den andre harmoniske signalet på HNPs avsatt på prøven.
- For å overvåke i sanntid hjerteklase sammentrekninger, sette mikroskop optisk skanner i raskeste modus som resonant modus, slik at høy hastighet erverv av to-dimensjonale bilder.
- Velg innstillingene som beste kompromiss mellom bildekontrast og oppkjøp hastighet, for eksempel:
- Scan gjennomsnitt: 4
- Pixel holdetid: 0,1 usekunder
- Bildehastigheten: 3,75 bilder per sekund (fps)
- Laser strømmen er justert i henhold til focal flekk size og skannehastigheten. 50 mW (målt ved inngangen til målet) er en typisk verdi for 0,1 usekunder pixel holdetid og Plan APO 20X NA 0.75 mål å bevare celle levedyktighet.
5. Bildeanalyse
- Axial kalibreringen. Velg en enkelt HNP deponert på et bart underlag. Juster fokus (dvs. den aksiale stillingen av nanopartikkel) for å maksimere SH intensitet. Varierer på en kontrollert måte den aksiale posisjonen til objektbord for å oppnå kalibreringskurve vedrørende SH intensitet som en funksjon av HNP forskjøvet fra fokalplanet. Utgangen av denne kalibreringen for Plan APO 20X NA 0.75 mål er rapportert i figur 4C.
- Velg HNPs stede i alle videorammer og bestemme sine periodiske bevegelser. Denne prosedyren kan enkelt automatiseres, for eksempel ved en egendefinert kode som søker etter signal maksimal intensitet flekker i et definert område av interesse ogkoble dem blant ulike rammer (et eksempel kode skrevet i Matlab R2009 b ved hjelp av funksjonen 'regionens props "av Image Processing Toolbox er presentert).
- Vurdere kvantifisering av ut-av-flyet forskyvninger, assosiert med ikke-kontinuerlig spor HNPs beveger seg langs den optiske aksen, ved å konvertere deres intensitet modulasjoner gjennom ulike rammer inn aksial forskyvning ved hjelp av kalibreringskurve etablert i trinn 5.1. Legg merke til at denne fremgangsmåten gir tilgang til aksiale bevegelser, men kan ikke brukes til å bestemme den absolutte retning (oppover eller nedover).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før vurderingen av det bankende aktivitet ved konfokal avbildning, ble en nøye karakterisering av ikke-lineær optisk respons av PTFE-filter utført, enten alene eller i nærvær av HNPs ved høy konsentrasjon (1 mg / ml). Det ble sørget for at: i) den nakne underlaget to-foton spent fluorescens er meget svak og kan ikke utelukke måle relevante biologiske prøver, og ii) SH utslipp fra isolerte HNPs lett kan anskaffes ved å tenke seg gjennom underlaget i epi-deteksjon modus (Figur 2). Målet var å ha referansekontroller for kvantifisering av 3D-forskyvning.
I figur 3 er HNP merkede hjertestrukturer og EBS vist. Den røde (figur 3A), gul (Tall 3B og 3C) og grønt (Figur 3D) farger viser til NADH autofluorescence, mens de intense blå SH flekker stammer fra isolerte HNP. Det er interessant å point ut svært god optisk kontrast oppnåelig ved denne teknikken og den relativt sparsomme merking i forhold til andre nanopartikler-baserte metoder, som kvanteprikker eller opp-konvertering nanopartikler. I denne studien, har svært intense isolerte etiketter var en fordel for sporing flere uavhengige enkeltpartikkelbevegelser og rekonstruere kollektiv bevegelse av stamcelle avledet strukturer.
Figur 3B viser en skive visning av en HNP-merket hjerte juling klynge. Slike 3D-strukturer kan deretter tas opp ved høy hastighet for å overvåke sammentrekning mønsteret i cellen-HNP aggregat som rapportert i filmen 1.. I dette tilfellet, for å opprettholde høy anskaffelses hastigheten for å løse NP bevegelse, den samlede anskaffelses sensitiviteten var tilstrekkelig for opptak av celle autofluorescence sammen med SH utslipp fra HNPs.
Anvendelsen av bildeanalyse beskrevet i kapittel 5 av protocol påføres ensemble av videobilder gjør at ekstrakt av informasjon om individuelle HNP bevegelse (retning, i-flyet og ut-av-flyet forskyvning, frekvens). Resultatet av denne analysen (figur 4) viser at, i løpet av den samme hjerte klynge, er frekvensen konstant for inn-og ut-av-plan bevegelse (se Fourier transform i figur 4B), og forskyvninger er av størrelsesorden noen få mikrometer (lengdene av pilene som viser de eksempelvise forskyvninger av fem NPS i figur 4A svarer til den maksimale forlengelse av de svingninger).
Figur 1. Differensiering av hESC i hjerte juling klynger og merking med HNPs nanopartikler for andre harmonisk avbildning mikroskopi. Undifferentiated hESC kolonier (A) var enten 1) kuttet ned i mindre biter ved hjelp av StemPro EZPassage verktøyet (B), og la i suspensjonen for å danne uregelmessige EBS (C), eller 2) dissosiert til enkeltceller og reclustered hjelp av Aggrewell systemet (B ') for dannelse av regelmessige EBS (C'). Begge typer EBS (C eller C ') ble dyrket i to dager i suspensjon, og deretter overholdt gelatin-belagt retter. Slo klynger av kardiomyocytter (D) ble deretter dissekert manuelt ved hjelp av en skalpell og kultivert på PTFE-filter (E) avsatt på innsatser for å tillate luft-væske 3D-kulturer (F og F '). (Skala stolper for panelene A, B, B' , C og C ': 100 mikrometer, for paneler D og E:. 250 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. PTFE substrat optisk karakterisering. (A) Lys feltbilde av PTFE-filter alene. (B) To-foton bilde av PTFE-filter, som viser en svak fluorescens i forhold til den ganske høye laserintensiteten anvendt for denne kontrollmåling (13 mW). (C og D) Etter å legge til bart substrat en dråpe vann som inneholder HNPs på 1 mg / ml konsentrasjon, deres SH utslipp lett kan anskaffes gjennom filteret på relativt lav laser intensitet (2 mW). I D-, er et 3D-bilde av nanopartikler spres på filteret vist. (skala barer: 50 mikrometer).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
Figur 3. Multiphoton avbildning av HNP merket kardiale strukturer og EBS. (A) De to-foton fluorescens signal om juling klynge vises i rødt og SH signal fra HNPs er vist i blått. Fargene tilsvarer intensiteten målt ved de fire nondescanned fotomultiplikatorer som er utstyrt med forskjellige spektrale filtre. (Blå 395 ± 11 nm, grønn 485 ± 20 nm, gul 531 ± 40 nm, og rød 607 ± 70 nm). Denne klyngen ble avbildet direkte inn i porøse PTFE-filter med et 10X objektiv med en eksitasjonsbølgelengde på 720 nm og en gjennomsnittlig effekt på 8,8 mW. (B) En skive visning av en HNP merket hjerte struktur hentet fra en z-stack. (C) En EB avbildes gjennom PTFE (skala stolper for A, B og C: 100 pm). (D) Et 3D-bilde av en EB merket med HNPs, rekonstruert fra z-skanner ved hjelp av en apochromatic 40X NA 1.25 vannimmersjonsobjektiv (skala bar: 50 mikrometer). De HNPs er godt spredt rundt hele EB og kardial klyngen, slik at bevegelsesanalyse.
Figur 4 (A) Individuell ramme av filmen med juling klyngen og vektoranalyse av in-plane HNPs forskyvninger (SH signal vises i svart).. Lengdene av pilene svarer til den maksimale forlengelse av oscillasjonene. (B) for Fourier-transformasjon av NPS oscillasjoner som viser at i løpet av den samme hjerte klynge, er frekvensen konstant for in-(sort linje) og ut-av-plan bevegelse (orange prikket linje), og korresponderer til 0,4 Hz. (C) Kalibrering kurve brukes til å konvertere HNP intensitet i aksial forskyvning (Se del 5 av protocol). Circles: eksperimentelle datapunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen av nanoteknologi til stamcelleforskning er et relativt nytt, men raskt voksende feltet. Som påpekt av flere oversiktsartikler om emnet, kan bruk av nanopartikler bli anvendt for å utføre forskjellige forskningsoppgaver, som strekker seg fra celle sporing (både in vitro og in vivo), for intracellulær levering av proteiner og gener, ikke minst på dannelsen av biomimetic cellulære miljøer for fortrinnsrett stimulering / hemming av spesifikke differensiering trasé 19,20. Fremgangsmåten som beskrives i denne protokollen er begrenset til optisk sporing, og selv om muligheten for å bruke infrarødt eksitasjon fører til økt penetrasjonsdybde i forhold til fluorescens baserte teknikker; optisk imaging kan ikke bli utvidet til hele kroppen og bør derfor suppleres med magnetisk deteksjon 21. Tidligere publiserte arbeid viste flere tilnærminger for å vurdere struktur og bevegelse av hjerte celle klynger, ikludert merking av fluorescerende fargestoffer 22, kvanteprikker 23,24, nanopartikler superparamagnetiske jernoksid 25, og opp-konvertering fluorescerende partikler 26-28. Fordelene med HNPs med hensyn til disse nanoprobes er assosiert med fravær av bleke over lengre tidsperioder, økt penetrasjons avbildning, bølgelengde tunability for økt kontrast i forhold til autofluorescens. Den særegne sparsom celle merking (dvs. i figur 3D teller vi ca 160 NPs i en 100 mikrometer side kube) som oppnås ved denne tilnærmingen viser seg å være svært godt egnet til å spore mobil sammentrekninger i 3D menneskelige ESC-avledet hjerte klynger med høy romlig oppløsning.
Valget av nanomaterial er ikke begrenset til PEG-belagte KNbO 3, men kan omfatte en rik familie av nanopartikler som viser noncentrosymmetric krystallstrukturer, som kan eventuelt inkludere andre functionalities (magnetisk, radioaktivt) slik at multi-modal deteksjon. Videre kan slike PEG-belagte HNPs videre bli funksjonalisert for å være spesifikt rettet mot epitoper eller bindingsproteiner, for å selektivt målrette spesifikke cellepopulasjoner. På den annen side er det tenkelig metode foreslås her, krever et scanning mikroskop utstyrt med en superlaserkilde. En naturlig oppfølging som kan tenkes fra dette arbeidet er å overvåke integreringen av merkede celler i 3D biomaterialer og stillaser strukturer in vitro og videre til egen vev, for å følge innlemmelse og funksjonaliteten til transplanterte cellene over lengre perioder.
En fordel med å bruke PTFE som bærer filtre 3D-aggregater, som i vårt tilfelle er muligheten for å utføre flere målinger over dager og uker, da filtrene kan gjenopprettes tilbake på sine støtter innsatsen uten risiko for forurensing. Enda viktigere, PTFE muliggjør også repeterende vurdering av handlings pottenentials ved hjelp av multi-elektrode arrays.
Cell skadeterskler for multi-foton eksitasjon i nær-infrarødt tidligere er fastslått til mindre enn 1 TW / cm 2 ved König et al 29. I vår undersøkelse, ved hjelp av en 0,75 NA 20X objektiv, forblir den anvendte intensitet under TW / cm 2 (0,26 TW / cm 2), og den korte pixel holdetid (0,1 usekunder) i forhold til Königs arbeid (80 usekunder) sikrer mulighet å bevare prøven i live og differensierende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne delvis finansiering fra det europeiske FP7 Research Project NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) og INTERREG IV Frankrike-Sveits NAOMI prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H.
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
