Harmonic Nanopartiklar för regenerativ forskning
Summary
Protokoll detaljer ges för in vitro-märkning av mänskliga embryonala stamceller med andra harmoniska genererar nanopartiklar. Metoder för hESC utredning av flera foton mikroskopi och deras differentiering i hjärt kluster presenteras också.
Abstract
I detta visualiseras experimentet protokoll uppgifter tillhandahålls för in vitro-märkning av mänskliga embryonala stamceller (hESC) med andra harmonisk generation nanopartiklar (HNPs). De senare är en ny familj av sönder som nyligen införts för att märka biologiska prover för multifotonavbildning. HNPs är kapabla att fördubbla frekvensen av excitationsljus genom den icke-linjära optiska processen för andra harmoniska generationen utan någon begränsning av den exciteringsvåglängden.
Multi-foton-baserade metoder för hESC differentiering till hjärt-kluster (hållna som långsiktiga luft vätska kulturer) presenteras i detalj. Framför allt är bevis på hur man maximerar den intensiva andra övertonen (SH) emission av isolerade HNPs under 3D-övervakning av att slå hjärtvävnad i 3D visas. Analysen av de resulterande bilderna för att hämta 3D förskjutningsmönster är också beskrivet.
Introduction
Nonlinear mikroskopi system, tack vare deras inneboende tredimensionella sektione kapacitet, har alltmer utlöst efterfrågan på fotostabila fluoroforer med två-photon absorptionsband i det nära infraröda. Endast i de senaste åren, som komplement till utvecklingen av fluorescensbaserade etiketter (färgämnen, kvantprickar, upp-konvertering av nanopartiklar), en annan avbildningsmetod har varit att utnyttja användningen av en ny familj av inneboende olinjära nanopartiklar som markörer, det vill säga harmoniska nanopartiklar (HNPs) som har utvecklats speciellt för multi-foton mikroskopi. Dessa etiketter, som bygger på oorganiska centrosymmetrisk kristaller, utöva optiska kontrast genererar SH av exciteringsfrekvens: till exempel genom att omvandla en del av nära infrarött pulsad excitation ljus (λ = 800 nm) till synligt blått ljus (λ / 2 = 400 nm) . Flera författare under den senaste tiden har testat olika material, bland annat järn iodate Fe (IO <sub> 3) 3 1, kalium niobate (KNbO 3) 2, litiumniobat (LiNbO 3) 3, bariumtitanat (BaTiOs 3) 4,5, kaliumtitanylfosfat (KTiOPO4, KTP) 6-8, och zinkoxid (ZnO ) 5,9,10. Jämfört med fluorescerande prober, HNPs besitter en rad attraktiva egenskaper, såsom total avsaknad av blekning och blinkar, smala emissionsband, excitation våglängd avstämbarhet (från ultraviolett till infrarött), orienteringshämtningskapacitet, och koherent optisk respons. Dessa unika egenskaper har nyligen förklarat i två omfattande översiktsartiklar 11,12. Möjligheten att arbeta i det infraröda spektralområdet, vilket ökar bilddjupet genom att minimera spridning och absorption, också drastiskt begränsar provfotonedbrytning 13,14. Dessutom, den oändligt fotostabila signal garanteras av HNPs gör dem idealiska prober för långsiktig cell tracking, som jagär särskilt lockande för regenerativ medicin applikationer 15.
I detta visualiseras experimentet protokoll uppgifter tillhandahålls för in vitro-märkning av mänskliga embryonala stamceller (hESC) med ofunktionaliserade HNPs. Det syntes och beredning av kolloidala suspensioner beskrivs i en tidigare publikation och referenser däri 16 och är utanför ramen för detta arbete. Metoder för hESC utredning av flera foton mikroskopi och deras differentiering i hjärt-kluster (hållna som långsiktiga luft vätska kulturer) presenteras. Human ESK kan låta att skilja inom så kallade embryoidkroppar (EBS) på två olika sätt, antingen genom EB bildandet av kolonifragment i suspension eller alternativt tvingas aggregering av enskilda celler i EBS använder Aggrewell plattan, som visas i figur 1 A . Odling slå kluster av hjärt-celler på polytetrafluoretylen (PTFE) porösa filter facilitates deras långsiktiga underhållet för fortsatta studier (t.ex. elektrofysiologiska mätningar av aktionspotentialer).
Den exciteringskälla av avsökningsmikroskop bör kunna avge ultrakorta pulser (med en pulsvaraktighet som är mindre än 300 fsec hos provet) för att uppnå den maximala kraft som behövs för att utföra andra harmoniska avbildning av HNPs. Till exempel den vanligaste fsec-källa som används för avbildning är avstämbara Ti: Sapphire lasrar. Alternativt kan andra ultrasnabba lasrar användas, till exempel erbium ion 17, krom forsterit 18 eller Ti: safir pumpas infraröda optiska parametriska oscillatorer. Mikroskopet kan utrustas med ett objektiv med företrädesvis en relativt hög numerisk apertur. Mycket viktigare, innan mätningar, och varje gång målet skall ersättas, är det obligatoriskt att minimera dispersionen närvarande i set-up (linser) genom att optimera inställningarna för laserpulsen pre-kompressor vid arbetselektrodenvåglängd av val. Detta förfarande, som beskrivs i protokollet, ser till att laserpulsen är så nära som möjligt till den trans begränsad varaktighet (dvs. kortast möjliga) på fokalplanet och maximerar prov olinjär respons.
Målet med bildanalysen beskrivs i slutet av protokollet är att identifiera och spåra i 3D HNPs rörelser i samband med de rytmiska sammandragningar av att slå hjärt kluster. Spårningsnanopartiklar i bildplanet är helt enkelt realiseras genom att identifiera sina positioner i successiva filmrutor. För att extrahera information om axiell rörelse, är en tidigare kalibrering av den icke-linjära intensitetssvaret som en funktion av axiell förskjutning obligatorisk. Observera att för långtidsmätningar, en aktiv interferometriskt reglering av provtagnings axiella läge krävs för att upprätthålla giltigheten av kalibreringskurvan i närvaro av termiska och / eller mekaniska drivor.
De HNPs används här för att trace slå celler i aggregat är baserade på kalium niobate oxid (KNbO 3), men andra tillgängliga olinjära nanomaterial granskas i detalj i arbetet med Staedler et al 16.
De icke-linjära optiska effektivitet på de flesta av de nanomaterial som undersökts hittills är mycket jämförbara. Valet för KNbO 3 var i huvudsak motiveras av den goda stabiliteten i kolloidal lösning och dess god biokompatibilitet, testats på flera humana cellinjer även vid relativt hög koncentration och långa utställningstider 16.
Med tanke på att nanomaterial används för detta arbete är de viktigaste egenskaperna för HNPs jämfört med fluorescerande / självlysande Biomarkörer visas i en kort ursprungliga datorn video animation realiseras av författarna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillämpningen av nanoteknik för att stamcellsforskning är en relativt ny men snabbt växande område. Som påpekats av olika översiktsartiklar i ämnet, kan tillämpas på användning av nanopartiklar för att utföra olika forskningsuppgifter, som sträcker sig från cell tracking (både in vitro och in vivo), till intracellulär leverans av proteiner och gener, inte minst skapandet av biomimetiska cellulära miljöer för företrädesrätt stimulering / hämning av specifik differentiering spridn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för den delfinansiering från Europeiska FP7 Research Project NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010 till 246.479, http://www.namdiatream.eu) och Interreg IV Frankrike-Schweiz NAOMI-projektet.
Materials
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37°C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | CFI Plan Fluor 10x | NA 0.30, WD 16 mm |
| CFI Plan Apo 20x | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40x | NA 1.25, WD 0.18mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
