Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller
Summary
Protokol bilgilerini, ikinci harmonik üreten nanopartiküller ile in vitro etiketleme insan embriyonik kök hücreleri için temin edilmiştir. Çoklu foton mikroskopi ve kalp kümeler halinde kendi farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler de sunulmuştur.
Abstract
Bu görsel deneyde, protokol bilgilerini ikinci harmonik üretimi nanopartiküller (HNPs) ile insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro etiketleme (HESC) için verilmektedir. İkincisi yakın çoklu foton görüntüleme için bir biyolojik numune etiketleme için sunulan prob yeni bir ailesidir. HNPs uyarma dalga boyunda herhangi bir sınırlama ile ikinci harmonik nesil doğrusal olmayan optik işlem ile uyarma ışık sıklığını iki katına yeteneğine sahiptir.
Çok foton (uzun vadeli hava-sıvı kültürler olarak tutulur) kalp kümeler halinde HESC farklılaşması için temel yöntemler detaylı olarak sunulmaktadır. Özellikle, 3D kalp dokusunu yenerek 3D izleme sırasında izole HNPs yoğun ikinci harmonik (SH) emisyonunu maksimize etmek için nasıl kanıt gösterilir. 3D deplasman desenleri almak için, elde edilen görüntülerin analizi de ayrıntılı.
Introduction
Doğrusal olmayan mikroskopi sistemleri, onların doğasında üç boyutlu kesit yetenekleri sayesinde, giderek yakın-kızılötesi iki-foton soğurma bantları ile foto-stabil floroforlar için talebi tetikledi. Sadece son yıllarda çift, flüoresan bazlı etiket (boyalar, kuantum noktaları, yukarıya dönüştürücü nanopartiküller), farklı bir görüntüleme yöntemi etiket gibi doğal doğrusal olmayan nanopartiküller yeni bir ailesinin kullanımını istismar edilmiş, yani gelişimini tamamlamak için özellikle çoklu foton mikroskopi için geliştirilmiştir harmonik nanopartiküller (HNPs). Inorganik noncentrosymmetric kristaller dayanan bu etiketler, uyarma frekans SH üreten optik kontrast uygulamayın: yakın kızılötesi darbeli uyarma ışık bir kısmını dönüştürerek, örneğin görünür mavi ışığa (λ = 800 nm) (λ / 2 = 400 nm) . Yakın geçmişte birkaç yazar demir iyodat Fe (IO dahil, farklı malzemeler test ettik <sub> 3) 3 1, potasyum niyobat (KNbO 3) 2, lityum niyobat (LiNbO 3) 3, baryum titanat (BaTiO 3) 4,5, potasyum titanil fosfat (KTiOPO4, KTP) 6-8, ve çinko oksit (ZnO ) 5,9,10. Flüoresan karşılaştırıldığında, HNPs gibi tam ağartma olmaması ve yanıp sönen, dar emisyon bantları, (kızılötesi için ultraviyole) uyarma dalga boyu Ayarlanabilirliğin, oryantasyon alma yeteneği, ve tutarlı optik cevap gibi çekici özellikler, bir dizi sahip. Bu benzersiz özellikleri son iki kapsamlı incelemesi gazetelerde 11,12 açıklanmıştır. Ayrıca, saçılması ve emilimini asgariye indirerek görüntüleme derinliğini artırır kızılötesi spektral bölgede, çalışan olasılığı büyük ölçüde örnek fotoğraf bozulmasını 13,14 sınırlar. Ayrıca, HNPs tarafından garanti sonsuz foto stabil sinyal uzun süreli cep izleme için ideal sondalar, yapar iözellikle rejeneratif tıp uygulamalarında 15 için itiraz var.
Bu görsel deneyde, protokol bilgilerini fonksiyonelleştirilmemiş HNPs ile insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro etiketleme (HESC) için verilmektedir. Koloid süspansiyonlarının sentezi ve hazırlık önceki yayında ve referanslar içinde 16 ayrıntılı olarak ve bu çalışmanın kapsamı dışındadır edilir. (Uzun vadeli hava-sıvı kültürleri olarak muhafaza) kalp kümeler halinde çoklu foton mikroskopi ve farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler sunulmaktadır. İnsan ESC süspansiyon içinde koloni fragmanlarının EB oluşumu ile ya da Şekil 1A 'da gösterildiği gibi, alternatif olarak, Aggrewell plaka kullanılarak EBS içine tek hücrelerin toplanmasını zorunlu ya da iki farklı şekillerde, sözde embriyoit organları (EBS) içinde ayırt etmek için izin olabilir . politetrafloretilenden kardiyak hücre kümeleri yenerek Culturing (PTFE) gözenekli filtreler facdaha fazla çalışmaları (aksiyon potansiyelleri örneğin elektrofizyolojik ölçümler) için uzun vadeli bakım ilitates.
Tarama mikroskobu uyarım kaynağı HNPs ikinci harmonik görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli pik güç ulaşmak için (numuneden 300 FSEC daha küçük bir darbe süresi ile) ultrashort bakliyat teslim etmek gerekir. Örneğin, görüntüleme için kullanılan en yaygın FSEC kaynak ayarlanabilir Ti vardır: Safir lazerler. Safir pompalanan kızılötesi optik parametrik osilatörler: Alternatif olarak, diğer ultra lazerler örneği erbyum iyonu 17, krom forsteritten 18 veya Ti için, istihdam edilebilir. Mikroskop tercihen oldukça yüksek bir sayısal diyafram ile bir objektif ile donatılmış olabilir. En önemlisi, önceki ölçümleri ve amaç değiştirildiği her zaman için, bu çalışma da lazer darbeli ön kompresör ayarlarını optimize ederek set-up (lens) 'de mevcut dispersiyon en aza indirmek için zorunludurseçim dalga boyu. Protokolde ayrıntılı Bu işlem, darbeli lazer odak düzlemi de sınırlı bir süre dönüşümü (örneğin, en kısa sürede) mümkün olduğu kadar yakın ve örnek doğrusal olmayan yanıtı maksimize sağlar.
Protokol sonunda anlatılan görüntü analizi amacı belirlemek ve kardiyak kümeleri dayak ritmik kasılmalar ilişkili 3D HNPs hareketleri takip etmektir. Görüntü düzleminde izleme nanopartiküller, sadece takip eden film dilimlerinde konumlarını belirleyerek gerçekleştirilir. Eksenel hareketi üzerine bilgi elde etmek için, eksenel yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak lineer olmayan bir şiddet tepkisinin bir ön kalibrasyon zorunludur. Uzun süreli ölçümler, örnek eksenel konumunun aktif interferometrik kontrolü için unutmayın termik ve / veya mekanik sürüklenir mevcudiyetinde kalibrasyon eğrisinin geçerliliği korumak için gereklidir.
Trac için burada kullanılan HNPsbirikintiler içinde e yenerek hücreleri potasyum niobat oksit (KNbO 3) dayalı, ancak mevcut diğer doğrusal olmayan nanomateryaller Staedler ark 16 çalışmalarında ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir.
Şimdiye kadar incelenen nanomalzemelerin çoğunun doğrusal olmayan optik verimleri çok benzer. KNbO 3 için seçim, esas olarak koloidal çözeltinin iyi stabilite ve hatta oldukça yüksek bir konsantrasyonda ve uzun zaman teşhir 16 birkaç insan hücre hatları üzerinde test onun iyi biyolojik uyumluluk, motive oldu.
Bu iş için kullanılan nanomaterial yenilik göz önüne alındığında, floresan / ışıldayan biyo-belirteçler kıyasla HNPs temel özellikleri yazarlar tarafından gerçekleştirilen bir kısa orijinal bilgisayar video animasyon gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kök hücre araştırmaları için nanoteknoloji uygulaması nispeten yeni ama hızla genişleyen bir alandır. Konuyla ilgili yorum eşyalar tarafından işaret edildiği gibi, nanopartiküllerin kullanımı azından oluşturma arasında proteinler ve genler hücre içi iletimi için, (in vitro ve hem de in vivo) izleme hücreden değişen, farklı araştırma görevleri yerine uygulanabilir Belirli farklılaşma tercihli stimülasyonu / engellenmesi için biomimetic hücresel ortamlar 19,20</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Avrupa FP7 Araştırma Projesi NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) ve INTERREG IV Fransa-İsviçre NAOMI projeden kısmi fon kabul etmek istiyorum.
Materials
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37°C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | CFI Plan Fluor 10x | NA 0.30, WD 16 mm |
| CFI Plan Apo 20x | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40x | NA 1.25, WD 0.18mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
